基于巨噬細胞自噬探討暢脈樂膠囊對動脈粥樣硬化大鼠斑塊穩(wěn)定性及凝血功能影響的機制

黃松雄 張玉琴 劉巧婷 李志 吳幫發(fā) 何洪金

(福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院,福建 福州 350003)

心腦血管疾病是全球第一大致死病因,已成為人類社會和國家的重要經(jīng)濟負擔,而動脈粥樣硬化是引發(fā)這些心腦血管疾病的病理基礎(chǔ),因此如何有效防治該病的發(fā)生、發(fā)展一直是臨床工作的重點之一〔1,2〕。動脈粥樣硬化的致病原因主要為脂代謝異常、大量的吸煙及飲酒、遺傳因素等,其標志性病變是斑塊的形成,研究表明,動脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定與否是導(dǎo)致心腦血管發(fā)病及死亡的關(guān)鍵原因,因此深入探討動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的機制有望成為心腦血管疾病防治的新方向〔3,4〕。近年來研究發(fā)現(xiàn),慢性炎癥反應(yīng)是不穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊形成的關(guān)鍵,而巨噬細胞作為機體重要的炎癥細胞在其中發(fā)揮了不可或缺的作用,其可通過吞噬脂滴形成泡沫細胞并在斑塊內(nèi)堆積,從而釋放細胞因子誘發(fā)炎癥反應(yīng),進而促進斑塊的形成并增加斑塊的不穩(wěn)定性,故如何降低巨噬細胞聚集已經(jīng)成為目前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的焦點之一〔5〕。而早有研究證實,巨噬細胞自噬具有抗動脈粥樣硬化作用,促進巨噬細胞自噬可以促進斑塊穩(wěn)定,減緩斑塊進展,因此探尋一種有效的手段促進巨噬細胞自噬就顯得尤為重要〔6〕。動脈粥樣硬化患者由于斑塊的形成及增多,會導(dǎo)致動脈血流動力學(xué)特性改變,從而造成機體凝血功能異常,進而影響機體纖溶功能及抗凝功能,加速血栓的形成,最終導(dǎo)致惡性循環(huán)的形成,因此了解患者凝血功能情況有利于臨床的診斷及治療〔7〕。目前,臨床上治療動脈粥樣硬化多采用他汀類調(diào)脂藥物等西醫(yī)治療,但其具有一定副作用,并且停藥后很容易反彈,中醫(yī)藥治療本病具有多靶點、多渠道、幾乎無副作用的優(yōu)點,且臨床療效已經(jīng)得到證實,故日益受到研究者重視〔8〕。暢脈樂膠囊是在中醫(yī)傳統(tǒng)理論指導(dǎo)下,結(jié)合現(xiàn)代藥理研究成果,由多種中藥研制而成,其中包括葛根、郁金、黃芪、丹參等藥材,在填精養(yǎng)血、破血逐瘀、散瘀止痛、抗動脈粥樣硬化等方面具有顯著療效〔9〕。因此,本文就基于巨噬細胞自噬探討暢脈樂膠囊對動脈粥樣硬化大鼠斑塊穩(wěn)定性及凝血功能影響的機制,以期為暢脈樂膠囊的療效提供客觀量化的標準,為臨床提供更多、更可靠的診療依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動物材料 選取廣州弗爾博生物科技有限公司提供的50只SPF級SD雄性大鼠〔合格證書為:SCXK(粵)2020-0009〕,體質(zhì)量200～250 g,大鼠單籠喂養(yǎng),室溫生長,模仿12 h晝夜交替,在常溫下進行適應(yīng)性喂養(yǎng)7 w,按照《實驗動物管理條例》規(guī)定進行實驗。

1.2實驗材料 暢脈樂膠囊(醫(yī)院自制,規(guī)格:0.35 g);維生素D3(貨號:YT63592,北京伊塔有限公司);蘇木素染液(貨號:H9627,美國Sigma公司);伊紅染液(貨號:AG1100～100 ml,上海吉至有限公司);光學(xué)顯微鏡(型號:CX-60,日本OLYMPUS公司);凝血檢測儀(貨號:STA-R Evolution,北京思塔高有限責任公司);4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色液(貨號:FT21949yy,上海梵態(tài)有限公司);透射電子顯微鏡(型號:LVEM5,深圳賽普思有限公司);改良油紅O染色液(貨號:SY2474,北京伊塔有限公司);細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(EMMPRIN)抗體(貨號:ATA28655,武漢益普有限公司);自噬相關(guān)蛋白螯合體(SQSTM)1抗體(貨號:PL0402596,深圳豪地華拓有限公司);微管相關(guān)蛋白1A/1B-輕鏈(LC)3抗體(貨號:bs-8878R,上海科敏生物科技有限公司);熒光顯微鏡(型號:Primo Star iLED,上海卡爾蔡司有限公司)。

1.3建模 隨機選取40只大鼠,禁食12 h后,給大鼠灌胃30萬IU/kg維生素D3、25 mg/kg尼古丁,10 h后再次給大鼠灌胃25 mg/kg尼古丁,同時每天按30 g/kg給大鼠喂養(yǎng)高脂飼料,喂養(yǎng)8 w后,隨機選擇5只大鼠并處死。取頸動脈作病理切片,動脈內(nèi)有陳舊斑塊、斑塊內(nèi)脂質(zhì)崩解、彈性纖維斷裂、纖維帽內(nèi)鈣鹽沉積,則視為建模成功。

1.4分組與給藥 隨機選取建模成功大鼠30只,將其隨機分為模型(MO)組,低劑量暢脈樂膠囊(LC)組,高劑量暢脈樂膠囊(HC)組,每組10只,未建模10只健康大鼠作為正常(CO)組,LC組灌胃5 mg/kg的暢脈樂膠囊,HC組灌胃15 mg/kg的暢脈樂膠囊,兩組均每天一次,治療28 d,CO組、MO組同期給予灌胃同體積生理鹽水。

1.5標本采集 實驗完成后,通過腹腔注射3%戊巴比妥將大鼠麻醉處死,并從主動脈采血,然后取主動脈組織,主動脈血在4 ℃、2 000 r/min條件下離心10 min,取上清液于無菌離心管中,在冰箱中密封保存,取部分血管組織剪碎置于離心管中以提取巨噬細胞,首先加入4型膠原酶使其終濃度為1 mg/ml,在37 ℃下,300 r/min的搖床上搖晃1 h后過濾離心,棄掉上清液,重懸后再次離心,棄掉上清液,重懸后在4 ℃下沉淀離心3次,取3次上清液,3次上清液混合后,4 ℃下離心5 min,棄掉上清液,再次重懸后將其小心鋪到25%～50%的細胞分離液(percoll)上方,每部分體積為4 ml,然后在室溫,2 000 r/min,降速調(diào)為1的條件下進行梯度離心20 min,離心后在25%與50%界限處的為巨噬細胞;剩余主動脈用4%的多聚甲醛溶液固定96 h后,用生理鹽水漂洗干凈,放入冰箱中密封保存。

1.6大鼠病理組織蘇木素-伊紅(HE)染色 取各組主動脈組織,進行多聚甲醛及梯度沉糖脫水、石蠟包埋、切片、烤片、二甲苯及梯度乙醇脫蠟、復(fù)水后,進行HE染色,染色完成后除去多余染液,進行脫水、二甲苯透明和中性樹膠封片處理,在光學(xué)顯微鏡下隨機選取3個視野進行組織病理學(xué)觀察。

1.7大鼠凝血功能檢測 取各組大鼠500 μl血清,用凝血檢測儀對凝血酶原時間(PT)、國際標準比率(INR)、血漿纖維蛋白原(FIB)含量進行檢測并記錄。

1.8油紅O染色法檢測巨噬細胞泡沫化情況 取各組大鼠巨噬細胞,4%多聚甲醛固定10 min 后,加入蒸餾水稍微沖洗,加入60%異丙醇浸泡30 s,加入改性油紅O染色溶液,密封15 min,加入60%異丙醇稍微清洗,去除染料溶液,將蒸餾水稍微清洗,蘇木素染色溶液保持2 min,加入磷酸鹽緩沖液(PBS)促進藍色,蒸餾水稍微清洗,甘油明膠密封,顯微鏡下觀察巨噬細胞泡沫,脂滴染紅,細胞核染藍。

1.9電鏡觀察巨噬細胞中脂滴及自噬體形成 取各組大鼠巨噬細胞,采用透射電子顯微鏡觀察其脂滴及自噬體的形成,實驗步驟需嚴格按照儀器說明書進行。

1.10免疫熒光法檢測巨噬細胞中EMMPRIN、SQSTM1、LC3的蛋白表達 取各組巨噬細胞,常規(guī)培養(yǎng)至細胞密度達80%～90%,將細胞消化接爬片,待細胞完全貼壁,吸除培養(yǎng)基,加入4%多聚甲醛進行細胞固定,室溫固定20 min,PBS洗滌3次,加入0.5% Triton X-100,室溫通透20 min,PBS洗滌3次,5%BSA封閉2 h,吸去封閉液,滴加稀釋的EMMPRIN、SQSTM1、LC3一抗(1∶200),4 ℃濕盒內(nèi)孵育過夜,PBS洗滌3次,滴加熒光素標記的二抗(1∶200),37 ℃室溫避光孵育1 h,PBS洗滌3次,滴加DAPI復(fù)染細胞核,避光孵育5 min,PBS輕洗細胞3次,用吸水紙吸干爬片上的液體,用含抗熒光淬滅劑的封片液封片,在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.11統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad Prism8.0進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組HE染色結(jié)果 CO組主動脈組織結(jié)構(gòu)正常完整且排列整齊,內(nèi)、中、外膜層清晰可見,分界清楚,可見數(shù)層彈力膜,未見泡沫細胞,且無明顯斑塊形成;MO組主動脈結(jié)構(gòu)紊亂,內(nèi)膜明顯增厚,可見脂質(zhì)斑塊彌漫及大量泡沫細胞和炎性細胞浸潤,并可見典型的不穩(wěn)定斑塊;與MO組比較,LC、HC組病理結(jié)構(gòu)明顯改善,主動脈可見典型的穩(wěn)定斑塊及較少的泡沫細胞,炎性細胞明顯減少,見圖1。與MO組比較,LC、HC組內(nèi)膜與中膜面積比顯著降低,斑塊穩(wěn)定性顯著升高(P<0.05);HC組上標指標顯著優(yōu)于LC組(P<0.05)。見表1。

圖1 各組肺組織(HE染色,×200)

2.2各組凝血功能結(jié)果 與CO組比較,MO組血清中PT、INR顯著降低(P<0.05),FIB顯著升高(P<0.05);與MO組比較LC、HC組血清中PT、INR顯著升高,FIB明顯降低(P<0.05),且HC組比LC組變化顯著(P<0.05),見表1。

表1 各組內(nèi)膜與中膜面積比、斑塊穩(wěn)定性凝血功能指標比較

2.3各組巨噬細胞中EMMPRIN、SQSTM1、LC3蛋白表達結(jié)果 與CO組比較,MO組巨噬細胞中EMMPRIN、SQSTM1蛋白表達顯著升高(P<0.05),LC3顯著降低(P<0.05);與MO組比較,LC組、HC組巨噬細胞中EMMPRIN、SQSTM1蛋白表達顯著降低(P<0.05),LC3顯著升高(P<0.05),且HC組比LC組變化顯著(P<0.05),見表2、圖2。

表2 各組巨噬細胞中EMMPRIN、SQSTM1、LC3蛋白表達

圖2 各組巨噬細胞中EMMPRIN、SQSTM1、LC3蛋白表達(免疫熒光染色,×400)

2.4各組巨噬細胞油紅O染色 CO組巨噬細胞染色較淡,未見巨噬細胞泡沫化及明顯脂滴顆粒,MO組巨噬細胞被染成紅色的區(qū)域數(shù)量明顯增加,可見巨噬細胞出現(xiàn)泡沫化,與MO組比較,LC組、HC組脂滴數(shù)量明顯減少,巨噬細胞泡沫化程度明顯減輕,見圖3。

圖3 各組巨噬細胞(油紅O染色,×200)

2.5各組巨噬細胞電鏡結(jié)果 與CO組相比,MO組脂滴數(shù)量明顯增多,自噬體數(shù)量明顯減少,與MO組相比,LC組、HC組脂滴數(shù)量明顯減少,自噬體數(shù)量明顯增多,且HC組比LC組變化明顯,見圖4。

圖4 電鏡觀察各組巨噬細胞(×800)

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn),暢脈樂膠囊對動脈粥樣硬化大鼠具有顯著療效,可顯著改善大鼠主動脈組織病理形態(tài),降低內(nèi)膜與中膜面積比并提高斑塊穩(wěn)定性,且高劑量效果更顯著。近年來研究發(fā)現(xiàn),動脈粥樣硬化引起的血管狹窄并不是急性心腦血管事件發(fā)生的主要因素,其斑塊發(fā)生破裂、脫落,使斑塊從“穩(wěn)定斑塊”向“不穩(wěn)定斑塊”轉(zhuǎn)變,從而引起的出血或形成血栓堵塞血管才是導(dǎo)致急性心腦血管疾病發(fā)生的關(guān)鍵因素,因此,如何提高斑塊穩(wěn)定性一直是臨床關(guān)注的焦點之一〔10〕。中醫(yī)認為,氣為血之帥,氣行則血行,氣虛則無力鼓動血行而瘀滯,或氣虛血虧,脈道艱澀使血行不暢而致血瘀,故動脈粥樣硬化早期多氣血虛而脈絡(luò)瘀滯不通為病,主要以補虛與祛邪相結(jié),采用扶正祛邪為主,活血祛痰解毒之法,或健脾補腎之法為輔的方法則來治療該病〔11〕。而暢脈樂膠囊是一種標本兼顧、攻補兼施的院內(nèi)中藥復(fù)合制劑,方中水蛭活血化瘀,丹參活血涼血,此二藥共助血脈通利以治其瘀阻不通,而郁金行氣解郁,何首烏補腎活血,黃芪益氣健脾,葛根舒筋通絡(luò),這四藥兼具行氣祛瘀,不傷而全攻補,共奏益氣活血,去瘀新功效,且臨床研究表明,其具有降血脂,抗動脈粥樣硬化的顯著療效〔12〕。對于動脈粥樣硬化大鼠,暢脈樂膠囊主要是通過標本同治、攻補兼施、益氣活血化瘀,來改善血管通透性、改善機體微循環(huán)、減少血栓的形成,從而加速血液運行,增加血流供應(yīng),進而促進血管內(nèi)皮細胞修復(fù)和新生、抑制血管壁的微血管新生、抑制血管平滑肌細胞增殖等,最終達到增加斑塊穩(wěn)定性,延緩動脈粥樣硬化病變發(fā)展的目的。謝勝偉等〔13〕研究表明,對于頸動脈粥樣硬化大鼠,暢脈樂膠囊具有顯著療效,可顯著降低三酰甘油、總膽固醇及低密度脂蛋白水平,并通過抑制Wnt信號通路來減輕頸動脈粥樣硬化程度,這與本文結(jié)果類似。

本文說明,暢脈樂膠囊可有效改善大鼠凝血功能。動脈粥樣硬化最常見的臨床癥狀之一就是凝血功能的改變,研究表明,凝血因素直接參與動脈血栓的形成過程,因此對其進行檢測可有效反映該病的臨床治療效果〔14〕。PT、INR、FIB是反映凝血功能的重要指標,因此檢測其水平的變化,可有效反映凝血功能障礙情況〔15〕。而對于動脈粥樣硬化大鼠暢脈樂膠囊主要是通過降低膽固醇及低密度脂蛋白等、抑制脂質(zhì)過氧化及自由基反應(yīng),來干擾外源性凝血系統(tǒng)的活性,抑制類肝素物質(zhì)分泌,從而降低血小板的黏附率、延長凝血時間,抑制凝血酶原向凝血酶轉(zhuǎn)化及纖維蛋白原向纖維蛋白轉(zhuǎn)變等,進而到達有效改善大鼠凝血功能的目的,最終減緩動脈粥樣斑塊形成。許磊等〔16〕研究發(fā)現(xiàn),給予腦梗死恢復(fù)期合并頸動脈粥樣硬化患者豁痰宣痹通脈方,可顯著改善PT、FIB等凝血功能指標,縮小斑塊面積,穩(wěn)定斑塊,這與本文結(jié)果類似。

本研究說明,暢脈樂膠囊可促進巨噬細胞自噬來提高動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性。在動脈粥樣硬化發(fā)生的初始階段,動脈血管內(nèi)皮受損,低密度脂蛋白進入血管內(nèi)并沉積氧化,血管內(nèi)膜中巨噬細胞攝取大量氧化型低密度脂蛋白后變成泡沫細胞,從而觸發(fā)血管炎癥反應(yīng),進而使斑塊內(nèi)炎癥反應(yīng)增加、出現(xiàn)壞死核心空洞等,斑塊破裂的可能性明顯增大,粥樣斑塊產(chǎn)生不穩(wěn)定性,最終受損破裂,形成血栓,誘發(fā)心腦血管疾病的發(fā)生,因此減少斑塊內(nèi)巨噬細胞堆積、抑制其釋放炎癥及細胞因子的能力可望成為治療的有效靶點〔17〕。研究表明,巨噬細胞自噬的激活在早期動脈粥樣硬化病變中起著抗動脈粥樣硬化的保護作用,但隨著病變進展,晚期斑塊巨噬細胞自噬活性逐漸降低,對脂質(zhì)的清除作用減弱,其抗動脈粥樣硬化作用逐漸降低,最終成為導(dǎo)致斑塊進展和斑塊不穩(wěn)定的重要因素,故促進巨噬細胞自噬對斑塊穩(wěn)定性至關(guān)重要〔18〕。而EMMPRIN是動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性相關(guān)蛋白,SQSTM1、LC3是目前在動脈粥樣硬化領(lǐng)域研究較多的自噬調(diào)節(jié)蛋白,其水平的變化可有效反映動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性及巨噬細胞自噬情況〔19〕。而對于動脈粥樣硬化大鼠,暢脈樂膠囊可能是通過抑制炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激反應(yīng)等,來調(diào)節(jié)巨噬細胞自噬相關(guān)蛋白的表達,促進巨噬細胞自噬,從而抑制巨噬細胞吞噬氧化型低密度脂蛋白,降低其泡沫化程度,進而促進泡沫細胞中脂質(zhì)的分解排出,有效清除膽固醇,減少基質(zhì)金屬蛋白酶表達、抑制EMMPRIN的蛋白表達,最終穩(wěn)定易損斑塊,抑制斑塊內(nèi)出血、潰瘍及斑塊脫落,達到改善疾病癥狀的目的。劉琴〔20〕研究發(fā)現(xiàn),小檗堿可顯著改善動脈粥樣硬化小鼠斑塊脆弱性,降低斑塊沉積,其機制可能與促進巨噬細胞自噬進而抑制炎性反應(yīng)有關(guān),這與本文結(jié)果類似。

綜上所述,暢脈樂膠囊可顯著改善動脈粥樣硬化大鼠斑塊穩(wěn)定性及凝血功能,其作用機制可能與促進巨噬細胞自噬有關(guān)。