基于炎癥反應研究參苓白術散加減方治療潰瘍性結腸炎的藥效及作用機制

鄧永文 張全輝 陳教華 張磊昌

(江西中醫藥大學附屬醫院,江西 南昌 330006)

潰瘍性結腸炎(UC)病變以結直腸多見,且病程較長,易反復發作,具有一定的癌變風險,給患者生活質量帶來嚴重影響〔1,2〕。中醫學認為,UC屬“下痢”“泄瀉”“赤白痢”等范疇,脾氣虛弱、運化失調是本病主要病機,因此UC治療通常采用健脾益氣、滲濕止瀉為主〔3,4〕。近年來,參苓白術散開始用于治療UC患者,臨床療效理想〔5,6〕。研究表明,采用參苓白術散治療UC小鼠可明顯改善其結腸黏膜損傷程度并降低疾病活動指數(DAI)及血清炎性因子含量,下調結腸組織中髓過氧化酶活性和丙二醛含量〔7〕。研究證實,通過參苓白術散治療脾虛濕熱性UC患者,可顯著緩解其腹痛腹瀉、黏液膿血便、食少腹脹等癥狀,臨床效果確切〔8〕。然而關于參苓白術散作用機制不甚明確,故本研究旨在探究參苓白術散加減方對UC結腸黏膜損傷的修復作用及對UC發病過程中炎癥反應的影響,并進一步闡釋該方對UC的保護作用及相關機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 30只Balb/c小鼠(雌雄各半)購于江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司,生產批號:SCXK(蘇)2018-0001,體質量20～22 g。將30只Balb/c 小鼠置于SPF級動物房中進行適應性喂養,分籠飼養,每籠5只,室溫控制于20～25 ℃,濕度為55%～60%,均自由攝食及飲水。

1.2主要試劑 試劑:聚偏氟乙烯(PVDF)膜(武漢愛博泰克公司);TriZol(深圳市益百順公司);二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量檢測試劑盒(廣州一科公司);白細胞介素(IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α抗體(廣州永諾公司);β-actin抗體(廣州蘇瑪生物公司);凝膠制備試劑盒(北京綠源大德公司);電化學發光(ECL)液(北京蘭博利德公司);酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(北京強欣博瑞公司);放射免疫沉淀裂解液(RIPA,深圳市文樂公司);逆轉錄試劑盒(上海捷瑞生物工程公司)。

1.3藥物制備 參苓白術散加減方由山藥、薏苡仁、炒谷芽、炒麥芽 20 g,黨參、茯苓、白及、六月霜、炒枳殼 15 g,炒白術、陳皮、桔梗、炒扁豆 10 g,砂仁(后下)、炙甘草、黃連6 g構成。在16味藥物中加入8倍量水浸泡,30 min后進行煎煮,共3次,然后將3次煎液合并濾過并減壓,使其濃縮至1 000 ml。試驗藥物劑量設置依據:2015年版《中華人民共和國藥典》。

1.4分組、建模及藥物治療 隨機抽取6只Balb/c小鼠作為空白對照組,余24只小鼠通過飲用3%葡聚糖硫酸鈉(DSS)建立UC小鼠模型,連續飲用8 d。建模后隨機抽取6只UC小鼠作為模型對照組,余18只UC小鼠模型分為參苓白術散加減方低、中、高劑量組,每組6只,其中參苓白術散加減方低、中、高劑量組分別予以7.8、15.6、31.2 g/kg參苓白術散加減方(200 μl)灌胃,連續灌胃12 d,另外兩組均通過等體積蒸餾水灌胃處理。

1.5DAI計算 觀察各組體質量、腹瀉和便血等體征并計算其DAI,計算方法為,0分:大鼠體質量未下降,大便性狀正常,便血為隱血(-);1分:體質量下降1%～5%,大便性狀介于正常與松散之間,便血介于隱血(-)與隱血(+)之間;2分:體質量下降6%～10%,大便性狀松散,便血為隱血(+);3分:體質量下降11%～20%,大便性狀介于松散與稀便之間,便血介于隱血(+)與肉眼血便之間;4分:體質量下降>21%,大便性狀為稀便,便血為肉眼血便。

1.6小鼠結腸病理組織學分析 分析各組小鼠結腸黏膜大體形態。將各組小鼠麻醉并斷頸處死,取其盲腸至肛門段結腸,經測量后取每段結腸末端部分通過10%甲醛溶液固定,觀察各組小鼠粘連程度、炎癥及潰瘍形成情況。

1.7小鼠血清炎性因子水平分析 于小鼠眼球取血,經臺式高速低溫離心機以1 500 r/min的速度離心后取上層血清,然后通過ELISA試劑盒檢測相關因子水平,稀釋提前制備好的樣品及對照品,并加入檢測抗體,在37 ℃環境下孵育1 h,然后通過ELISA洗板液洗板5次,將底物A、B置于其中,隨后放在37 ℃環境下避光反應15 min后終止。通過酶標儀于450 nm波長處測定相關吸光度。

1.8免疫組化法檢測小鼠結腸組織中細胞核增殖抗原(Ki-67)表達 分離小鼠結腸組織并將其固定在4%多聚甲醛,石蠟包埋切片后烘烤切片,放入二甲苯脫蠟至水,經梯度酒精(75%、85%、95%、100%)脫水后通過檸檬酸鈉熱修復抗原,完成上述操作后將切片置于3%H2O2,然后通過正常山羊血清封閉液封閉,經一抗、二抗孵育后通過鏈霉親和素-過氧化物酶復合物(POD)孵育組織,二氨基聯苯胺(DAB)顯色,蘇木素復染封片,最后分析Ki-67表達情況。

1.9實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測小鼠結腸組織中炎性因子表達分析 通過TriZol裂解法提取結腸組織中總RNA并檢測其濃度,隨后于20 μl體系中實施逆轉錄反應,反應產物于70 ℃變性10 min并保存于-20 ℃。PCR:2 μl逆轉錄產物,5 μl Taqmix,0.5 μl上游引物(10 μmol/L),0.5 μl下游引物(10 μmol/L),2.0 μl滅菌雙蒸水。條件:首先94 ℃預變性2 min;然后94 ℃變性30 s,55～62 ℃退火30 s,72 ℃延伸40 s,共30個循環;最后72 ℃延伸5 min。引物序列由廣州沛瑜公司合成,引物序列:IL-6:上游5′-AGCCCACCAAGAACGATAG-3′、下游5′-GGTTGTCACCAGCATCAGT-3′,IL-1β:上游5′-TGCCACCTTTTGACAGTGATG-3′、下游5′-TGTGCTGCGAGATTTGA-3′,TNF-α:上游5′-GAT-CGGTCCCCAAAGGGATG-3′、下游5′-TTGCTACGAC-GTGGGCTACA-3′,β-actin:上游5′-GCACCATGAAG-ATCAAGATCATT-3′、下游5′-TAACAGTCCGCCTAG-AAGCATT-3′。以β-actin作內參。電泳后觀察、拍照并分析。

1.10Western印跡檢測小鼠結腸組織中炎性因子表達 取小鼠結腸組織通過RIPA裂解,隨后對提取的總蛋白濃度進行檢測,濃度檢測完成后將其置于室溫下自然融化。根據實驗設計依次將樣品置于上樣孔,然后連接電源實施電泳,并轉至PVDF膜,置于5%脫脂牛奶中行封閉處理。加一抗、二抗孵育后洗膜,并通過化學發光法進行膠片曝光,顯影、定影后分析目標蛋白IL-6、IL-1β、TNF-α表達量。

1.11統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行方差分析,兩組間比較采用SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1各組DAI評分比較 模型對照組DAI較空白對照組明顯升高(P<0.05);與模型對照組比較,參苓白術散加減方高劑量組DAI明顯降低(P<0.05)。見表1。

2.2各組結腸病理組織學分析 模型對照組形態損傷評分較空白對照組明顯升高(P<0.05);參苓白術散加減方中、高劑量組形態損傷評分均較模型對照組明顯降低(P<0.05)。見表1。

2.3各組血清炎性因子水平比較 模型對照組血清中 IL-6、IL-1β、TNF-α水平均較空白對照組明顯升高(P<0.05);參苓白術散加減方高劑量組血清中 IL-6、IL-1β、TNF-α水平均較模型對照組明顯降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組DAI評分、形態損傷評分、血清炎性因子水平比較

2.4各組結腸組織形態變化分析 空白對照組結腸組織腺體結構完整,未出現損傷;模型對照組結腸組織發生明顯受損,腺體破碎,且黏膜層損傷嚴重,出現充血及水腫,炎性細胞浸潤;參苓白術散加減方低、中劑量組結腸組織中可見肉芽組織增生,腺體結構受損,炎性細胞浸潤;參苓白術散加減方高劑量組出現少量炎性細胞浸潤,偶見組織水腫及充血。圖1。

圖1 各組結腸組織形態學(免疫組化,×100)

2.5各組結腸組織中Ki-67表達比較 模型對照組結腸組織中Ki-67表達較空白對照組明顯升高(P<0.05);參苓白術散加減方高劑量組結腸組織中Ki-67表達較模型對照組明顯降低(P<0.05)。見表2。

2.6各組結腸組織炎性因子表達比較 模型對照組結腸組織IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA及蛋白表達量均較空白對照組明顯升高(P<0.05);參苓白術散加減方高劑量組結腸組織中IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA及蛋白表達量均較模型對照組明顯降低(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 各組Ki-67表達、結腸組織炎性因子mRNA及蛋白表達比較

1～5:空白對照組、模型對照組、參苓白術散加減方低、中、高劑量組圖2 各組結腸組織炎性因子蛋白表達

3 討 論

UC在任何年齡段均可發病,尤以20～40歲患者為最多,且該病病程較長,易反復發作,存在癌變的可能〔9〕。一項調查數據顯示,我國UC患病率約為11.6/105,然而由于人們飲食結構、生活習慣變化及醫療技術的不斷進步,本病患病率呈逐年增加趨勢,給患者及家庭帶來沉重負擔〔10,11〕。目前研究認為UC發病可能與感染、免疫及精神等因素密切相關,然而關于本病發生的病因及機制尚未完全闡明〔12〕。近年來,中醫藥在治療UC方面取得較大的進展,其已被證實可有效改善UC患者臨床癥狀,延緩病情進展,提高患者生存質量。參苓白術散可發揮益氣健脾、滲濕止瀉之功效,其已被證實可有效提高胃腸動力并促進胃腸黏膜屏障修復〔13〕。閆文慧等〔14〕報道顯示參苓白術散加減方中的活性成分可明顯抑制UC患者腸黏膜炎癥細胞浸潤,有利于緩解黏膜損傷程度。朱磊等〔15〕研究通過建立UC大鼠模型并予以其參苓白術散加減方干預,發現UC大鼠模型血清中IL-5、IL-6等炎性因子含量降低,IL-4等抑炎因子含量升高,在改善UC大鼠癥狀方面具有一定效果。提示,參苓白術散加減方可在一定程度上改善UC小鼠病情嚴重程度及結腸組織損傷情況。這與畢殿勇等〔16〕研究結果基本一致。

Ki-67在分辨生長中的正常細胞及癌細胞中具有重要價值,張慧等〔17〕發現,在正常組織內Ki-67并未出現表達,然而其在腫瘤組織及增殖的細胞核中表達出現異常,尤其是前者,除此之外該研究亦發現,其在UC組織及結腸癌組織中含量無明顯差異。本研究結果發現,UC小鼠模型結腸組織中Ki-67表達明顯增加,而經參苓白術散加減方干預后UC小鼠結腸組織中Ki-67表達明顯降低。畢殿勇等〔16〕報道顯示,細胞因子失衡在UC發生過程中發揮關鍵作用,UC患者出現腸黏膜損傷,主要是由于患者體內促炎因子含量超過抑炎因子含量,進而引發機體組織損傷。、IL-1β、IL-6、TNF-α作為促炎因子,在UC發生過程中大量釋放,可引發腸過度炎癥反應,進而導致結腸組織水腫、出血、壞死等〔16〕。袁星華〔18〕報道顯示,UC患者血清中IL-6、TNF-α含量均較健康人群顯著升高,且其含量與UC進展呈正相關。唐舒婷等〔19〕報道顯示,UC患者血清、腸道黏膜及腸道平滑肌中IL-1β含量均明顯上調,其可導致患者平滑肌功能發生變化,進而引發結腸平滑肌細胞對神經激肽A的收縮作用顯著減弱,此時細胞中鈣離子儲存亦隨之減少。本研究提示,參苓白術散加減方可調節UC小鼠體內促炎性因子含量,有利于減少UC小鼠血清及結腸組織中IL-6、IL-1β、TNF-α水平,并改善UC小鼠腸黏膜損傷。這與李姿慧等〔7〕、趙文曉等〔20〕報道結果相同。以上研究結果說明,參苓白術散加減方可通過調節炎癥反應而改善UC小鼠病情,有利于促進結腸黏膜修復。

參苓白術散加減方可有效降低UC小鼠DAI評分并改善其結腸組織損傷程度,其作用機制可能是通過調控炎癥反應實現的,可為參苓白術散加減方臨床治療UC提供實驗支持。