雷帕霉素對慢性腎衰竭大鼠主動脈平滑肌細胞鈣化及自噬的影響

鄭金花 韋澤豐 王自強

(海南醫學院第一附屬醫院血液凈化中心,海南 海口 570100)

慢性腎衰竭(CRF)患者常伴有血管彈性功能低下,極易導致心血管疾病。血管鈣化是CRF患者發生心血管事件的高危因素〔1〕。自噬作為細胞的一種保護性機制,主要通過細胞降解并再利用多余大分子或無功能細胞器,為機體其他生命活動提供原料和能量,可有效抑制血管鈣化〔2〕。自噬相關分子機制及信號通路較復雜,其中哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是諸多通路與分子機制作用的交匯點,是自噬的負性調控因子〔3,4〕。雷帕霉素可通過抑制mTOR通路的 mTOR 復合物(mTORC)1來誘導自噬〔5〕。以往研究報道〔6,7〕,雷帕霉素可促進腎小球足細胞、神經細胞等多種細胞的自噬活動。然而鮮有研究報道雷帕霉素是否可抑制腎臟平滑肌細胞(VSMC)鈣化及其分子機制。本研究通過雷帕霉素抑制劑干預鈣化的大鼠腎臟VSMC,探討雷帕霉素抑制劑對CRF VSMC鈣化的影響機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康SPF級,10～12周齡,雄性,Wistar 大鼠,體質量(200±20)g,購自海口奇力制藥有限公司,動物的使用許可證號:SYXK(瓊)2017-0014。大鼠飼養在無特定病原體(SPF)級動物實驗室〔使用許可證號:SYXK(瓊)2017-0014〕,飼養室濕度(50±10)%、溫度(25±2)℃、12 h循環光照、通風良好。正常飼養1 w,第2周開始實驗。本研究中大鼠相關實驗獲得醫院動物管理倫理委員會批準(批準號:IACUC-20180217-61)。

1.2藥品與主要試劑 腺嘌呤(BR沃凱,購自國藥集團化學試劑有限公司),Western印跡試劑盒(美國BD公司),全蛋白抽提試劑盒(德國QIAGEN公司),戊巴比妥鈉(Sigma公司,美國),茜素紅染料〔購自北京索萊寶科技有限公司,規格:25 g/瓶,用Tris-HCl將其配制成0.1%茜素紅-Tris-HCl(pH8.3)溶液〕。

1.3動物模型建立及分組 按照參考文獻〔8〕的方法構建模型,取33只雄性昆明大鼠自由飲用2%葡聚糖硫酸鈉(DSS)水溶液共7 d,再普通飲水14 d。隨機選取3只大鼠取腎臟組織進行病理學檢查,按照米海燕等〔9〕的方法證實模型構建成功,將剩余30只大鼠隨機分為模型組、CRF+I組和CRF+I+3-甲基腺嘌呤(MA)組,每組10只。模型組、CRF+I組和CRF+I+3-MA組實驗第1～4周給予腺嘌呤混懸液及含1.8%高磷飼料每日1次喂養,第5～8周腺嘌呤改為隔日灌胃。CRF+I組同時給予雷帕霉素〔西羅莫司口服液,C51H79NO13,0.4 mg/(kg·d),杭州中美華東藥業有限公司,浙江杭州〕灌胃治療,1次/d。CRF+I+3-MA組給予相同劑量的雷帕霉素和5 mmol/L的3-MA灌胃,劑量2 ml,另取10只大鼠自造模第1天開始始終給予生理鹽水灌胃作為對照組。共給藥8 w。實驗結束2 d后小鼠斷頸處死。取出腎臟組織,生理鹽水沖洗后一半存儲于-80 ℃冰箱備用,另一半放于4%多聚甲醛溶液固定。

1.4血生化檢測 大鼠稱重后,以2%戊巴比妥鈉麻醉固定于操作臺,剖開腹腔,使用負壓采血針從腹主動脈采血,離心,吸取上清液置于Ep管,保存于-20 ℃冰箱。用于后續生化指標檢測。

1.5蘇木素-伊紅(HE)染色檢測大鼠腎臟組織形態:看組織病理變化 腎臟組織在多聚甲醛中浸泡,經脫水、石蠟包埋、切片(厚度約4 μm)、脫蠟,HE染色、二甲苯充分浸泡2 h直至透明、干燥。常規封片,光學顯微鏡下觀察組織形態。

1.6茜素紅染色及細胞鈣沉積量檢測 每組隨機選取5只大鼠,剝離胸主動脈,包埋、切片、脫蠟、石蠟切片、水洗;加入1%茜素紅-Tris-HCl(pH8.3)液染色;水洗;常規脫水透明,封片。顯微鏡下觀察鈣化結節。

1.7免疫組化檢測大鼠主動脈上α-平滑肌肌動蛋白(SMA)和runt相關轉錄因子(Runx)2蛋白表達 按照免疫組化試劑盒操作說明書,將主動脈組織石蠟切片脫蠟水化,修復抗原,先后予以3%H2O2滅活內源性過氧化物酶10 min、10%山羊血清封閉15 min,各加入大鼠抗α-SMA和兔抗Runx2單抗,經4 ℃冰箱過夜后,加入生物素標記二抗,清潔后二氨基聯苯胺(DAB)顯色,鏡檢。采用Image-Pro Plus6.0分析,各切片隨機選取視野,測定陽性部位(棕黃色顆粒)的吸光度值。

1.8透射電鏡觀察VSMC內自噬體的數量 分別收集各組樣本,將各組細胞培養72 h,棄掉培養基,加入電鏡固定液,收集細胞,更換固定液,固定2 h。透射電鏡下觀察自噬體。

1.9免疫熒光檢測微管相關蛋白輕鏈(LC)3蛋白表達 各組細胞培養72 h后,磷酸鹽緩沖液清洗3次,固定20 min。磷酸鹽緩沖液洗3次,破膜5 min。山羊血清封閉2 h,LC3抗體(1∶200倍稀釋)在4 ℃孵育過夜,后續操作均避光,二脒基苯基吲哚(DAPI)室溫染核5 min,DAPI藍色熒光曝光100 ms、拍照,200倍熒光顯微鏡下拍攝。

1.10Western印跡檢測大鼠腎臟組織激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)/mTOR信號通路蛋白及自噬相關蛋白表達 分別收集各組樣本,提取組織勻漿總蛋白,測定蛋白含量。制備蛋白樣品并進行凝膠電泳,轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,封閉液封閉2 h。加入一抗4 ℃封閉過夜。次日加入二抗,室溫孵育1 h,加入顯色液顯影。

1.11統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗,作圖工具采用Graphpad5.01。

2 結 果

2.1雷帕霉素對大鼠24 h尿蛋白定量(Upro)的影響 與對照組相比,模型組中24 h Upro明顯升高(P<0.05);與模型組相比,CRF+I組中24 h Upro明顯降低(P<0.05);與CRF+I組相比,CRF+I+3-MA組中24 h Upro顯著升高(P<0.05),見表1。

2.2雷帕霉素對大鼠尿液和血液相關生化指標的影響 與對照組相比,模型組中尿素氮(BUN)和肌酐(Scr)、血磷(P)顯著升高,血鈣(Ca)顯著下降(P<0.05);與模型組相比,CRF+I組中BUN和Scr、血P顯著降低,血Ca顯著升高(P<0.05);與CRF+I組相比,CRF+I+3-MA組中BUN和Scr、血P顯著升高,血Ca顯著下降(P<0.05),見表1。

2.3雷帕霉素對α-SMA、Runx2蛋白表達水平的影響 對照組主動脈平滑肌層大量表達α-SMA,胞質呈棕黃色;與對照組相比,模型組α-SMA表達顯著降低(P<0.05);與模型組相比,CRF+I組α-SMA表達明顯升高(P<0.05),CRF+I+3-MA組無明顯變化;且CRF+I+3-MA組α-SMA明顯低于CRF+I組(P<0.05)。此外,對照組主動脈壁上Runx2微量表達;與對照組相比,模型組Runx2表達明顯升高(P<0.05);與模型組相比,CRF+I組中Runx2表達顯著降低(P<0.05),CRF+I+3-MA組Runx2蛋白表達顯著升高(P<0.01);且CRF+I+3-MA組主動脈上Runx2表達明顯高于CRF+I組(P<0.05),見表1、圖1。

表1 雷帕霉素抑制劑對大鼠24 h Upro、BUN、Scr、血P、α-SMA、Runx2蛋白表達水平的影響

圖1 各組主動脈上α-SMA和Runx2蛋白表達(免疫組化,×400)

2.4雷帕霉素對大鼠腎組織形態的影響 除對照組外,其他各組腎臟均可見明顯病變,主要表現為腎小管上皮細胞胞質空亮、空泡變性、增生伴擴張,有脫落和管腔內蛋白小滴,皮質淺層腎小管擴張。與對照組相比,模型組上述病變發生率明顯升高;與模型組相比,CRF+I組上述病變發生率明顯降低;與CRF+I組相比,CRF+I+3-MA組上述病變發生率明顯升高,見圖2。

圖2 各組腎組織形態(HE染色,×400)

2.5茜素紅染色觀察主動脈壁鈣化情況 茜素紅染色顯示,對照組主動脈壁未見深紅色。模型組主動脈壁中膜層出現呈線性連續的鈣化結節,呈深紅色,彈性纖維斷裂。用雷帕霉素預處理后,CRF+I組鈣化結節減少。加入3-MA抑制自噬后,CRF+I+3-MA組鈣化結節又顯著增加,見圖3。

圖3 各組主動脈壁鈣化情況(茜素紅染色,×100)

2.6雷帕霉素通過抑制AMPK/mTOR信號通路激活自噬減輕VSMC鈣化 透射電鏡觀察各組中VSMC內自噬體數量,對照組中有少量自噬體;與對照組相比,模型組有大量自噬體形成;與模型組相比,CRF+I組VSMC內自噬體數量明顯增加;與CRF+I組相比,CRF+I+3-MA組VSMC內自噬體數量明顯減少。說明雷帕霉素可以激活VSMC的自噬活動。見圖4。與對照組相比,模型組LC3Ⅱ/Ⅰ及自噬相關蛋白(Beclin)1蛋白表達明顯升高(P<0.01);但給予雷帕霉素預處理后,LC3Ⅱ/Ⅰ及Beclin1蛋白表達明顯升高(P<0.01);給予3-MA預處理后,LC3Ⅱ/Ⅰ及Beclin1蛋白表達明顯降低(P<0.05)。見表2、圖5。免疫熒光染色也顯示,與對照組相比,模型組細胞質內LC3點狀聚集增多;與模型組相比,CRF+I組LC3點狀聚集明顯增加;與CRF+I組相比,CRF+I+3-MA組LC3點狀聚集也明顯減少。見圖6。

紅色箭頭表示自噬體圖4 透射電鏡觀察各組VSMC內自噬體數量(×20 000)

表2 雷帕霉素對LC3、Beclin1表達的影響

圖5 各組LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表達

2.7Western印跡檢測p-mTOR蛋白表達 4組p-mTOR蛋白表達差異有統計學意義(F=5.602,P=0.028)。與對照組(1.08±0.21)相比,模型組p-mTOR表達顯著升高(1.61±0.35,P<0.01);與模型組相比,CRF+I組p-mTOR表達顯著降低(0.50±0.11,P<0.01);與CRF+I組相比,CRF+I+3-MA組p-mTOR蛋白表達顯著升高(0.92±0.18,P<0.05),見圖7。

圖6 免疫熒光檢測LC3蛋白表達(×200)

圖7 各組p-mTOR蛋白表達水平

3 討 論

許多研究發現〔8,9〕,mTOR信號通路在成骨分化中起著重要的調控作用。雷帕霉素抑制劑對CRF具有一定的防治作用〔10〕,但其作用機制研究還很少。本研究證明,雷帕霉素抑制劑對CRF大鼠有較好的治療效果。VSMC的病理變化是構成CRF血管鈣化的主要原因。有研究證實〔11〕,自噬在血管及VSMC的病理生理過程中發揮關鍵作用。驗證自噬的主要方法有Western印跡結果檢測LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白表達、熒光顯微鏡下觀察LC3點狀聚集及電鏡下觀察自噬體的形成〔12,13〕。有研究證實,阿托伐他汀通過下調β-連環蛋白(catenin)來誘導VSMC自噬,進而抑制VSMC鈣化〔14〕。研究顯示,自噬可通過減少VSMC基質囊泡的釋放而減緩VSMC鈣化〔15,16〕。沈鳳等〔17〕研究發現血小板源性生長因子(PDGF)可通過誘導VSMC自噬而降低鈣調蛋白和α-SMA蛋白表達,上調波形蛋白和骨橋蛋白的表達,從而增強細胞鈣化。本研究使用雷帕霉素治療CRF大鼠發現,雷帕霉素會促進腎臟VSMC自噬,從而抑制VSMC鈣化,進而發揮對CRF的治療作用。

mTOR處于許多細胞信號通路的關鍵位置,在細胞生長、分化及調控自噬過程中起著重要作用〔18〕。有研究發現,敲除小鼠軟骨中的mTOR 相關基因,自噬信號明顯增加,降低細胞凋亡〔19〕。有研究報道〔20〕,雷帕霉素通過上調自噬相關因子的表達,從而促進軟骨細胞生存。楊羽菲等〔21〕在探討治療性低溫(TH)在缺氧期對心肌細胞自噬活性及自噬流的影響機制研究中,使用雷帕霉素作用于TH作用的缺氧期H9c2細胞,發現細胞自噬活性激活,且逆轉了TH對p-mTOR和p-S6的促表達作用。雷帕霉素對自噬的調控機制在其他器官研究較多,但是雷帕霉素抑制劑對腎臟VSMC鈣化的影響機制還鮮有研究。雷帕霉素可通過激活自噬改善足細胞損傷,這可能與雷帕霉素抑制mTOR/4EBP1/P70S6K信號通路有關〔22〕。劉磊〔23〕研究腎臟足細胞結構與功能改變在糖尿病腎病(DN)發病過程中的作用機制,證實雷帕霉素可通過mTOR-S6K1-LC3Ⅱ通路調控DN大鼠腎臟足細胞自噬。本研究提示,雷帕霉素抑制劑可通過抑制p-mTOR的生物學活性,減弱其對下游蛋白的作用,進而激活VSMC的自噬機制,減輕VSMC的鈣化。

綜上,雷帕霉素抑制劑對大鼠CRF起到一定療效,其機制可能與雷帕霉素抑制劑對AMPK/mTOR信號通路的調控,從而促進自噬,減弱VSMC鈣化有關。