復方黃柏液調節NF-κB/MAPK信號通路對皮膚潰瘍大鼠炎癥反應的影響

蔣曉蕾 朱立宏

(武漢市中醫醫院中醫皮膚科,湖北 武漢 430014)

皮膚潰瘍病因復雜、病程較長、且易反復發作,嚴重影響患者生活及工作〔1〕。近來研究發現,皮膚持續的炎癥反應,是導致新生結締組織改建失敗、表皮細胞爬行困難,創面愈合減慢的主要原因〔2〕。中醫藥在抗炎、促進創面愈合方面有潛在療效〔3〕。復方黃柏液具有消腫化腐、清熱解毒、抗炎、抗菌等作用,近來臨床研究發現其可有效控制炎癥,治療慢性創面愈合不良有效率達70.37%〔4〕,預示其在皮膚潰瘍治療方面有潛在價值,但其促進皮膚創面愈合的分子機制還不甚清楚。核轉錄因子(NF)-κB被稱為炎癥調控的開關,其轉錄入核活化可促進炎癥因子轉錄釋放〔5〕。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)可將胞外炎癥信號傳遞到胞內,并誘導成纖維細胞、內皮細胞、表皮細胞等增殖、分化后向傷口處運動,刺激多種生長因子分泌,來促進肉芽新生及潰瘍愈合〔6〕。本研究從NF-κB/MAPK通路探究復方黃柏液對皮膚潰瘍大鼠炎癥反應的影響。

1 材料和方法

1.1實驗材料 SPF級雄性SD大鼠90只,7周齡,體質量200～220 g,購自中國醫學科學院醫學實驗動物研究所;生產許可證號:SCXK(京)2021-0004。本試驗符合3R原則并經本院倫理委員會批準ICAU-20210908112。復方黃柏液(含連翹、黃柏、金銀花、蒲公英、蜈蚣成分,貨號:202106140003,購自山東漢方制藥有限公司,規格100 ml);NF-κB阻斷劑吡咯烷二硫代氨基甲酸銨(PDTC,貨號:GJ50622,上海圻明生物科技有限公司);MAPK阻斷劑(SB203580,貨號:S1076,美國MCE公司);蘇木素-伊紅(HE)染色液(貨號:YT8310,北京伊塔生物科技有限公司);NF-κB磷酸化蛋白(p-NF-κB)、MAPK磷酸化蛋白(p-MAPK)、NF-κB、MAPK、絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶(MKP)-1、血管內皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維生長因子(bFGF)、轉分化生長因子(TGF)-β抗體均購自美國abcam公司。

1.2模型建立及分組 取SD大鼠,參照文獻〔7〕剃去背部面積4 cm×4 cm的長毛,無菌條件下剪去皮膚,深達筋膜,股肌注射氫化可的松注射液(60 mg/kg),并于筋膜下噴灑金黃色葡萄球菌(1 ml/只),醫用紗布覆蓋創面,橡皮膏包扎固定,并隨機分為:模型組、復方黃柏液組、NF-κB阻斷劑組、MAPK阻斷劑組、復方黃柏液+MAPK阻斷劑組,每組15只。另取15只大鼠,僅在相應部位將皮瓣分離,原位縫合作為假手術組。各組均于造模手術后第2天開始給藥,復方黃柏液組參照文獻〔8〕用鹽水棉球清潔創面后,用與創面相仿的無菌紗布覆蓋創面,無菌注射器抽取藥液(約3 ml)注于紗布內,以紗布浸透,藥液未溢出為度,透明薄膜敷貼包扎后無菌紗布包裹固定,每天換藥2次;NF-κB阻斷劑組及MAPK阻斷劑組參照文獻〔9〕分別經腹腔注射PDTC 120 mg/kg及SB203580 10 mg/kg進行干預治療,1次/d;復方黃柏液+MAPK阻斷劑組腹腔注射SB203580 10 mg/kg的同時,給予復方黃柏液進行干預治療;模型組用無菌紗布浸透生理鹽水后包裹固定創面。各組連續給藥4 w。

1.3潰瘍面積及創面愈合率檢測 各組給藥結束后,卡尺測量潰瘍面積;用透明膜覆創面畫膜、剪膜,并換算成面積,計算創面愈合率,創面愈合率=(給藥前創面面積-未愈合創面面積)/給藥前創面面積×100%。

1.4HE染色觀察創面病理變化 肉眼觀察創面形態,隨機取6只大鼠,麻醉處死后,取創面,置于多聚甲醛溶液固定24 h,制成厚為5 μm的石蠟切片,置于光鏡下觀察組織形態變化。

1.5免疫組化法檢測p-NF-κB、p-MAPK陽性表達 取創面石蠟切片,脫蠟、透化、抗原修復后,滴加1∶100的兔抗大鼠p-NF-κB、p-MAPK一抗抗體孵育24 h,滴加山羊抗兔IgG(1∶400)二抗抗體孵育20 min,二氨基聯苯胺(DAB)顯色,光鏡下觀察拍照,Image-Pro Plus6.0軟件分析單位面積內陽性染色的平均光密度值(MD)。

1.6酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測創面組織炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1β、IL-8水平 剩余9只大鼠,處死后取創面組織,粉碎勻漿后取勻漿液,按ELISA試劑盒說明書方法檢測TNF-α、IL-1β、IL-8水平。

1.7Western印跡檢測創面組織蛋白表達 取創面組織勻漿液,提取胞質及胞核蛋白,二喹啉甲酸(BCA)法檢測蛋白濃度,取40 μg蛋白行電泳、轉膜操作,滴加1∶600的兔抗大鼠NF-κB、p-NF-κB、MAPK、p-MAPK、MKP-1、VEGF、bFGF、TGF-β一抗及1∶900的內參β-actin抗體孵育24 h,滴加山羊抗兔IgG二抗(1∶1 500)孵育45 min,增強化學發光液顯色,ImageJ軟件分析條帶灰度值。

1.8統計學分析 采用SPSS24.0軟件進行t檢驗、方差分析,組間多重比較用SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1復方黃柏液對大鼠潰瘍面積及創面愈合率的影響 與假手術組相比,模型組潰瘍面積明顯升高,創面愈合率明顯降低(P<0.05)。與模型組相比,復方黃柏液組及NF-κB阻斷劑組潰瘍面積明顯減小,創面愈合率明顯升高(P<0.05);MAPK阻斷劑組潰瘍面積明顯增大,創面愈合率明顯降低(均P<0.05)。與復方黃柏液組相比,MAPK阻斷劑組、復方黃柏液+MAPK阻斷劑組潰瘍面積明顯增大,創面愈合率明顯降低(均P<0.05),見表1。

表1 各組潰瘍面積及創面愈合率比較

2.2復方黃柏液對大鼠創面組織病理變化的影響 肉眼可見假手術組創面肉芽組織、纖維排列整齊,筋膜內有豐富的毛細血管網;模型組創面有大量滲出液,氣味腥臭,創面顏色晦暗,筋膜內毛細血管網稀少。復方黃柏液組及NF-κB阻斷劑組創面滲出液減少,創面顏色鮮紅,肉芽組織及毛細血管網形成較多。MAPK阻斷劑組滲出液較模型組增多,筋膜內幾乎未見毛細血管網。復方黃柏液+MAPK阻斷劑組創面滲出液及顏色變化較模型組相近。

HE染色可見,假手術組創面有表皮新生且結構完整,表皮層下可見成纖維細胞及膠原纖維增多、炎性細胞散在分布,毛細血管豐富;模型組及復方黃柏液+MAPK阻斷劑組創面雖有新生表皮,但未覆蓋創面,表皮上有痂皮,炎性細胞聚集增多,痂皮下組織液增多,真皮層中毛細血管和膠原纖維較少。復方黃柏液組及NF-κB阻斷劑組創面有角質層、棘層和基底層新生,成纖維細胞和炎性細胞散在分布于基底層下,毛細血管豐富且膠原纖維較多,但形狀較細,沒有交織成網。MAPK阻斷劑組創面組織液形成的痂皮中炎性細胞聚集增多,毛細血管和膠原纖維形成最少,見圖1。

圖1 各組創面組織(HE染色,×100)

2.3復方黃柏液對大鼠創面組織p-NF-κB及p-MAPK陽性表達的影響 免疫組化染色可見假手術組創面組織p-NF-κB陽性(紅棕色)表達較淺,p-MAPK陽性表達加深。與假手術組相比,模型組p-NF-κB陽性表達明顯升高,p-MAPK陽性表達明顯降低(P<0.05)。與模型組相比,復方黃柏液組及NF-κB阻斷劑組p-NF-κB陽性表達明顯降低,p-MAPK陽性表達升高;MAPK阻斷劑組p-NF-κB陽性表達明顯升高,p-MAPK陽性表達明顯降低(均P<0.05)。與復方黃柏液組相比,MAPK阻斷劑組、復方黃柏液+MAPK阻斷劑組p-NF-κB陽性表達明顯升高,p-MAPK陽性表達明顯降低(P<0.05),見圖2、表2。

圖2 各組創面組織p-NF-κB及p-MAPK(免疫組化染色,×400)

2.4復方黃柏液對大鼠創面組織炎癥因子表達的影響 與假手術組相比,模型組創面組織TNF-α、IL-1β、IL-8表達明顯升高(P<0.05)。與模型組相比,復方黃柏液組及NF-κB阻斷劑組創面組織TNF-α、IL-1β、IL-8表達明顯降低;MAPK阻斷劑組創面組織TNF-α、IL-1β、IL-8表達明顯升高(均P<0.05)。與復方黃柏液組相比,復方黃柏液+MAPK阻斷劑組、MAPK阻斷劑組創面組織TNF-α、IL-1β、IL-8表達明顯升高(P<0.05),見表2。

表2 各組創面組織p-NF-κB及p-MAPK陽性表達、TNF-α、IL-1β、IL-8表達比較

2.5復方黃柏液對大鼠創面組織NF-κB及MAPK通路蛋白、生長因子蛋白表達的影響 與假手術組相比,模型組創面組織p-NF-κB/NF-κB、MKP-1蛋白表達明顯升高,p-MAPK/MAPK、VEGF、bFGF、TGF-β蛋白表達明顯降低(均P<0.05)。與模型組相比,復方黃柏液組及NF-κB阻斷劑組創面組織p-NF-κB/NF-κB、MKP-1蛋白表達明顯降低,p-MAPK/MAPK、VEGF、bFGF、TGF-β蛋白表達明顯升高;MAPK阻斷劑組創面組織p-NF-κB/NF-κB、MKP-1蛋白表達明顯升高,p-MAPK/MAPK、VEGF、bFGF、TGF-β蛋白表達明顯降低(均P<0.05)。與復方黃柏液組相比,MAPK阻斷劑組、復方黃柏液+MAPK阻斷劑組p-NF-κB/NF-κB、MKP-1蛋白表達明顯升高,p-MAPK/MAPK、VEGF、bFGF、TGF-β蛋白明顯降低(均P<0.05)。見表3、圖3。

表3 各組創面組織各蛋白表達比較

1～6:假手術組、模型組、復方黃柏液組、NF-κB阻斷劑組、MAPK阻斷劑組、復方黃柏液+MAPK阻斷劑組圖3 各組創面組織p-NF-κB、NF-κB、MKP-1、p-MAPK、MAPK、VEGF、bFGF、TGF-β蛋白表達

3 討 論

皮膚潰瘍后創面修復及愈合困難是臨床的一大難題〔10〕。研究發現,創面愈合涉及炎癥反應、肉芽組織形成、新生結締組織沉積及改建等3個過程〔11〕。其中炎癥反應過程是創面正常愈合的第一個也是非常重要的階段,其可溶解及清除壞死組織及滲出物,為肉芽組織形成奠定基礎,但炎癥反應過激,也會殺傷正常細胞,降解結締組織中的膠原,而不利于創面愈合〔12〕。Panek-Jeziorna等〔13〕發現,慢性難愈合性皮膚潰瘍患者滲出液或血清中存在IL-1β、IL-8、TNF-α等炎癥因子釋放增多現象,提示炎癥反應過激,可能是皮膚潰瘍后愈合速度減慢的關鍵因素。

已有研究發現,抑制炎癥因子大量釋放及滲入周圍組織,可加快肉芽組織形成,促進潰瘍愈合〔14〕。復方黃柏液是由黃柏、連翹、金銀花、蒲公英等藥物組成,具有清熱解毒、祛腐生肌、殺菌止癢等功效,因其具有抗菌、抗感染、抗炎、促傷口愈合等藥理作用,而被應用于濕疹、痤瘡、帶狀皰疹等皮膚病的治療〔15〕。李友山等〔16〕臨床研究,發現復方黃柏液可促進糖尿病足部潰瘍患者TNF-α及IL-1等炎癥因子的釋放,升高VEGF及表皮生長因子(EGF)表達而促進潰瘍愈合,提示復方黃柏液可能為治療皮膚潰瘍的潛在藥物。本研究結果證實,復方黃柏液可促進潰瘍愈合。

NF-κB被稱為炎癥的總開關,其磷酸化入核活化,可誘導IL-1β、IL-8、TNF-α等炎癥因子的轉錄及表達,而介導炎癥信號的傳導,并能誘導T細胞、樹突狀細胞表達MKP-1來吞噬受損或感染細菌的細胞〔17〕。但MKP-1同時也是MAPK的負性調節因子,可通過去磷酸化作用,使p-MAPK活性失活〔18〕。MAPK磷酸化活性升高已被證實可促進生長因子如VEGF、bFGF、TGF-β等表達來誘導血管新生、肉芽組織形成及表皮再生修復〔19,20〕。李多等〔21〕研究發現復方黃柏液可通過抑制p-NF-κB表達來降低潰瘍性結腸炎大鼠腸黏膜炎癥損傷。本研究結果提示,復方黃柏液促進皮膚潰瘍愈合作用,可能與抑制NF-κB介導的炎癥反應活化,升高MAPK磷酸化活化介導的生長因子表達有關。MAPK阻斷劑可部分減弱復方黃柏液發揮的抗炎、促生長因子表達及抗潰瘍等作用。

綜上,NF-κB與MAPK之間的聯系較為復雜且爭議較多。復方黃柏液通過何種途徑調控NF-κB炎癥及MAPK促生長因子表達,發揮抗潰瘍作用,還需進一步探討及驗證。