基于TLR4炎癥信號通路探討針灸對頸性眩暈大鼠中縫背核神經元細胞活性及血管活性物質的影響

柳慶明 田利軍 唐樂 鞏鳳梅

(濟南市人民醫院針灸推拿科,山東 濟南 271100)

頸性眩暈是頸椎病臨床常見分型之一,通常是由于頸椎骨骼、肌肉或軟組織的異常導致,主要以眩暈等交感神經癥狀為主,故又稱椎動脈型頸椎病〔1〕。頸椎病通常具有病程長、易復發的特點,而頸性眩暈嚴重時還會出現昏倒的情況,這不僅給患者帶來了痛苦,還嚴重影響日常生活及工作〔2〕。目前,關于頸性眩暈的發病機制尚無明確定論,但有研究表明,炎癥反應、頸交感神經刺激及體液因子紊亂與該病的發病密切相關,其都可造成椎基底動脈供血不足,從而誘發眩暈〔3〕。Toll 樣受體(TLR)4炎癥信號通路在炎癥反應中發揮著重要作用,其可通過識別不同的病原體,來調控炎癥因子、趨化因子、細胞因子等炎癥介質,從而增強炎癥反應〔4〕。中縫背核神經元是機體內穩態信息的傳遞重要途徑,其與自身穩態的調節、感覺和運動控制、學習和認知等方面具有密切聯系,且其支配區較大,與包括頸交感神經在內的各腦區有著復雜的神經纖維關系〔5〕。有研究表明,血管活性物質是引起眩暈的一種關鍵體液因子,其收縮、舒張血管物質之間的失衡可能是導致眩暈的關鍵因素〔6〕。目前臨床上治療頸性眩暈的手段紛繁復雜,但針灸治療一直更受患者青睞,因其在緩解頸肩部疼痛、改善頭暈癥狀方面具有確切療效,且還具有操作簡單易行、安全、無副作用及實用性強等優勢〔7〕。但其對該病的具體作用機制研究相對較少,本文基于TLR4炎癥信號通路探討針灸對頸性眩暈大鼠中縫背核神經元細胞活性及血管活性物質的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物、儀器與試劑 北京化學試劑公司提供的60只SPF級SD大鼠〔合格證書為:SCXK(京)2019-0062〕,體質量215～295 g,飼養條件:23～26 ℃,相對濕度45%～69%,噪音<85 dB,無菌自由進食,進水2 w,按照《實驗動物管理條例》規定進行實驗。一次性使用無菌針灸針(HT0067,河南澤垣醫療器械銷售有限公司);鹽酸氟桂利嗪(西比靈,H10930003,西安楊森制藥有限公司);平衡木(北京安默賽斯生物科技有限公司);高速冷凍離心機(M1324R,深圳市瑞沃德生命科技有限公司);TUNEL試劑盒(E-EL-0003,武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司);DAPI染色液(TDCF5001,武漢天德生物科技有限公司);熒光顯微鏡(QLS-scope,北京Quantum量子科學儀器貿易有限公司);酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定試劑盒(SHC-9823,上海淳麥生物科技有限公司);蛋白質裂解液(SH0441,上海齊一生物科技有限公司);十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒(01100031,北京蘭杰柯科技有限公司);電化學發光(ECL)檢測試劑盒(KFS099,北京百奧萊博科技有限公司);TLR4抗體(10146-T16)、GAPDH抗體(10094-MM09-50)均購于北京義翹神州科技股份有限公司。

1.2分組與模型制備 選取40只SPF級SD雄性大鼠隨機分為正常(N)組、模型(M)組、針灸(A)組、西比靈(W)組,每組10只。對M、A、W組進行頸性眩暈建模,首先將大鼠固定,用0.4%的戊巴比妥麻醉后,剪斷頸后部肌肉,切除包括棘上韌帶、棘間韌帶的C5-6 棘突和韌帶,并破壞該段關節囊,使大鼠頸椎上下椎體出現明顯失穩,然后逐層縫合傷口,手術完成后4萬U青霉素連續注射3 d,當傷口愈合后,將大鼠放在平衡木上,如出現搖晃、停滯等現象時,則視為建模成功,N組不建立該模型,同期給予同體積生理鹽水。建模成功后,A組選取“風池”“百會”等穴位進行針灸治療,W組灌胃西比靈0.5 mg/kg,兩組均1次/d,持續21 d,N、M組同期灌胃0.5 mg/kg生理鹽水,給藥期間觀察各組一般情況并記錄。

1.3檢測步驟 (1)行為學檢測:實驗完成后對各組大鼠進行平衡木實驗,首先將平衡木放置妥當,然后上下左右的轉動大鼠頭部,轉動完成后迅速將大鼠放于平衡木上,若其在平衡木上搖晃、停滯、調轉方向、稍有移動或不移動,計0～1分;有明顯移動,甚者通過木桿,計1～2分;較流暢行走,通過木桿,計2～3分,總分3分,評分越高行為學恢復越好。(2)標本采集:平衡木實驗完成后,麻醉后處死大鼠,腹主動脈取血5 ml,將其放入含肝素鈉的真空采血管中,搖勻后靜置2 h,離心15 min,棄掉上清液,得血漿樣品放入冰箱密封保存,同時于冰上斷頭取腦,并分離出中縫背核組織,將其放于冷凍的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)中保存備用,其余腦組織用4%的多聚甲醛固定96 h,洗滌后放入冰箱中密封保存。(3)中縫背核神經元細胞活性測定:取中縫背核組織,采用TUNEL試劑盒檢測中縫背核神經元細胞凋亡,凋亡細胞發綠色熒光。(4)血漿血管活性物質相關指標水平測定:采用ELISA檢測內皮素(ET)-1、血栓素(TX)B2、神經肽(NP)Y、降鈣素基因相關肽(CGRP)水平,嚴格按照試劑盒說明操作。(5)大鼠腦組織中TLR4蛋白表達檢測:另取20只大鼠,建模后隨機分為兩組,T組給予灌胃1 mg/kg TLR4抑制劑組,U組給予TLR4抑制劑聯合針灸,Western印跡檢測各組腦組織中NLR4蛋白,主要步驟為樣品制備、蛋白質濃度測定、SDS-PAGE、轉膜、阻斷、一抗孵育、 洗滌、二抗孵育、再洗滌、信號檢測及數據分析。

1.4統計學分析 采用GraphPad Prism8.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組一般情況觀察結果 N組皮毛光澤,活動自如,一般情況均正常,對外界刺激也反應靈敏,M組皮毛光澤可見降低,且活動明顯受限,頸部活動受限最為明顯,進食、進水量明顯減少,對外界刺激反應可見明顯降低,而與M組相比,A、W組一般情況明顯改善,飲食逐漸恢復正常,頸部活動也明顯恢復。

2.2各組行為學結果 與N組相比,M組平衡木得分明顯降低(P<0.05);與M組比較,A、W兩組平衡木得分明顯升高(P<0.05);W組與A組相比無明顯差異(P>0.05),見表1。

2.3各組血漿中血管活性物質相關指標水平 與N組相比,M組血漿中CGRP水平明顯降低,ET-1、TXB2、NPY水平明顯升高(P<0.05);與M組比較,A、W兩組血漿中CGRP水平明顯升高,ET-1、TXB2、NPY水平明顯降低(P<0.05);W組與A組相比無明顯差異(P>0.05),見表1。

2.4各組中縫背核神經元細胞活性 與N組相比,M組中縫背核神經元細胞凋亡明顯升高(P<0.05);與M組比較,A、W兩組中縫背核神經元細胞凋亡明顯降低(P<0.05);W組與A組相比無明顯差異(P>0.05),見表1、圖1。

表1 各組平衡木得分、中縫背核神經元細胞凋亡率、血漿中血管活性物質相關指標水平

圖1 各組中縫背核神經元細胞活性(TUNEL染色,×200)

2.5各組腦組織中TLR4蛋白表達 與N組(1.21±0.05)相比,M組腦組織中TLR4蛋白表達(2.74±0.12)明顯升高(P<0.05);與M組比較,A、W兩組腦組織中TLR4蛋白表達(1.97±0.11,1.98±0.11)明顯降低(P<0.05);W組與A組相比無明顯差異(P>0.05);T組(1.96±0.11)與W組相比無明顯差異(P>0.05);U組(1.41±0.09)比T組明顯降低(P<0.05),見圖2。

圖2 各組腦組織中TLR4蛋白表達

3 討 論

長時間的低頭會導致頸椎受損從而引發各種頸椎病,這也使得頸椎病的發病率不斷上漲且呈年輕化趨勢〔8〕。而頸性眩暈除伴有頸項僵痛、麻木、耳鳴等癥狀,還伴有頭暈目眩、惡心嘔吐、步履不穩,同時其也是高血壓、腦梗死等疾病的發病誘因,因此探尋一種有效地治療方法對緩解患者病痛,預防并發癥等方面具有積極意義〔9〕。古代醫師在針灸治療頸椎病方面留下了豐富的臨床資料以供借鑒〔10〕。

本研究說明,針灸治療具有顯著療效。西比靈是臨床上治療眩暈的常用藥物,其可選擇性的阻止過量鈣離子進入細胞,從而防止血管痙攣,進而恢復椎動脈的供血,最終到達緩解眩暈癥狀的目的,因此本文選擇其作為對照藥物〔11〕。而針灸是一種傳統的中醫療法,可以用于治療各種疾病和癥狀,包括頭暈,其通過刺激特定的穴位來調節人體的氣血流動,促進身體的自愈能力〔12〕。平衡木實驗是反映大鼠行為學的有效指標,其能夠驗證大鼠的平衡能力及眩暈狀態,且操作簡單易行,便于實驗。頸性眩暈在中醫中屬于眩暈范疇,其主要病機為局部經脈氣血運行不暢,髓海失養,難以上呈清竅而致,因此調整督脈氣血、活血化瘀是關鍵所在〔13〕。對于頸性眩暈大鼠,針灸主要是通過刺激穴位及局部軟組織,來激發經脈氣血,從而調節血管的血流速度、調節局部軟組織的緊張痙攣狀態,進而改善椎動脈血供、緩解局部肌肉痙攣,最終有效改善或消除頭暈癥狀。張國亮〔14〕研究發現,針灸治療頸性眩暈具有良好的臨床效果,可顯著緩解眩暈癥狀,這與本文結果類似。

本研究表明,針灸可顯著抑制頸性眩暈大鼠中縫背核神經元細胞活性,有效調控血管活性物質分泌。頸交感神經刺激學說是目前被醫學專家公認的引起頸性眩暈的幾大學說之一,當交感神經受到壓迫或刺激時,就會引起眩暈、頭痛、惡心、心臟搏動增快等情況,而中縫背核神經元細胞活性可能在其中發揮著重要作用〔15〕。血液中ET-1、TXB2、NPY、CGRP等血管活性物質與椎基底動脈供血有著密切的關聯,有研究表明,血管活性物質分泌紊亂是誘發眩暈的關鍵因素〔16〕。頸椎長期受到壓迫或椎動脈出現粥樣硬化是頸性眩暈的主要致病因素,而這會導致血流減慢,從而引起缺血低氧反應,進而影響血管活性物質的分泌,最終加重疾病癥狀〔17〕。對于頸性眩暈大鼠,針灸可能是通過穴位刺激,來擴張血管,調節微循環,從而增加腦血流量及局部組織的微血流量、降低微血管收縮性、降低血管阻力、抑制血小板凝集,進而降低血黏度、松弛頸部肌肉痙攣、改善供血,最終有效改善頸性眩暈癥狀。劉乃剛等〔18〕研究發現,針灸治療對第三腰椎橫突綜合征大鼠具有顯著療效,其可有效調節血漿中血管活性物質的含量,這與本文結果類似。

本研究說明,針灸可顯著抑制TLR4炎癥信號通路表達。TLR4 是一種模式識別受體,其在免疫炎癥反應中發揮著不可或缺的作用,而其所在炎癥信號通絡也是炎癥反應發生的重要參與者,其可通過活化促炎性因子來促進炎癥反應〔19〕。頸性眩暈由于血流受到限制,從而激發了炎癥反應,而相關炎癥性的發生、發展與靶器官的損害是一個惡性循環,因此近年來如何抑制炎癥反應是臨床治療該病的工作重點〔20〕。對于頸性眩暈大鼠,針灸可能是通過穴位這種外源性刺激,來激活機體神經-內分泌-免疫網絡系統,將物理信號轉化為生物信號,從而釋放某些 TLR4的內源性配體使其與 TLR4結合,進而達到降低TLR4表達、抑制相關炎性因子分泌、促進細胞外基質合成等目的,最終有效抑制炎癥反應,改善大鼠臨床癥狀。孫遠征等〔21〕研究發現,針刺可以調控TLR4-核因子-κB信號通路,在頸椎病等慢性神經退行性疾病中起調節作用,這與本文結果類似。

綜上,針灸可顯著抑制頸性眩暈大鼠中縫背核神經元細胞活性并有效調控血管活性物質水平,其作用機制可能與抑制TLR4炎癥信號通路有關。