柴胡皂苷A調(diào)控PI3K/Akt通路對(duì)2型糖尿病小鼠胰島素抵抗的影響

林玉玲 李玉杰 李增一 劉琳 籍胤璽

(南陽(yáng)市中心醫(yī)院,河南 南陽(yáng) 473000)

糖尿病主要是由長(zhǎng)期高血糖、高血脂及胰島素抵抗、胰島β細(xì)胞受損引起的,其中2型糖尿病(T2DM)的發(fā)病率最高〔1,2〕。T2DM的主要病理特征為慢性高血糖及胰島素抵抗〔3〕,基于T2DM發(fā)病率的逐年上升及并發(fā)癥較為嚴(yán)重,公認(rèn)的降糖類藥物鹽酸二甲雙胍具有刺激脾胃的副作用〔4〕,因此尋找新的高效安全的替代藥物成為臨床上治療糖尿病的關(guān)鍵。中草藥成為目前的研究熱點(diǎn),其中柴胡皂苷A是中藥柴胡的主要生物活性成分之一,具有抗炎、抗菌、抗病毒及保肝護(hù)腎的作用〔5〕。肝臟在全身代謝中發(fā)揮重要作用,T2DM發(fā)生過(guò)程中,肝臟胰島素抵抗導(dǎo)致機(jī)體糖脂代謝紊亂〔6〕。胰島素抵抗與胰島素信號(hào)通路密切相關(guān),其中磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號(hào)通路是胰島素信號(hào)通路的一個(gè)環(huán)節(jié)〔7〕。研究表明〔8〕,胰島素受體激活其下游的PI3K與胰島素受體底物結(jié)合,誘導(dǎo)Akt磷酸化,發(fā)揮調(diào)節(jié)糖代謝的作用。本研究探究柴胡皂苷A對(duì)T2DM小鼠胰島素抵抗的作用及相關(guān)通路的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性BALB/c小鼠60只,4～6周齡,體質(zhì)量18～20 g,由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,許可證號(hào)為SCXK(豫)2017-0001。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于溫度22～25 ℃,濕度45%～50%的環(huán)境中,給予充足的食物、水,晝夜交替12 h。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 柴胡皂苷A(H811102,深圳海思安生物技術(shù)有限公司);鹽酸二甲雙胍(C14202003084,中美上海施貴寶制藥有限公司);鏈脲佐菌素(STZ,sl8566,北京康納瑞生物科技有限公司);胰島素(91077C,美國(guó)SIGMA公司);小鼠空腹胰島素(FINS)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(FT-P9S2076X,上海梵態(tài)生物科技有限公司);三酰甘油(TG,SH-1259)、總膽固醇(TC,SH-1256)、游離脂肪酸(FFA,SKT-1594)檢測(cè)試劑盒(北京凱詩(shī)源生物科技有限公司);蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(G1120)、放射免疫沉淀測(cè)定(RIPA)高效蛋白裂解液(R0010)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒(PC0020)、電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(SW2010,北京索萊寶生物技術(shù)有限公司);PI3K(4292S)、Akt(9272S)、p-Akt(9271S)一抗、羊抗兔IgG二抗(7074S)購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器 PI-400無(wú)創(chuàng)血糖儀(廣州菲康生物技術(shù)有限公司);OLYMPUS IX53顯微鏡(日本OLYMPUS公司);JY04S-3C凝膠成像分析系統(tǒng)(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)。

1.4模型建立與分組給藥 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、柴胡皂苷A低、中、高劑量組各10只。對(duì)照組飼喂普通飼料,其余5組飼喂高脂飼料,連續(xù)飼喂4 w,自由飲水。第5周開(kāi)始,除對(duì)照組外,其余5組給予腹腔注射STZ,連續(xù)注射3 d,誘導(dǎo)T2DM模型,以空腹血糖(FBG)>11.1 mmol/L為建模成功〔9〕。建模成功后給藥,參照文獻(xiàn)〔10〕進(jìn)行等效劑量換算,陽(yáng)性對(duì)照組給予鹽酸二甲雙胍溶液250 mg/kg〔11〕灌胃;柴胡皂苷A低、中、高劑量組分別給予5、10、20 mg/kg〔12〕柴胡皂苷A溶液灌胃;對(duì)照組與模型組給予等體積生理鹽水灌胃,每日1次,連續(xù)給藥4 w。

1.5胰島素耐量實(shí)驗(yàn) 給藥15 d后禁食12 h,其間不禁水,腹腔注射胰島素溶液2 U/kg,分別在0、30、60和120 min時(shí)取尾靜脈血,測(cè)定血糖值(Glu),并計(jì)算血糖-時(shí)間曲線下面積(AUC)。AUC=0.5×(Glu0 min+Glu30 min)/2+0.5×(Glu30 min+Glu60 min)/2+1×(Glu60 min+Glu120 min)/2。

1.6小鼠血清FBG、FINS的測(cè)定及胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)的計(jì)算 給藥結(jié)束后禁食12 h,麻醉小鼠,眼球取血,離心分離血清,采用血糖儀檢測(cè)各組小鼠FBG,ELISA檢測(cè)FINS含量,計(jì)算HOMA-IR。HOMA-IR=(FBG×FINS)/22.5。

1.7小鼠肝組織病理學(xué)變化的觀察 處死小鼠,取出肝臟,清洗擦干,經(jīng)4%多聚甲醛固定后進(jìn)行梯度酒精脫水、石蠟包埋、切片,進(jìn)行HE染色,顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。

1.8小鼠肝組織中TG、TC及FFA的檢測(cè) 肝組織與生理鹽水按照1∶9的比例制備勻漿,離心后取上清,按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作,檢測(cè)肝組織中TC、TG、FFA含量。

1.9小鼠肝組織中PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè) 處死小鼠,分離肝組織,加入RIPA高效蛋白裂解液,離心后取上清,采用BCA法檢測(cè)總蛋白濃度。取30 μg蛋白上樣,進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜,5%脫脂牛奶封閉,加入稀釋好的PI3K、Akt、p-Akt、β-actin一抗,4 ℃孵育,加入稀釋好的二抗,室溫孵育,TBST洗膜,采用ECL法顯色,以β-actin為內(nèi)參,運(yùn)用凝膠成像分析系統(tǒng)分析灰度值,計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1柴胡皂苷A對(duì)T2DM小鼠糖代謝功能的影響 與對(duì)照組比較,模型組AUC明顯升高(P<0.05);與模型組比較,陽(yáng)性對(duì)照組與柴胡皂苷A各劑量組AUC均顯著降低(P<0.05),且柴胡皂苷A各劑量組間具有劑量效應(yīng)(P<0.05);與陽(yáng)性對(duì)照組比較,柴胡皂苷A低、中劑量組AUC顯著升高(P<0.05),柴胡皂苷A高劑量組具有降低趨勢(shì),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.2柴胡皂苷A對(duì)T2DM小鼠胰島素抵抗的影響 與對(duì)照組比較,模型組血清中FBG、FINS含量及HOMA-IR明顯升高(P<0.05);與模型組比較,陽(yáng)性對(duì)照組與柴胡皂苷A各劑量組上述指標(biāo)顯著降低(P<0.05),柴胡皂苷A不同劑量組間也具有顯著差異(P<0.05);與陽(yáng)性對(duì)照組比較,柴胡皂苷A低、中劑量組FBG、FINS含量與HOMA-IR均顯著升高(P<0.05),柴胡皂苷A高劑量組有降低的趨勢(shì),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.3柴胡皂苷A對(duì)T2DM小鼠肝組織脂代謝相關(guān)指標(biāo)的影響 與對(duì)照組比較,模型組肝組織中TG、TC、FFA含量顯著增加(P<0.05);與模型組比較,陽(yáng)性對(duì)照組與柴胡皂苷A各劑量組肝組織中TG、TC、FFA含量顯著減少(P<0.05),柴胡皂苷A不同劑量組間也具有顯著差異(P<0.05);與陽(yáng)性對(duì)照組比較,柴胡皂苷A高劑量組肝組織中上述指標(biāo)有降低趨勢(shì),但差異不顯著(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組AUC、FBG、FINS含量與HOMA-IR、TG、TC、FFA含量比較

2.4柴胡皂苷A對(duì)T2DM小鼠肝組織病理學(xué)變化的影響 由HE染色結(jié)果可知,對(duì)照組肝組織結(jié)構(gòu)完整,肝細(xì)胞排列有序,無(wú)病變現(xiàn)象。模型組肝組織結(jié)構(gòu)異常,細(xì)胞排列紊亂,肝細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性;柴胡皂苷A低、中劑量組肝細(xì)胞排列稍凌亂,細(xì)胞出現(xiàn)水腫變性情況;陽(yáng)性對(duì)照組與柴胡皂苷A高劑量組細(xì)胞呈肝索狀排列,未發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞水腫,少量肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性。見(jiàn)圖1。

圖1 各組肝組織病理(HE染色,×200)

2.5柴胡皂苷A對(duì)T2DM小鼠肝組織中PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較,模型組肝組織中PI3K表達(dá)和p-Akt/Akt顯著降低(P<0.05);與模型組比較,陽(yáng)性對(duì)照組肝組織中PI3K表達(dá)和p-Akt/Akt顯著升高(P<0.05),柴胡皂苷A各劑量組隨著劑量升高,肝組織中PI3K表達(dá)和p-Akt/Akt明顯升高(P<0.05);與陽(yáng)性對(duì)照組比較,柴胡皂苷A低、中劑量組肝組織中PI3K表達(dá)和p-Akt/Akt顯著降低(P<0.05),柴胡皂苷A高劑量組上述指標(biāo)有升高趨勢(shì),但差異不顯著(P>0.05)。見(jiàn)圖2、表2。

1～6:對(duì)照組,模型組,陽(yáng)性對(duì)照組,柴胡皂苷A低、中、高劑量組圖2 各組肝組織中PI3K、p-Akt、Akt表達(dá)

表2 各組肝組織中PI3K表達(dá)和p-Akt/Akt比較

3 討 論

T2DM是一種由高血糖、胰島素抵抗及胰島素缺乏引起的慢性疾病,嚴(yán)重時(shí)引發(fā)多種器官受損,影響患者生命健康,加重社會(huì)負(fù)擔(dān)〔13〕。胰島素抵抗是T2DM的主要病理特征,是指在機(jī)體中胰島素與其受體結(jié)合過(guò)程受阻,導(dǎo)致機(jī)體葡萄糖與脂質(zhì)代謝紊亂,最終造成T2DM的發(fā)生〔14〕。本研究結(jié)果提示,T2DM小鼠發(fā)生胰島素抵抗,導(dǎo)致肝臟受損。

中醫(yī)學(xué)表示〔15〕,T2DM發(fā)生的主要病理機(jī)制為長(zhǎng)期飲食不節(jié)導(dǎo)致脾虛肝郁、痰熱互結(jié)。研究證實(shí)〔16,17〕,中草藥在治療T2DM過(guò)程中發(fā)揮了良好的降糖效果,有望替代副作用大的西藥,成為T2DM治療的新型藥物。中藥柴胡具有疏肝解郁的功效〔18〕,柴胡皂苷A作為柴胡的主要生物活性成分之一,研究證實(shí)其具有保肝護(hù)肝的作用〔19,20〕。另外有研究發(fā)現(xiàn)〔21〕,柴胡皂苷A對(duì)于高脂血癥引起的機(jī)體損傷也具有抗炎、抗病毒作用。本研究結(jié)果提示,柴胡皂苷A能夠改善胰島素抵抗,保護(hù)肝臟。并且柴胡皂苷A高劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組比較,各個(gè)指標(biāo)均有改善趨勢(shì)。

PI3K/Akt信號(hào)通路在T2DM胰島素抵抗過(guò)程中起連接作用,能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖生長(zhǎng)、糖類與脂質(zhì)代謝等生理過(guò)程〔22〕。正常情況下,胰島素與其受體結(jié)合,激活PI3K/Akt信號(hào)通路,發(fā)揮調(diào)節(jié)葡萄糖平衡的作用,改善血糖穩(wěn)態(tài)和胰島素抵抗〔23〕。本研究提示,PI3K/Akt信號(hào)通路激活受阻,導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)糖脂代謝異常和胰島素抵抗;柴胡皂苷A可能通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路,改善血糖代謝及胰島素抵抗。

綜上所述,柴胡皂苷A能夠調(diào)節(jié)血糖代謝、胰島素濃度,改善胰島素抵抗,其作用機(jī)制可能與激活PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。本研究結(jié)果為今后中藥治療T2DM提供了新的依據(jù)和理論基礎(chǔ)。