百香果果皮總黃酮對D-半乳糖所致衰老小鼠海馬的影響

黃彥峰 張麗鳳 黃永毅 龐文杰

(右江民族醫學院,廣西 百色 53000)

隨著全球人口老齡化進程的加劇,人們對抗衰老功能食品的需求越來越大,抗衰老已成為研究領域關注的熱點。百香果又稱西番蓮、巴西果、雞蛋果,是西番蓮科(Passiflor aceae)植物果實,有“果汁之王”的美譽,是一種典型的藥食同源的高品質水果,具有很高的藥用價值和食用價值〔1〕。國內外對百香果化學成分研究較多,對其的果實、果汁、果皮、種籽都有研究,它們含有的化學成分主要為酚類、黃酮苷類、生物堿等,具有多種藥理活性〔2～4〕,但目前百香果果皮總黃酮對D-半乳糖所致衰老小鼠海馬的影響研究少有報道。Simirgiotis 等〔5〕研究發現百香果果皮中黃酮類化合物的含量是果肉(汁)的1.81 倍,豐富的生物活性成分使其具有抗炎、抗氧化、抗皮膚衰老、降血壓等作用〔6〕。黃酮類化合物可作為信號分子、衰老基因及信號通路延緩衰老。課題組前期研究發現,百香果果汁有較好的延緩衰老的作用。本文采用D-半乳糖建立衰老模型小鼠,探討百香果果皮總黃酮對衰老小鼠海馬的影響。為百香果的藥用開發及尋找延緩腦衰老的方法提實驗依據。

1 材料與方法

1.1主要藥物及試劑 兔抗鼠B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)多克隆抗體、兔抗鼠Bcl-2相關X蛋白(Bax)多克隆抗體均購于Bioss公司(貨號Bs0127r,Bs0032r),兔抗鼠半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3 多克隆抗體(購于Affinity公司,貨號AF7022);超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乙酰膽堿(ACh)、單胺類神經遞質催化酶(MAO)試劑盒均購于南京建成生物工程研究所(貨號分別為A001-3,A003-1,A105-1-1,A034-1-1);維生素C(國藥準字H4103317,遂成藥業股份有限公司);D-半乳糖(solarbio公司,貨號301L052);百香果(廣西百色市售)。

1.2主要儀器與設備成像系統(日本OLYMPUS),圖像分析軟件(美國Media Cybernetics 公司Image-Pro Plus),光學顯微鏡(日本OLYMPUS),PAT-8M 小鼠避暗實驗系統(成都泰盟軟件有限公司),酶標儀(Tristar LB 941 德國),離心機(北京離心機廠)。

1.3百香果果皮總黃酮的提取〔7〕稱取百香果果皮粉末200 g→加70%乙醇3 000 ml→超聲波提取(提取時間2 h,提取溫度60 ℃,超聲功率為100 W)→ 減壓抽濾→旋轉蒸發濃縮至200 ml即得母液(1 g/ml)。置于4 ℃冰箱保存,用時稀釋成相應濃度。本實驗以蘆丁為對照品,采用回歸方程計算百香果果皮總黃酮含量為2.938 mg/g。

1.4實驗動物分組及給藥 SPF級小鼠60只,雌雄各半,體質量24～28 g,由右江民族醫學院動物實驗中心提供,合格證號:SCXK(湘)2019-0014。將小鼠隨機分為6組:空白組,模型組、陽性組(100 mg/kg維生素C)、百香果果皮總黃酮高(1.00 g/kg)、中(0.50 g/kg)、低(0.25 g/kg)組。空白組小鼠每日腹腔注射生理鹽水,其余小鼠每日腹腔注射D-半乳糖(500 mg/kg),腹腔注射的同時,空白組和模型組每日灌胃同體積蒸餾水,其余各組均灌胃同體積相應劑量的藥液,小鼠均按0.1 ml/10 g的劑量給藥,每日1次,連續42 d。

1.5學習和記憶能力測試 避暗實驗分為訓練和正式兩個階段,給藥第40天進行訓練測試,訓練時將小鼠頭背著洞口放入明室適應3 min,暗室的避暗儀底部通36 V,50 Hz交流電,小鼠進入暗室就會受電擊,正確的反應是逃往明室,此過程為訓練測試,以此反映的學習能力。24、48 h 后(給藥的第41、42天)分別對小鼠進行測試,記錄5 min內小鼠進入暗室的次數(即為錯誤次數),第1次進入暗室的時間(即避暗潛伏期),以此反映小鼠的記憶能力。

1.6生化指標檢測 避暗實驗結束后頸椎脫臼處死小鼠,剖腹取小鼠全腦組織加入9 倍體積的冰凍生理鹽水,制備10%的組織勻漿液,離心取上清液,用酶標儀按照試劑說明書測定其吸光度,計算小鼠腦組織中SOD、MDA、ACH、MAO含量。

1.7觀察腦組織海馬區的病理形態學變化 取出腦組織在冰盒上剝離海馬組織,用10%甲醛固定,常規石蠟包埋,切片,蘇木素-伊紅(HE)染色,光鏡下觀察病理組織學改變。

1.8檢測海馬組織中Bax、Bcl-2、Caspase-3的表達 取1.7中蠟塊切片后放入檸檬酸修復液高壓修復,清洗,加一抗工作液4 ℃過夜,第2天磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次,加二抗工作液,37 ℃孵育30 min,二氨基聯苯胺(DAB)顯色,蘇木素復染、分化、反藍。在顯微鏡下觀察,依據陽性免疫反應判斷陽性細胞表達,應用計算機圖像處理系統及分析軟件進行圖像分析。依據陽性免疫反應的圖像選取陽性表達區域,以人機交互方式測定陽性免疫染色強度及面積,結果以平均光密度值表示。

1.9統計學方法 采用SPSS26.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1避暗實驗測定百香果果皮總黃酮對衰老小鼠學習和記憶能力的影響 由表1可知,與空白組比較,模型組避暗潛伏期顯著縮短(P<0.01),錯誤次數明顯增加(P<0.05);與模型組比較,陽性組及百香果果皮總黃酮高、中、低組避暗潛伏期明顯延長(P<0.01),錯誤次數明顯減少(P<0.05)。表明在避暗實驗中,百香果果皮總黃酮能改善衰老小鼠的學習和記憶能力。

表1 避暗實驗測定百香果果皮總黃酮對衰老小鼠學習和記憶能力的影響

2.2百香果果皮總黃酮對衰老小鼠腦組織SOD、MDA、MAO、ACH含量的影響 由表2可知,與空白組比較,模型組腦組織的SOD、ACH含量顯著下降(P<0.01),MDA、MAO含量顯著上升(P<0.01);與模型組比較,陽性組及百香果果皮總黃酮高、中、低組腦組織的SOD、ACH活力明顯上升(P<0.05,P<0.01),MDA、MAO含量顯著下降(P<0.01)。說明百香果果皮總黃酮可能是通過提高小鼠腦組織的SOD、ACH活力,降低MDA、MAO含量而發揮抗衰老作用。

2.3百香果果皮總黃酮對衰老小鼠海馬組織Bax、Bcl-2、Caspase-3表達的影響 由表2、圖1～3可知,與空白組比較,模型組海馬區Bax、Caspase-3 陽性細胞表達明顯增加(P<0.05),Bcl-2陽性細胞表達明顯下降(P<0.05);與模型組比較,除百香果果皮總黃酮低組Caspase-3差異無統計學意義外,陽性組及百香果果皮總黃酮高、中、低組海馬組織上述指標差異均有統計學意義(P<0.05,P<0.01)。表明百香果果皮總黃酮能減少海馬區細胞死亡的數量,改善衰老小鼠學習記憶能力,可能與上調Bcl-2 陽性細胞表達、下調Bax、Caspase-3 陽性細胞表達有關。

表2 百香果果皮總黃酮對衰老小鼠腦組織SOD、MDA、MAO、ACH含量及組織Bax、Bcl-2、Caspase-3表達的影響

圖1 百香果果皮總黃酮對衰老小鼠腦組織海馬區Bax的表達(HE染色,×400)

2.4百香果果皮總黃酮對衰老小鼠腦組織海馬區病理形態學的影響 由圖4可知,空白組海馬區神經元細胞整體形態結構正常,CA1區錐體細胞排列整齊,染色均勻,無明顯凋亡及壞死,無空泡樣變性,無炎細胞浸潤。模型組海馬區神經元細胞損傷較嚴重,CA1區細胞排列紊亂,染色不均勻,出現明顯空泡狀結構,大量神經元固縮,凋亡;出現少量炎細胞浸潤。與模型組比較,陽性組、百香果果皮總黃酮高、中、低組小鼠海馬區神經元細胞損傷較輕,CA1區細胞排列略顯紊亂,有少量空泡狀結構,少量神經元固縮,凋亡;整體損傷較模型組減輕,無明顯炎細胞浸潤。神經元細胞結構有改善,表明百香果果皮總黃酮對衰老小鼠腦組織海馬CA1 區細胞具有保護作用。

圖2 百香果果皮總黃酮對衰老小鼠腦組織海馬區Caspase-3的表達(HE染色,×400)

圖3 百香果果皮總黃酮對衰老小鼠腦組織海馬區Bcl-2的表達(HE染色,×400)

圖4 百香果果皮總黃酮對衰老小鼠腦組織海馬區病理形態學的影響(HE,染色×400)

3 討 論

衰老是機體各組織、器官功能隨年齡增加而發生的退行性變化,生理功能逐漸衰退,機體抵御外界傷害和恢復體內平衡的能力都下降。目前,衰老的確切機制還不明確,存在多種學說,自由基學說是被科學家認可的衰老學說之一。自由基學說認為機體內的抗氧化防御與自身產生的自由基在正常生理條件下維持相對平衡,而機體衰老過程會產生超出機體抗氧化能力大量自由基,使體內自由基的產生和機體的抗氧化防御之間產生不平衡,這被稱為氧化應激,可導致細胞受損甚至死亡,同時氧化應激還會隨著衰老而加重〔8～10〕。SOD 是機體內重要的抗氧化酶,能夠清除機體內多余自由基〔11〕。MDA 是體內不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應的產物,常作為評價細胞和器官衰老的重要指標〔12〕。大腦組織需氧量大,抗氧化能力弱且對氧化應激損傷較敏感,會隨著機體衰老程度對氧化應激損傷敏感性增強〔13〕,本實驗結果提示百香果果皮總黃酮能有效提高衰老小鼠體內抗氧化酶含量,減弱因自由基增多而發生氧化應激,延緩機體衰老進程。

衰老常伴學習和記憶能力的下降,學習是神經系統接受外界環境改變而獲得新行為、經驗的過程,記憶是學習后經驗的識記、保持和再現,因此學習和記憶是有聯系的神經過程,有賴于全腦功能的整合〔14〕。ACH是膽堿能系統重要的神經遞質,隨年齡的增長其含量會下降,大腦組織中ACH 含量高可增強學習與記憶能力〔15〕。MAO廣泛存在于肝、腎、腦等組織中,體內含量升高可提升體內H2O2濃度,對大腦海馬神經元造成損傷,導致大腦的學習、記憶和認知功能有不同程度的減退〔16〕。目前建立記憶損傷模型方法較多,但避暗實驗是最常用的動物學習記憶實驗方法。本實驗提示百香果果皮總黃酮能提高衰老小鼠學習記憶能力,干預衰老進程。學習記憶以神經元為物質基礎,海馬的結構及功能跟學習記憶能力密切相關,海馬神經元衰老或丟失嚴重影響學習與記憶能力。細胞凋亡在腦的發育過程起重要的作用。誘導細胞凋亡的細胞因子很多,其中抗凋亡基因(如Bcl-2)和促凋亡基因(如Bax)是這個家族中的重要成員。Bax表達過量,形成同源二聚體Bax/Bax,可促進細胞凋亡;Bcl-2表達過量,形成異源二聚體Bcl-2/Bax,可促進細胞周期和細胞增殖,從而抑制細胞凋亡〔17〕。Caspase-3 是 Caspase下游關鍵的凋亡執行蛋白酶,在細胞凋亡過程中起重要作用〔18〕。本文結果提示百香果果皮總黃酮能通過促進細胞周期和細胞增殖,抑制細胞凋亡,能拮抗D-gal 所致衰老小鼠海馬損傷,從而延緩海馬衰老。

綜上所述,百香果果皮總黃酮能改善衰老小鼠的學習記憶能力,能減輕衰老小鼠的氧化應激反應,能改善海馬組織CA1 區神經元細胞結構、抑制海馬神經細胞凋亡,推測其機制可能與抑制氧化應激及上調Bcl-2 、下調Bax及Caspase-3 表達有關。具體的抗衰老作用機制,還需要進一步研究。