鹿茸多肽對(duì)腎陽(yáng)虛證心肌損傷大鼠心腎功能的保護(hù)作用

鄭彭予 肖靜 黎清俊羽 王閣 律廣富 王雨辰 林喆 徐巖 黃曉巍,4

(1長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院臨床藥學(xué)與中藥藥理教研室,吉林 長(zhǎng)春 130117;2中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所;長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 3吉林省人參科學(xué)研究院中藥藥理組;4東北亞中醫(yī)藥研究院基礎(chǔ)研究所)

心血管疾病已成為全球最常見的死因之一〔1〕,且心肌細(xì)胞屬于終末分化的細(xì)胞不能再生。所以,防止心肌細(xì)胞損傷和丟失是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的治療策略〔2〕,在醫(yī)療領(lǐng)域也是一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,腎主水,心腎相通,心腎陽(yáng)虛是導(dǎo)致心肌損害的主要病機(jī),心陽(yáng)不足,久病累及腎臟,導(dǎo)致腎臟元陰元陽(yáng)受損,陽(yáng)虛不振,陰虛不振,或腎陽(yáng)不足,氣化不足,水氣逆心,導(dǎo)致心力衰竭,故名曰:“補(bǔ)心,固腎,固心,固心”。從心肌損害的臨床特征來(lái)看,心腎陽(yáng)虛為其病理學(xué)基礎(chǔ),但目前尚無(wú)有效的治療方法〔3〕。治療該病的要點(diǎn)是“溫陽(yáng)逐水”“活血化瘀”“通心腎”,陽(yáng)氣充盛,則水氣運(yùn)行順暢,五臟才能正常行使其生理功能。心腎陽(yáng)虛證臨床上最常見的癥狀是心悸、水腫等。心虛膽小、心血虧損、痰阻心脈、水飲逆心、心陽(yáng)虛損是中醫(yī)辨證的基本特征。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為,心陽(yáng)能下通腎水,腎陰能上通心陽(yáng)。因此,在治療心腦血管疾病時(shí),如有畏寒肢冷、面色蒼白等陽(yáng)氣不足之癥,常以鹿茸為藥,以溫腎陽(yáng),扶心陽(yáng)。

鹿茸主要活性成分鹿茸多肽(VAP)具有促進(jìn)成骨、造血、神經(jīng)、表皮和毛發(fā)生長(zhǎng)的作用,而且還含有大量表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子,可以在抗氧化、抗炎、抗癌、心肌保護(hù)、腎臟保護(hù)等多個(gè)方面發(fā)揮防治作用〔4〕。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)〔5〕,VAP對(duì)阿霉素所致的心肌損傷大鼠有不同程度的保護(hù)作用,但VAP能否改善腎陽(yáng)虛證下心肌損傷模型大鼠的心腎功能尚不明確。本研究擬探索VAP對(duì)腎陽(yáng)虛證下心肌損傷模型大鼠心腎功能的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器 48只SPF級(jí)12周齡雄性健康SD大鼠,體質(zhì)量180～200 g,均購(gòu)自長(zhǎng)春億斯科技有限公司,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK-(吉)-2022-0002。VAP(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院制備,每1 g VAP約含生藥鹿茸28.9 g,批號(hào):20221020),氫化可的松注射液(山西芮城縣紅寶獸醫(yī)有限責(zé)任公司,批號(hào):2202121),鹽酸貝那普利片(北京諾華制藥有限公司,批號(hào):2207A06),Protein Marker(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):P0068),蘇木素-伊紅(HE)染液、依文思藍(lán)(北京索萊寶科技有限公司,貨號(hào):D1120、E8010),丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號(hào):A003-2-2、A001-3-1、A020-2-1),環(huán)磷酸腺苷(cAMP)檢測(cè)試劑盒、磷酸肌酸同工酶(CK-MB)檢測(cè)試劑盒、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)檢測(cè)試劑盒(江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司,貨號(hào):A003-4-1、H197-1-1、A020-2-1),轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1、VEGF抗體、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司,貨號(hào):69012-1-Ig、19003-1-AP、20960-1-AP),超純水制備系統(tǒng)(四川沃特爾科技發(fā)展有限公司,型號(hào):WP-RO-40B),光學(xué)顯微鏡(日本OLSMPUS公司,型號(hào):Gallios),超低溫冰箱(美國(guó)Thermo公司,型號(hào):ULT1386-3-V41),多道生理記錄儀(埃德儀器國(guó)際貿(mào)易有限公司,型號(hào):ML224),離心機(jī)(德國(guó)艾本德股份公司,型號(hào):Centrifuge 5810 R),恒溫培養(yǎng)箱(EYEL4公司,型號(hào):SLI-700),熒光發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(英國(guó)UVItec公司,型號(hào):Q9-Alliance),多功能微孔板酶標(biāo)儀(美國(guó)賽默飛世爾有限公司,型號(hào):SUNERGY-HTX),電泳儀、電泳槽(美國(guó)伯樂Bio-Rad公司,型號(hào):BE6085)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型制備 大鼠自由進(jìn)食和飲水,飼養(yǎng)環(huán)境:12 h光/暗循環(huán)、恒溫(23～25 ℃)、恒濕(40%～70%),適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w。采用隨機(jī)平行對(duì)照分配法將48只大鼠分為空白組、模型組、陽(yáng)性藥組〔鹽酸貝那普利片0.5 mg/(kg·d)〕、低、中、高劑量VAP組〔100、200、300 mg/(kg·d)VAP〕。除空白組外,各組肌肉注射氫化可的松25 mg/(kg·d),1次/d,連續(xù)肌注21 d,同時(shí)腹腔注射阿霉素2.2 mg/(kg·d),復(fù)制腎陽(yáng)虛證下心肌損傷大鼠模型。造模結(jié)束后以大鼠體征變化、心電圖ST段明顯升高為模型成功判斷標(biāo)準(zhǔn)。造模成功后連續(xù)給藥28 d。陽(yáng)性藥組灌胃右歸丸600 mg/(kg·d)和酒石酸美托洛爾片20 mg/(kg·d),不同劑量VAP組灌胃相應(yīng)劑量VAP,空白組、模型組灌胃相等體積蒸餾水。末次給藥2 h后,麻醉大鼠進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血,將每只大鼠血清低溫-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3各組體征監(jiān)測(cè) 觀察大鼠體質(zhì)量、食欲、大便、毛發(fā)的光澤度、活動(dòng)度、精神狀態(tài)等并做記錄。

1.4各組心電圖檢測(cè) 以戊巴比妥鈉(30 mg/kg)作為麻醉藥物腹腔注射,在大鼠失去翻正反射時(shí)將大鼠與心電圖處理系統(tǒng)相連進(jìn)行測(cè)量。

1.5HE染色觀察各組心肌組織及腎臟組織纖維化和微血管損傷情況 將各組大鼠處死后,取出心臟及腎臟,用生理鹽水漂洗,使用4%多聚甲醛進(jìn)行固定后分別加入不同濃度酒精梯度脫水,再使用二甲苯進(jìn)行透明處理,最后用石蠟包埋制成石蠟切片。經(jīng)過HE染色,中性樹脂封片,在顯微鏡下觀察其纖維化和微血管損傷情況改變表現(xiàn)并拍照記錄。

1.6生化法檢測(cè)各組血清SOD活性、LDH和MDA水平 按照試劑盒說(shuō)明書方法步驟分別檢測(cè)大鼠血清生化指標(biāo)SOD活性、LDH和MDA水平。

1.7酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)各組血清cAMP、cGMP和CK-MB水平 按照ELISA試劑盒說(shuō)明書步驟進(jìn)行。

1.8Western印跡檢測(cè)各組腎臟組織中VEGF、HIF-1和TGF-β1蛋白表達(dá)水平 按照常規(guī)方法提取各組腎臟組織蛋白,檢測(cè)VEGF、HIF-1和TGF-β1蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組體征 空白組眼睛有神,動(dòng)作敏捷,毛發(fā)光澤濃密,緊貼軀體,食量和排泄均正常;模型組出現(xiàn)兩眼無(wú)神,精神萎靡,行動(dòng)遲緩,活動(dòng)耐力下降,皮毛干枯易脫落,相互扎堆,足背水腫,體質(zhì)量下降,食欲不振,尿量減少等腎陽(yáng)虛證特征性表現(xiàn);陽(yáng)性藥組和高劑量VAP組一般狀態(tài)接近于正常組。與空白組比較,模型組體質(zhì)量增長(zhǎng)速度明顯降低(P<0.01);與模型組比較,陽(yáng)性藥組、中和高劑量VAP組體質(zhì)量增長(zhǎng)速度明顯升高(P<0.05,P<0.01)。見表1。

表1 各組體質(zhì)量比較

2.2各組心電圖檢測(cè) 除空白組外,其他實(shí)驗(yàn)組ST段均明顯升高;與模型組比較,陽(yáng)性藥組,低、中和高劑量VAP組ST段明顯降低。見圖1。

圖1 各組心電圖

2.3各組血清SOD活性、LDH和MDA水平比較 與空白組比較,模型組血清SOD活性明顯降低,LDH和MDA水平明顯升高(P<0.01);與模型組比較,陽(yáng)性藥組、中、高劑量VAP組血清中SOD活性明顯升高,LDH和MDA水平明顯降低(P<0.05,P<0.01)。見表2。

2.4各組血清cAMP、cGMP和CK-MB水平與空白組比較,模型組血清cGMP水平明顯升高,cAMP和CK-MB水平明顯降低(P<0.01);與模型組比較,陽(yáng)性藥組、中、高劑量VAP組cGMP水平明顯降低,cAMP和CK-MB水平明顯升高(P<0.05,P<0.01)。見表2。

表2 各組血清SOD活性、LDH和MDA水平及cGMP、cAMP和CK-MB水平比較

2.5各組心肌組織病理形態(tài)表現(xiàn) HE染色結(jié)果顯示,與空白組比較,模型組心肌纖維排列混亂,纖維化明顯,有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),間隔變大;與模型組比較,陽(yáng)性藥組、中、高劑量VAP組心臟組織侵襲及纖維化程度均明顯降低。見圖2。

2.6各組腎臟組織病理形態(tài)表現(xiàn) HE染色結(jié)果顯示:與空白組比較,模型組腎組織結(jié)構(gòu)異常,部分腎小管上皮細(xì)胞萎縮,管腔擴(kuò)張,如黃色箭頭所示;部分腎小球萎縮,毛細(xì)血管袢結(jié)構(gòu)不清晰,如紅色箭頭所示;間質(zhì)可見纖維組織及炎癥細(xì)胞增生,如黑色箭頭所示;與模型組比較,陽(yáng)性藥組、中劑量VAP組和高劑量VAP組腎小球萎縮,纖維化及炎癥細(xì)胞均有所減輕。見圖2。

圖2 各組心肌、腎臟組織病理形態(tài)(HE染色,×200)

2.7各組腎臟組織中VEGF、HIF-1和TGF-β1蛋白表達(dá)水平比較 與空白組比較,模型組腎臟組織中HIF-1和TGF-β1蛋白表達(dá)水平明顯升高,VEGF蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)。與模型組比較,陽(yáng)性藥組和中、高劑量VAP組腎臟組織中HIF-1和TGF-β1蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05,P<0.01),低劑量組VAP組HIF-1顯著降低(P<0.01),陽(yáng)性藥組和中、高劑量VAP組VEGF蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05,P<0.01)。見表3、圖3。

表3 各組腎臟組織中VEGF、HIF-1和TGF-β1蛋白表達(dá)水平

1～6:空白組,模型組,陽(yáng)性藥組,高、中、低劑量VAP組圖3 各組腎臟組織中VEGF、HIF-1和TGF-β1表達(dá)

3 討 論

無(wú)論在發(fā)展中國(guó)家還是在發(fā)達(dá)國(guó)家,心血管疾病發(fā)病率均不斷攀升〔6〕。針對(duì)冠心病、高血壓等多種心腦血管疾病,目前尚無(wú)有效防治藥物。大部分植物產(chǎn)物作為藥材可以發(fā)揮其保護(hù)效益,通過降低機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)和脂質(zhì)過氧化作用,恢復(fù)鈣離子平衡,減少心肌損傷標(biāo)志物和促炎細(xì)胞因子表達(dá),調(diào)節(jié)凋亡水平下降來(lái)修復(fù)及保護(hù)心肌損傷〔7～9〕。而鹿茸作為動(dòng)物藥含有多種血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑,可對(duì)心血管系統(tǒng)產(chǎn)生更加積極的作用進(jìn)而有益于健康〔10〕。研究表明〔11〕,鹿茸能夠升高心肌損傷后大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的含量,從而促進(jìn)血管生成并對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷進(jìn)行修復(fù),具有抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗凋亡、清除組織自由基、減少體內(nèi)毒素蓄積、延緩神經(jīng)組織纖維化進(jìn)程、抑制炎癥因子和神經(jīng)保護(hù)功能等作用,進(jìn)而保護(hù)腎臟損傷。心肌缺血后,機(jī)體迅速生成大量自由基,過多自由基是造成心臟損害的主要原因,氧化自由基的清除可以通過兩種方式進(jìn)行:(1)直接提供電子,還原氧自由基;(2)對(duì)氧自由基進(jìn)行及時(shí)清除,使體內(nèi)抗氧化酶活性得到提高。SOD是一種十分重要的氧自由基清除劑,可以將氧自由基徹底清除進(jìn)而保護(hù)機(jī)體不受損傷〔12,13〕。CK-MB是判斷心肌損傷程度的主要指標(biāo)。LDH在各種組織中均有表達(dá),以心臟和腎為最高,是一種普遍判斷心病及腎病的指標(biāo)〔14〕。本研究結(jié)果顯示,VAP治療腎陽(yáng)虛證心肌損傷大鼠可顯著改善其心肌及腎臟功能。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)〔15,16〕,細(xì)胞內(nèi)cGMP的增加會(huì)使心肌細(xì)胞自律性下降。本研究結(jié)果提示,VAP可顯著改善腎陽(yáng)虛證心肌細(xì)胞的凋亡,保護(hù)大鼠心肌功能。研究表明〔17〕,激活cAMP信號(hào)途徑可以對(duì)心肌起到保護(hù)作用,cAMP可以釋放具有活性的亞基,并將其轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中。也有研究證明〔18,19〕,cAMP的激活可以減輕因各種理化因素導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果提示VAP可顯著改善腎陽(yáng)虛證心肌損傷大鼠的心肌功能,發(fā)揮心臟保護(hù)作用。腎組織中有豐富的間質(zhì)-肌成纖維細(xì)胞,而TGF-β1可調(diào)控成纖維細(xì)胞活化,當(dāng)腎陽(yáng)虛證大鼠心臟損傷后,腎臟TGF-β1蛋白水平高表達(dá),腎臟纖維化程度明顯升高,且隨損傷程度增加而升高,是導(dǎo)致腎陽(yáng)虛大鼠腎臟纖維化的重要原因〔20～22〕。本研究結(jié)果表明,VAP可以通過降低TGF-β1蛋白表達(dá)對(duì)大鼠腎臟發(fā)揮保護(hù)作用。VEGF是一種多功能肝素結(jié)合糖蛋白,可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂和遷移,起到抗凋亡作用,還可以參與新生血管生成〔23,24〕。研究表明〔25～27〕,在腎臟發(fā)生纖維化時(shí),VEGF表達(dá)顯著降低,與腎臟發(fā)生微循環(huán)障礙時(shí)相似。在腎臟損傷進(jìn)程中,由于血液流量降低,腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)HIF-1,導(dǎo)致腎臟內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)失衡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,HIF-1對(duì)VEGF的表達(dá)不利。本研究表明VAP可以改善腎纖維化中的微血管損傷。VAP可以影響腎陽(yáng)虛證心肌損傷大鼠腎臟中HIF-1和VEGF蛋白表達(dá)水平來(lái)改善腎臟損傷。

綜上,用不同濃度VAP治療后,腎陽(yáng)虛證下心肌損傷大鼠的宏觀體征及客觀指標(biāo)等均有不同程度改善,且其作用效果與VAP劑量相關(guān)。其治療腎陽(yáng)虛證心肌損傷大鼠可能通過抗氧化應(yīng)激、抗炎、抗凋亡、糾正體內(nèi)自由基紊亂、調(diào)節(jié)cAMP、cGMP通路來(lái)減輕心肌及腎臟損傷、介導(dǎo)TGF-β1通路來(lái)調(diào)控成纖維細(xì)胞活化,使腎臟纖維化程度減輕和HIF-1與VEGF之間相互調(diào)節(jié)來(lái)保護(hù)心臟及腎臟的微血管損傷。然而,腎陽(yáng)虛證心肌損傷的機(jī)制比較復(fù)雜,其中涉及的信號(hào)通路及蛋白并不是單獨(dú)作用,而是多條通路相互配合發(fā)揮治療作用。因此VAP發(fā)揮治療腎陽(yáng)虛證心肌損傷的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。