SGLT-2抑制劑通過Nrf2/HO-1信號通路對2型糖尿病合并高血壓大鼠動脈重構的干預作用

龐雅平 韓梅 董帥 姜蘭葉

(河北北方學院附屬第二醫院 1內分泌科,河北 張家口 075100;2手術室;3急診科)

2型糖尿病合并高血壓對心腦血管的危害有協同效應,其中高血壓極有可能誘發糖尿病心腦血管和微血管并發癥〔1,2〕。臨床上2型糖尿病合并高血壓患者多伴隨發生心腦血管疾病,并伴有視網膜病變、腎臟病變的發生與發展,患者大腦和中樞神經系統功能也會發生異常,腦卒中的風險也顯著增加〔3,4〕。鈉-葡萄糖協同轉運蛋白(SGLT)-2抑制劑阻滯腎臟重吸收葡萄糖進程,使尿液中含過量的葡萄糖,從而降低其在血液中的濃度,是一類新型抗糖尿病藥物〔5,6〕。研究表明,SGLT-2抑制劑能有效控制糖尿病患者的血糖水平,對其腎臟和心血管系統具有顯著的保護作用,并降低腎損傷和不良事件的發生率〔7,8〕,但其是否能對2型糖尿病合并高血壓患者發揮干預作用尚不清晰。核因子-E2相關因子(Nrf)2/血紅素氧合酶(HO)-1信號通路在糖尿病并發癥中具有多重作用,可以通過核因子(NF)-κB介導的睪丸凋亡和炎癥對糖尿病誘導的大鼠生殖損傷的保護作用〔9〕,其表觀遺傳修飾對糖尿病心血管并發癥具有調控作用〔10〕,但Nrf2/HO-1信號通路在2型糖尿病合并高血壓中的作用尚不清晰。本研究擬通過建立2型糖尿病合并高血壓大鼠模型,探討SGLT-2抑制劑通過Nrf2/HO-1信號通路對基底動脈重構發揮的干預作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選擇北京科興中維生物技術有限公司提供的SPF級雄性自發性高血壓大鼠(SHR)40 只和SHR遺傳背景相同的 Wistar-Kyoto(WKY)大鼠15只,均為7～8周齡,平均體質量(220±20)g,使用許可〔SYXK(京)2020-0054〕,飼養大鼠的溫濕度分別為(25±2)℃和(50±5)%,光照間隔12 h。待大鼠適應環境1 w后,進行試驗。

1.2主要試劑和儀器 鏈脲佐菌素(STZ)、蘇木素和伊紅購于美國Sigma公司;包埋劑(OCT)購于北京普利萊基因技術有限公司;組織蛋白裂解液、十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺試劑盒均購于江蘇碧云天有限公司;戊巴比妥鈉(99%,規格100 g)購于天津化學試劑研究所有限公司;血糖儀購于美國Jhonson醫療器械有限公司;實驗動物手術器械購于玉研儀器公司;SYD-K2080切片機購于沈陽譽德電子儀有限公司;H07000FA型透射電子顯微鏡購于日本日立公司;Western印跡電泳儀購于美國Bio-Rad公司。

1.3大鼠模型建立 SHR高糖高脂飲食聯合STZ建立2型糖尿病合并高血壓大鼠模型,SHR高糖髙脂飼料喂養2 w,禁食12 h,腹腔一次性注射STZ 35 mg/kg,1 w后,空腹12 h,使用血糖儀大鼠尾血的血糖水平,造模成功標準為血糖≥16.7 mmol/L。造模成功后隨機選取30只大鼠分為模型組和試驗組各15只,另取與SHR遺傳背景相同的Wistar-Kyoto(WKY)大鼠15只為對照組,試驗組1 mg/(kg·d)達格列凈灌胃,模型組和對照組給予等量生理鹽水灌胃,8 w后進行檢測。

1.4大鼠基底動脈分離 腹腔注射5%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,取仰臥位,打開腹腔后,經左心室插管主動脈,剪開右心房,快速灌注含肝素(100 U/kg)生理鹽水5 min。然后灌注4 ℃ 4%多聚甲醛/PB溶液(Na2HPO4·12H2O 100 mmol/L,NaH2PO4·2H2O 100 mmol/L,pH7.4)15 min,開顱取腦,將基底動脈血管暴露出來。先用4%多聚甲醛固定血管,然后用石蠟包埋起來,再用竹簽輕輕磨掉剩余部分的內皮,樣品置于-80 ℃冰箱中,待后面檢測。

1.5蘇木素-伊紅(HE)染色檢測基底動脈病理變化 石蠟切片機將石蠟包埋組織切成4 μm厚度片狀,60 ℃烘箱5 min;二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ依次脫蠟20 min和10 min,1/2二甲苯+1/2無水乙醇-100%-95%-85%-70%-50%乙醇各1 min,自來水沖洗15 s;蘇木素染色5 min,自來水沖洗1 min,切片變藍;1%鹽酸乙醇分化10 s,自來水沖洗1 min;1%稀氨水返藍10 s,自來水洗1 min;伊紅染色1 min,自來水洗30 s;再依次使用不同濃度的乙醇脫水1 min,95%乙醇漂色1 min,無水乙醇脫水5 min,最終依次放在二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中各3 min,在顯微鏡下觀察中性樹膠封片。

1.6免疫熒光檢測核增殖指數(Ki67)表達水平 用冰凍切片機將大鼠的包埋組織切成6 μm厚度切片,使用60 ℃高溫去除OCT,用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次,5 min/次;經0.1%TritonX-100透膜5 min,用PBS洗3次,5 min/次;經5%牛血清白蛋白(BSA)封閉切片0.5 h后,甩干,4 ℃下,在切片中加入一抗anti-Ki67(1 μg/ml,ab15580,Abcam,英國),肌動蛋白α抗體(1 μg/ml,ab7817,Abcam,英國)過夜反應,然后用PBS洗3次,5 min/次;室溫下在切片上滴加二抗,避光孵育1 h然后用PBS洗3次,5 min/次,應用激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

1.7透射電鏡觀察大鼠基底動脈超微結構 各組大鼠開顱取腦后取出含腦基底動脈血管在內的3 mm厚的腦組織,在4 ℃條件下,電鏡固定液中固定12 h,用PBS洗3次,5 min/次;4 ℃下,使用鋨酸后固定1.5 h,用PBS洗3次,5 min/次;濃度遞增的乙醇-無水丙酮脫水10 min;Epon812包埋劑進行包埋,使用超薄切片機切片,厚度為80 μm,并采用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙重染色,應用H07000FA型透射電子顯微鏡觀察組織的超微結構。

1.8Western印跡檢測大鼠Nrf2和HO-1 蛋白表達水平 基底動脈組織置于液氮中研磨至勻漿,提取總蛋白,采用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度。加SDS的蛋白上樣緩沖液(×5)并煮沸,分裝保存于-80 ℃冰箱備。樣品放置在不同泳道中,進行聚丙烯酰胺凝膠電泳,濃縮膠電壓設置為80 V,分離膠電壓設置為120 V,轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜后,用5%BSA封閉。加入1∶1 000特異性一抗Anti-Nrf2抗體(ab92946,Abcam,英國),1∶10 000 HO-1(ab68477,Abcam,英國),1∶2 000 GAPDH(sc-47724,Santa Cruz,美國),并在4 ℃冰箱中過夜反應。TBST洗膜3次后,加入1∶5 000特異性的羊抗兔二抗,孵育1 h。繼續使用TBST洗膜3次,采用電化學發光(ECL)液曝光顯影,半定量分析通過Photoshop圖像分析軟件系統進行。

1.9統計學處理 采用SPSS23.0軟件進行Student-t檢驗,各時間點的比較采用重復測量方差分析。

2 結 果

2.1各組血糖比較 如表1所示,建模成功后給抑制劑前,模型組和試驗組空腹血糖差異無統計學意義(P>0.05),但均顯著高于對照組(P<0.05);給抑制劑8 w后,試驗組空腹血糖顯著低于模型組,但仍明顯高于對照組(P<0.05)。

2.2各組Ki67表達水平比較 如表1、圖1所示,與對照組相比,模型組和試驗組Ki67表達顯著增加(P<0.05),試驗組Ki67表達明顯低于模型組(P<0.05)。

圖1 各組基底動脈Ki67表達(免疫熒光,×200)

2.3大鼠基底動脈Nrf2和HO-1蛋白表達 如表1、圖2所示,與對照組相比,模型組基底動脈Nrf2和HO-1蛋白表達顯著降低(P<0.05);與模型組相比,試驗組Nrf2和HO-1蛋白表達顯著上升,但仍明顯低于對照組(P<0.05)。

表1 各組血糖、Ki67表達水平及Nrf2、HO-1蛋白表達比較

圖2 各組基底動脈Nrf2和HO-1蛋白表達

2.4各組基底動脈病理比較 如圖3所示,與對照組相比,模型組基底動脈血管壁厚管腔內徑管腔外徑和中膜面積均明顯增加,試驗組基底動脈血管壁厚管腔內徑管腔外徑和中膜面積相對于模型組有所降低,但仍高于對照組。

圖3 各組基底動脈病理(HE染色,×400)

2.5各組基底動脈超微結構比較 如圖4所示,對照組細胞排列整齊有序,結構良好且完整,模型組細胞排列紊亂,線粒體出現空泡,部分甚至出現腫脹和嵴斷裂,膠原纖維量增加。試驗組細胞的超微結構得到改善,細胞排量相對整齊,線粒體空泡化較少,膠原纖維減少。

圖4 各組基底動脈超微結構(×200)

3 討 論

2型糖尿病合并高血壓是一種慢性疾病,患者臨床特征為高血糖、相對缺乏胰島素、胰島素抵抗等,經常合并多種心腦血管、代謝和腎臟病,如高血壓、血脂異常和心力衰竭等,長期高血糖帶來的并發癥包括腦卒中、心臟病等,會產生大血管和微血管并發癥,對糖尿病患者的生活質量有較大影響,已經成為一個主要的公共衛生問題〔11,12〕。SGLT-2是一種現代降糖藥物,除了糖尿病患者血糖控制和心血管保護方面的積極結果外,還與血壓降低和腎功能改善有關,近年來在糖尿病患者中的應用有所增加。越來越多關于新型降糖藥的證據證明,SGLT-2與糖尿病相關的非靶向益處,尤其是對心腦血管和腎臟結局的顯著改善具有促進作用〔13,14〕。SGLT-2能夠持續適度但顯著地降低收縮壓和舒張壓,這是傳統降糖藥沒有針對性和觀察到的效果,除了這種降壓作用外對其他心臟代謝和腎臟參數也有多方面的有益影響,其臨床意義現在已經超出了其降血糖作用,從而提供了一種新的正常策略,用于循證、以患者為中心的糖尿病護理方法〔15,16〕。本研究證實,SGLT-2抑制劑可以降低大鼠血糖水平,這與當前臨床隊列研究結果相一致;本研究結果提示,對基底動脈異常增殖的抑制作用,可能是心腦血管保護作用機制之一;同時本研究發現,SGLT-2抑制劑降低了細胞損傷,減少了異常線粒體的出現,降低了線粒體嵴斷裂,提示其具有更好的細胞代謝功能,由此推測SGLT-2抑制劑對基底動脈的保護作用可能在降低血糖的同時,干預細胞異常增殖,從而維護細胞正常代謝功能。

Nrf2/HO-1途徑是防御氧化應激的內在機制,Nrf2作為一種轉錄因子可誘導大量細胞因子從而發揮重要的調節作用〔17,18〕。研究表明,Nrf2/抗氧化物反應元件(ARE)通路的調控可以改善大鼠糖尿病相關的焦慮和抑郁樣行為〔19〕,也有研究證實,Nrf2表達及其下游靶點活化如HO-1、醌氧化還原酶(NQO)-1、谷氨酸半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLC)和谷氨酸半胱氨酸連接酶(GCLM)可抑制高糖誘導的Toll樣受體(TLR)4/核因子(NF)-κB軸活化,參與糖尿病腎病患者的血清鐵蛋白、乳酸脫氫酶(LDH)、活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)和高遷移率族蛋白(HMG)B1水平升高,對糖尿病腎病發揮干預作用〔20〕。本研究結果提示,SGLT-2抑制劑對基底動脈重構的保護作用可能是通過Nrf2/HO-1信號通路的抑制實現的。

綜上,SGLT-2抑制劑可以對2型糖尿病合并高血壓大鼠基底動脈重構發揮干預作用。其機制可能與Nrf2/HO-1信號通路的調控相關。