RNA結合蛋白HuR調控lncRNA DLEU2促進食管鱗癌細胞增殖、侵襲的機制

王偉 何天樂 李揚 楊素清

(1邯鄲市第一醫院胸外科,河北 邯鄲 056000;2中國人民解放軍海軍軍醫大學2018級;3河北醫科大學第二醫院感控科)

食管鱗狀細胞癌(簡稱食管鱗癌)是我國食管癌的主要類型,其惡性程度較高,是嚴重威脅人類健康的腫瘤之一〔1〕。雖然近年來治療食管鱗癌的技術有了較大提升,但是其患者的5年生存率仍然較低,在20%以下〔2〕。人抗原(Hu)R也被稱為胚胎致死異常視覺蛋白(ELAVL)1,是RNA結合蛋白的一種,主要參與調控細胞的分化和應激反應。有研究〔3～5〕顯示,HuR在肺癌、胃癌、乳腺癌等腫瘤細胞中均呈現高表達,其上調表達對腫瘤細胞的發生發展有促進作用。然而,HuR在食管鱗癌中的研究非常匱乏。

目前已知的是HuR在食管鱗癌中表達升高,其下調表達可抑制其癌細胞增殖和轉移〔6〕,但是其具體的調節機制尚不明確。淋巴細胞白血病缺失基因(DLEU)2是長鏈非編碼RNA(lncRNA)的一種,已被證實在食管癌細胞中上調表達,其沉默后可抑制食管癌細胞的生物學行為〔7〕。此外,starbase軟件預測發現,DLEU2與HuR可能存在結合關系。因此,本研究分析HuR與DLEU2在食管鱗癌組織和細胞中的表達情況,并探討二者的作用關系及其對食管鱗癌細胞增殖、侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1組織與細胞來源 選取2019年10月至2021年7月在邯鄲市第一醫院接受食管鱗癌手術的患者24例,在手術中收集癌組織與其癌旁組織,立即放入液氮中速凍備用。參與本實驗的患者均簽署知情同意書,且本研究通過河北省邯鄲市第一醫院醫院倫理委員會許可。正常人食管鱗狀上皮細胞Het-1A及食管鱗癌細胞系KYSE30、KYSE70、KYSE270均由河南省工業微生物菌種工程技術研究中心提供。

1.2主要試劑與儀器 5周齡BALB/c裸小鼠購自賽業(固安)生物科技有限公司,許可證號為SYXK(冀)2021-005;HuR過表達載體及其對照空載體(pc-HuR/pcDNA)、HuR慢病毒干擾載體及其陰性對照(sh-HuR/sh-NC)、DLEU2小干擾RNA及其陰性對照(si-DLEU2/si-NC)由上海生工生物公司提供;DMEM培養基、Trizol由美國Sigma公司提供;Lipofectamime2000試劑由美國Invitrogen公司提供;2×SYBR Green PCR Mastermix試劑盒由北京索萊寶生物公司提供;CCK-8試劑盒由武漢菲恩生物科技有限公司提供;結晶紫由沈陽思諾達生物科技有限公司提供;Transwell小室由北京明陽科華生物科技有限公司提供;HuR一抗及辣根過氧化物酶(HRP)耦聯的二抗由美國Abcam公司提供;RNA免疫沉淀試劑盒由蘇州市賽德生物技術有限公司提供。CO2培養箱購自北京隆福佳生物科技有限公司;CFX Connect實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)儀購自美國Bio-Rad公司;酶標儀購自山東博科科學儀器有限公司;光學顯微鏡購自基恩士(中國)有限公司。

1.3細胞培養、轉染與分組 正常人食管鱗狀上皮細胞Het-1A及食管鱗癌細胞系KYSE30、KYSE70、KYSE270放置在含胎牛血清的DMEM培養基上,胎牛血清的體積分數為10%,于CO2培養箱中進行培養,溫度調整至37 ℃。利用Lipofectamime2000試劑對生長至對數期的KYSE30細胞進行轉染,并隨機分組為對照組(不轉染)、pcDNA組(轉染pcDNA)、pc-HuR組(轉染pc-HuR)、sh-NC組(轉染sh-NC)、sh-HuR組(轉染sh-HuR)、sh-HuR+si-NC組(轉染sh-HuR和si-NC)和sh-HuR+si-DLEU2組(轉染sh-HuR和si-DLEU2),將轉染后的各組細胞在培養箱中持續培養48 h,結束后收集細胞備用。

1.4qRT-PCR實驗 采用Trizol法提取食管鱗癌組織和細胞系中的總RNA,測定濃度后對其定量,按照逆轉錄試劑盒說明書的方法將其反轉錄為cDNA,并利用2×SYBR Green PCR Mastermix試劑盒配制反應體系,然后進行PCR擴增。反應結束后,使用2-ΔΔCt法分析HuR mRNA與DLEU2表達水平,β-actin為二者的內參基因。HuR的引物序列為:正向5′-GGGTGACATCGGGAGAACG-3′,反向5′-CTGAACAGGCTTCGTAACTCAT-3′;DLEU2正向5′-GGCGGCGGGTACTTATCTC-3′,反向5′-CCAGGGAAGGATGTAGCTG-TG-3′;β-actin正向5′-CCCGAGCCGTGTTTCCT-3′,反向5′-GTCCCAGTTGGTGACGATGC-3′。

1.5CCK-8法檢測KYSE30細胞活性 收集經過轉染的各組細胞,將其接種在96孔細胞板上,分別在培養至24、48、72 h時加入20 μl CCK-8試劑,2 h后采用酶標儀在450 nm處檢測其吸光度(OD)值。

1.6平板克隆形成實驗檢測KYSE30細胞增殖能力 將生長至對數期的KYSE30細胞接種在直徑為6 cm的圓形培養皿上,每個培養皿細胞數控制在103個,分別加入3 ml DMEM培養基,輕輕晃動培養基使細胞平均分布在培養皿上,每2 d更換1次培養基,2 w后棄去培養基,先固定10 min,然后用結晶紫染色,30 min后在顯微鏡下觀察并記錄克隆形成數目,以克隆形成數與接種細胞數的百分比代表克隆形成率。

1.7荷瘤裸鼠實驗觀察KYSE30細胞在體內腫瘤生長能力 將對照組、pcDNA組、pc-HuR組、sh-NC組、sh-HuR組、sh-HuR+si-NC組和sh-HuR+si-DLEU2組細胞胰蛋白酶化成單細胞懸液,重懸于濃度為2×106/150 μl KYSE30細胞中。將5周齡BALB/c裸小鼠置于無菌條件下,隨機分成7組,每組6只,分別于右側皮下注射細胞懸液150 μl。每隔7 d用卡尺測量腫瘤,腫瘤體積(mm3)=0.5×長×寬2。28 d后處死小鼠,解剖腫瘤并稱重。

1.8Transwell實驗檢測KYSE30細胞侵襲能力 實驗前首先將稀釋好的基質膠均勻鋪在Transwell小室的上層,然后將收集好的各組細胞進行重懸,細胞濃度調整為3×104個/ml,在上室加入細胞懸液100 μl,下室加入培養基650 μl,24 h后進行固定和染色,最后在光學顯微鏡下隨機挑選5個互不重疊的視野觀察細胞侵襲情況并記錄細胞侵襲數目。

1.9Western印跡檢測HuR蛋白表達 將各組KYSE30細胞裂解后提取其總蛋白,使用BCA試劑盒檢測其蛋白含量,然后取等量的蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,結束后進行轉膜和封閉,再加入HuR、β-actin抗體,稀釋比例為1∶1 000,次日加入HRP耦聯的二抗,繼續孵育1 h,最后加入電化學發光(ECL)試劑進行顯影,并用Quantity One Image軟件分析HuR蛋白印跡,以HuR條帶與β-actin的比值表示HuR蛋白表達水平。

1.10免疫沉淀(RIP)實驗分析HuR與DLEU2的結合關系 使用將KYSE30細胞使用RIP裂解液進行裂解,并與磁珠共同孵育,磁珠與陰性對照正常小鼠IgG或HuR抗體結合,將收集的磁珠復合物進行洗脫,然后提取免疫沉淀RNA,并用qRT-PCR檢測DLEU2水平,具體操作根據免疫沉淀試劑盒制造商說明書進行。

1.11統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行方差分析、Student-t檢驗。

2 結 果

2.1食管鱗癌組織和細胞系HuR與DLEU2表達水平 與癌旁組織或正常人食管鱗狀上皮細胞Het-1A相比,食管鱗癌組織和細胞系KYSE30、KYSE70、KYSE270中HuR mRNA和蛋白表達及DLEU2水平均明顯升高(P<0.05),見圖1、表1。由于KYSE30細胞中HuR mRNA和蛋白表達及DLEU2水平最高,故選擇KYSE30細胞進行后續實驗。

2.2HuR對KYSE30細胞增殖的影響 與對照組和pcDNA組比較,pc-HuR組KYSE30細胞中HuR蛋白表達明顯增加,48、72 h細胞活性明顯增強,克隆形成率顯著提高(P<0.05);與對照組和sh-NC組比較,sh-HuR組KYSE30細胞中HuR蛋白表達明顯減少,48、72 h細胞活性明顯減弱,克隆形成率顯著下降(P<0.05),見圖1、表2。

2.3HuR對KYSE30細胞侵襲的影響 pc-HuR組KYSE30細胞侵襲數明顯較pcDNA組多(P<0.05);而sh-HuR組KYSE30細胞侵襲數明顯比sh-NC組少(P<0.05),pcDNA組、sh-NC組與對照組細胞侵襲數差異不顯著(P>0.05),見表2、圖2。

2.4HuR對裸鼠皮下移植瘤生長的影響 與對照組和pcDNA組比較,pc-HuR組14、21、28 d腫瘤體積明顯增加,腫瘤重量顯著升高(P<0.05);與對照組和sh-NC組比較,sh-HuR組14、21、28 d的腫瘤體積明顯減小,腫瘤重量顯著降低(P<0.05),見表3。

表1 食管鱗癌組織和細胞中HuR mRNA和蛋白質DLEU2表達水平比較

表2 HuR對KYSE30細胞增殖、侵襲的影響

圖2 HuR對KYSE30細胞侵襲的影響(結晶紫染色,×200)

表3 HuR對裸鼠皮下移植瘤生長的影響

2.5HuR與DLEU2的相互作用關系 在KYSE30細胞中,HuR組DLEU2水平(6.54±1.16)明顯高于IgG組(0.23±0.02;t=13.322,P<0.05)。

2.6HuR通過調控DLEU2對KYSE30細胞增殖、侵襲的影響 與sh-HuR+si-NC組相比,sh-HuR+si-DLEU2組KYSE30細胞中DLEU2水平明顯降低,48、72 h細胞活性顯著下降,克隆形成率明顯降低,細胞侵襲數也明顯變少(P<0.05);與sh-HuR組相比,sh-HuR+si-NC組KYSE30細胞中DLEU2水平、8、72 h的細胞活性與克隆形成率、細胞侵襲數均無明顯改變(P>0.05),見圖3、表4。

圖3 各組KYSE30細胞侵襲(結晶紫染色,×200)

表4 HuR通過調控DLEU2對KYSE30細胞增殖、侵襲的影響

2.7HuR通過調控DLEU2對裸鼠皮下移植瘤生長的影響 與sh-HuR+si-NC組相比,sh-HuR+si-DLEU2組14、21、28 d的腫瘤體積明顯減小,腫瘤重量明顯下降(P<0.05);而sh-HuR組與sh-HuR+si-NC組以上指標無明顯差異(P>0.05),見表5。

表5 HuR通過調控DLEU2對裸鼠皮下移植瘤生長的影響

3 討 論

食管鱗癌屬于消化道腫瘤,由于早期癥狀不明顯和分子診斷標志物的缺乏,大部分患者發現時已到中晚期,可能錯過最佳治療時間,進而導致患者生存率下降。同時,癌細胞的易侵襲性和易轉移性是引起食管鱗癌患者術后復發的主要原因,也是導致患者低生存率的重要原因〔8〕。因此,明確食管鱗癌發病機制并尋找有效的治療靶點對食管鱗癌患者5年生存率的提高來說意義重大。

HuR是ELAV家族的成員之一,在多種細胞中均有表達,通過與靶基因mRNA的3'UTR端的ARE元件結合來穩定靶mRNA,進而調節細胞的生物學行為〔9〕。在結直腸癌〔10〕中,HuR通過與細胞分裂周期(CDC)6 3'-UTR結合上調CDC6,進而促進結直腸癌細胞增殖和體內異種移植瘤的生長及對奧沙利鉑的耐藥性。在卵巢癌〔11〕中,HuR和線粒體內膜轉位酶(TIMM)44均上調表達,且HuR通過調控TIMM44 mRNA的穩定性促進其細胞增殖。在肝癌〔12〕中,沉默HuR表達能夠抑制SMMC-7721細胞的增殖、侵襲和遷移,其機制與調控Bcl-2表達有關。此外,經HuR穩定后的致癌基因SEMA4D對食管鱗癌的增殖和遷移有促進作用,對細胞凋亡有抑制作用〔13〕。以上研究均顯示,HuR作為促癌基因在腫瘤細胞中發揮作用,但是其在食管鱗癌中的研究極少,其發展機制也不甚清楚。本研究結果與Xu等〔6〕結果一致,提示HuR與食管鱗癌的進展有關。因為HuR在KYSE30細胞中表達水平最高,所以選擇KYSE30細胞進行轉染實驗。文獻〔14〕顯示,細胞的異常增殖和侵襲是腫瘤發生發展的基礎。本研究發現,過表達HuR可明顯降低KYSE30細胞活性,降低克隆形成率和細胞侵襲數;而抑制HuR表達可顯著提高KYSE30細胞活性,增加克隆形成率和細胞侵襲數,揭示HuR促進食管鱗癌的增殖和侵襲,其可能是食管鱗癌的分子標志物。而且,體內實驗進一步說明,HuR在體內也能促進食管鱗癌細胞的生長。然而,HuR如何促進食管鱗癌細胞的增殖、侵襲還需進一步研究。

starbase在線軟件預測結果顯示,HuR可與DLEU2的3'-UTR端結合。DLEU2位于染色體13q14.3～14.4,參與多種腫瘤的發展過程〔15〕。據報道〔16〕,DLEU2在非小細胞肺癌組織和細胞中均高表達,其沉默后可通過調控miR-30c-5p/性別決定區Y框轉錄因子(SOX)9軸顯著抑制A549細胞進展。He等〔17〕發現,DLEU2在宮頸癌組織中上調表達,能夠通過抑制p53表達對宮頸癌細胞增殖和細胞周期起促進作用。Liu等〔18〕研究顯示,骨肉瘤組織和細胞中DLEU2水平明顯升高,其敲除后可通過海綿吸收miR-337-3p有效減弱細胞的增殖和遷移能力。本研究與Lu等〔7〕研究一致,提示DLEU2可能是食管鱗癌的分子標志物。另外,RIP實驗結果說明,HuR在食管鱗癌細胞中能與DLEU2相互作用,而且HuR與DLEU2共同作用不僅在體外促進食管鱗癌細胞的增殖和侵襲,還在體內促進腫瘤生長。

綜上,HuR可穩定DLEU2表達,進而促進食管鱗癌細胞的增殖、侵襲和移植瘤的體內生長。