miR-541-5p在食管癌組織中表達及調控DDX52表達對食管癌細胞增殖、遷移的影響

楊海龍 王丁丁 陳雨桐 陳曉偉 李冰 王欣麗

(哈勵遜國際和平醫院 1胸外科,河北 衡水 053000;2神經內一科)

食管癌(EC)被認為是全球最主要的惡性腫瘤之一,也是中國男性癌癥相關死亡的主要原因之一,每年有近214 090例EC新病例被診斷出來,大約197 823人死亡〔1〕。目前,EC有多種診斷和治療策略,包括色素內鏡檢查、窄帶成像和可疑病變活檢。雖然先進的技術在一定程度上提高了EC的治療效率,但EC的預后仍然很差,提示EC仍然是我國首要的公共衛生問題〔2,3〕。因此,有必要探索新的方法以提高EC的診斷和預后。

miRNA是一種小型的非編碼RNA,在轉錄后水平參與基因調控。據報道,miRNA的失調通過調節與腫瘤發生過程相關的靶基因參與癌變過程〔4,5〕。例如,miR-154-5p在腫瘤組織中低表達,并抑制乳腺癌細胞增殖和轉移〔5〕。越來越多的證據也表明,miRNA與EC有關,Fan等〔6〕發現,miR-145-5p可以通過抑制其靶基因抑制EC的發生和發展。miR-541-5p是新發現的一種腫瘤抑制因子〔7〕,關于其在EC中的作用還未見深入報道。DDX52是一種DEAD/H box RNA解旋酶,以往研究顯示,敲低DDX52可顯著抑制前列腺癌細胞的生長〔8〕,還未見報道顯示DDX52與EC的關系。本研究假設miR-541-5p可能通過調節DDX52在EC的發展中發揮作用,并通過以下研究來驗證此假設,以期為EC的治療提供新參考。

1 材料和方法

1.1組織樣本 收集2019年5月至2021年10月哈勵遜國際和平醫院200例EC組織及鄰近非腫瘤食管(Normal)組織。所有患者簽署書面知情同意書。術前無患者接受放療或化療。本研究得到了哈勵遜國際和平醫院倫理委員會的批準,且符合世界醫學會《赫爾辛基宣言》。

1.2細胞與主要試劑 人食管上皮細胞HET-1A(BNCC337688)與EC細胞系EC9706(BNCC339892)、TE-9(BNCC351845)、ECA-109(BNCC337687)和KYSE180(BNCC351871)獲自北京Bena Culture Collection;Trizol總RNA抽提試劑(R0016)、BeyoECL Moon(P0018FS)、增強型CCK-8試劑盒(C0041)獲自上海Beyotime;PrimeScript RT reagent試劑盒(RR037A)獲自日本TaKaRa;miScript SYBR Green聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒(DXT-218073)獲自美國Qiagen;miR-541-5p模擬物(miR-541-5p)及其陰性對照(miR-con)、miR-541-5p抑制物(miR-541-5p inh)及其陰性對照(miR-con inh)和過表達DDX-52(OE-DDX52)及其陰性對照(OE-con)均獲自廣州RIBIO;RIPA lysis buffer(20-188)獲自美國Sigma-aldrich;二喹啉甲酸(BCA)蛋白質測定試劑盒(23229)獲自美國Thermo Fisher Scientific;一抗:DDX52(FNab02315)、磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH,FNab03342)、Ki67(FNab09788)、基質金屬蛋白酶(MMP)-9(FNab05247)均獲自武漢FineTest;DualucifTMFirefly &Renilla測定試劑盒(F6075S)獲自上海US EVERBRIGHT INC;BALB/c裸鼠獲自中國醫學科學院醫學實驗動物研究所,許可證號:SCXK(京)2021-0004;蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(AG1120)獲自上海Acmec。

1.3細胞培養 HET-1A、ECA-109和EC9706細胞系維系在DEME培養基中,KYSE180和TE-9細胞系維系在RPMI1640培養基中,所有細胞置于37 ℃,均添加10%胎牛血清和1%青-鏈霉素。

1.4qRT-PCR分析 通過Trizol試劑從收集的EC組織、Normal組織和不同細胞系中提取總RNA。然后,將RNA合成cDNA,并按照miScript SYBR Green PCR試劑盒說明書進行qRT-PCR測定,評估數據使用2-ΔΔCt法,U6用作內部對照。基因引物:miR-541-5p(正義:5′-CGAAAGGATTCTGCTGTCGGT-3′和反義:5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′)和U6(正義:5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACTA-3′和反義:5′-ACGAATTTGCGTGTCATCCTTGCG-3′)。

1.5細胞轉染與分組 取對數生長期的EC9706細胞或ECA-109細胞,依次分為miR-541-5p組,miR-con組,miR-541-5p inh 組,miR-con inh組,miR-541-5p+OE-DDX52組和miR-541-5p+OE-con組。使用Lipofectamine2000試劑分別轉染miR-541-5p(EC9706細胞)、miR-541-5p inh(ECA-109細胞)和miR-541-5p+OE-DDX52(EC9706細胞)及其相應的陰性對照。轉染濃度為50 nmol/L,將細胞在新鮮培養基中連續培養48 h以用于后續實驗。通過qRT-PCR或Western印跡法分析轉染效率。

1.6Western印跡分析 用RIPA裂解液獲取轉染后的EC9706細胞或ECA-109細胞的蛋白質,并用BCA法進行蛋白濃度鑒定。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離來自每個樣品的35 μg總蛋白,轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上并在5%脫脂牛奶中封閉1 h。將膜與一抗孵育,包括DDX52和GAPDH。4 ℃過夜。然后使用二抗在室溫下覆蓋膜45 min。最后,通過電化學發光(ECL)試劑檢測條帶。通過Image Lab軟件分析灰度值。

1.7CCK-8測定 轉染后的EC9706細胞或ECA-109細胞以(2×104個/孔)鋪板到96孔板中,48 h后向每孔中加入10 μl CCK-8溶液。將細胞與CCK-8溶液一起孵育4 h,然后在450 nm處檢測吸光度(OD)值(表示細胞活力)。

1.8集落形成實驗 轉染后的EC9706細胞或ECA-109細胞以(6×102個/孔)鋪板到6孔板中。培養14 d后,細胞用甲醇固定,然后用結晶紫染色。最后使用倒置顯微鏡對細胞集落進行拍照。使用ImageJ計算>50個細胞的集落。

1.9傷口愈合實驗 轉染后的EC9706細胞或ECA-109細胞以(5×105個/孔)鋪板到6孔板中,當所有孔都充滿細胞時,用200 μl無菌移液器吸頭刮擦線性傷口。使用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌板數次以去除懸浮細胞。并將細胞在無血清的培養基中培養。0、24 h用光學顯微鏡對同一部位的創面進行成像,計算創面愈合面積〔(總面積-創面面積)/總面積〕。

1.10雙熒光素酶報告基因檢測 TragetScan(http://www.targetscan.org/vert_71/)被用來預測miR-541-5p的目標基因。將DDX52的野生型(WT)或突變型(MUT)miR-541-5p結合序列插入pmirGLO質粒中,建立重組熒光素酶報告質粒(DDX52-WT和DDX52-MUT)。EC9706細胞用重組熒光素酶報告質粒和miR-541-5p或miR-con共轉染。48 h后通過雙熒光素酶測定系統檢查相對熒光素酶活性。

1.11異種移植實驗 共10只雄性無胸腺BALB/c裸鼠(4～6 w,20～25 g)飼養在哈勵遜國際和平醫院實驗動物中心(濕度:50%;溫度:25 ℃;光照循環:12 h光照/12 h黑暗;隨意進食和飲水)。將裸鼠隨機分為2組:miR-con組、miR-541-5p組,每組5只。將miR-541-5p或miR-con轉染的EC9706細胞懸浮在PBS中(5×105個/200 μl)并皮下注射到裸鼠的右后腿中。每5 d用卡尺檢測腫瘤體積,在第32天通過脊柱脫位處死裸鼠,最后將腫瘤組織標本在4%甲醛溶液中固定或儲存在液氮中,qRT-PCR檢測miR-541-5p表達。所有程序經哈勵遜國際和平醫院倫理委員會批準。

1.12HE染色和免疫組化 將固定后的腫瘤組織采用石蠟包埋,并切成5 μm的切片。將切片脫蠟和水化,部分切片用于HE染色。其他切片使用3%過氧化氫(H2O2)孵育30 min,然后用山羊血清在37 ℃下封閉40 min,與一抗(包括DDX52、Ki67和MMP-9)在室溫下孵育1 h,然后與二抗孵育45 min。最后使用二氨基聯苯胺(DAB)觀察染色信號,通過蘇木素對細胞核進行復染。在光學顯微鏡下拍攝圖片。

1.13統計學分析 采用GraphPad Prism5.0和SPSS22.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析和Dunnett-t檢驗。

2 結 果

2.1miR-541-5p在EC組織和細胞中表達降低 qRT-PCR結果顯示,EC組織中miR-541-5p水平較Normal組織顯著降低(0.34±0.05 vs 1.04±0.20,P<0.05);在EC細胞系中,與HET-1A細胞(1.02±0.03)比較,ECA-109、EC9706、KYSE180、TE-9細胞miR-541-5p表達(0.46±0.05、0.21±0.02、0.35±0.04、0.40±0.03)顯著降低(均P<0.05)。其中,miR-541-5p水平在EC9706細胞中最低,在ECA-109細胞中最高。

2.2miR-541-5p抑制EC細胞增殖和遷移 如表1、圖1所示,在miR-541-5p過表達的EC9706細胞中miR-541-5p水平顯著升高,而在miR-541-5p敲低的ECA-109細胞中miR-541-5p水平顯著降低(P<0.05)。miR-541-5p過表達顯著降低了EC9706細胞活力、集落形成數量和創面愈合面積,而敲低miR-541-5p顯著增加了ECA-109細胞活力、集落形成數量和創面愈合面積(均P<0.05)。

表1 miR-541-5p對EC細胞增殖和遷移的影響

2.3miR-541-5p靶向DDX52 TargetScan分析預測發現,miR-541-5p可能靶向DDX52,見圖2。miR-541-5p模擬物顯著降低了DDX52-WT轉染的EC9706細胞中熒光素酶活性(P<0.05),而miR-541-5p模擬物對DDX52-MUT轉染的EC9706細胞中熒光素酶活性無顯著影響(P>0.05)。見表2。

表2 雙熒光素酶報告基因證實miR-541-5p與DDX52之間的關系

2.4miR-541-5p通過下調DDX52抑制EC細胞增殖、遷移 miR-541-5p過表達顯著抑制了DDX52蛋白水平,而OE-DDX52顯著逆轉了miR-541-5p模擬物對DDX52蛋白的抑制作用(P<0.05)。與miR-541-5p+OE-con組相比,miR-541-5p+OE-DDX52組EC9706細胞活力、集落形成數量和創面愈合面積均顯著增高(P<0.05)。見圖3、表3、圖4。

2.5miR-541-5p抑制裸鼠腫瘤生長和轉移 miR-541-5p過表達后腫瘤組織中miR-541-5p水平顯著增加,腫瘤體積、重量顯著減小(P<0.05)。HE結果顯示,miR-541-5p過表達后腫瘤組織繼續生長過程中存在細胞分層紊亂及壞死情況;免疫組化結果顯示,miR-541-5p過表達抑制腫瘤組織中DDX52、Ki67和MMP-9表達(P<0.05)。見圖5、表4、圖6。

1～4:miR-con組、miR-541-5p組、miR-541-5p+OE-con組、miR-541-5p+OE-DDX52組圖3 Western檢測各組DDX52蛋白表達

表3 miR-541-5p通過下調DDX52對EC細胞增殖、遷移的影響

圖4 miR-541-5p通過下調DDX52對EC細胞增殖和遷移的影響(×40)

圖5 miR-541-5p過表達對異種移植裸鼠模型中腫瘤組織生長和轉移的影響(×200)

表4 miR-541-5p過表達對異種移植裸鼠模型中腫瘤組織生長和轉移的影響

圖6 裸鼠異種移植瘤圖像

3 討 論

第一個miRNA是1993年發現的,來自秀麗隱桿線蟲中的lin-4,被鑒定為一種小的非編碼RNA〔9〕。在過去的幾十年中,隨著越來越多的miRNA被鑒定出來,研究人員逐漸意識到miRNA是一簇短的非編碼RNA,可以抑制mRNA結構的穩定性、降低蛋白質的翻譯率、破壞蛋白質的調控,參與包括細胞增殖、遷移在內的多個生物過程,并在癌癥的發展中發揮作用〔10,11〕。

miRNA組成了一個廣泛存在于真核細胞中的大家族,其中一些與mRNA存在靶向關系。基因組分析表明,miRNA靶向的人類基因有5 300多個,占人類基因總數的30%,其表達與癌癥密切相關〔12,13〕。研究表明,EC患者和健康人之間存在許多miRNA改變。據報道,miRNA的異常表達與EC的發生發展有關〔4〕,如miR-1304在EC患者組織和血清中的表達增加,可作為EC診斷和復發及該病患者生存率的潛在指標〔14〕。Maghsudlu等〔15〕研究顯示,miR-27a和miR-24-2在食管鱗狀細胞癌中顯著上調,且具有協同作用。此外,研究表明,miR-27b-3p可通過靶向核因子紅細胞2相關因子2在食管鱗狀細胞癌中發揮抑癌作用〔16〕。本研究結果表明,miR-541-5p在EC進展中起抑制作用。以往研究顯示,miR-541-5p可通過靶向環核苷酸磷酸二酯酶1A調節肺纖維化,上調其表達對博來霉素誘導的肺部纖維化具有保護作用〔17〕。另外,一篇報道顯示,miR-541-5p在肝細胞癌中上調,可促進腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲,并抑制細胞凋亡〔18〕。結合以上研究說明,miR-541-5p在不同的癌癥中可能發揮不同的作用,因此有必要對其在EC中的作用機制進行探究。

DDX52也稱為ROK1,是DEAD-box RNA解旋酶家族的成員,該家族的成員參與各種基于RNA的過程和三磷酸腺苷(ATP)結合,并與多種人類疾病有關,包括精子發生紊亂、病毒感染和癌癥〔19〕。先前的研究表明,RNA解旋酶可以作為癌基因并在癌癥進展過程中表達上調,例如:DDX10可通過U3小核仁核糖核蛋白4促進肺癌細胞增殖〔20〕。本研究結果表明,miR-541-5p通過負靶向DDX52在EC中發揮抑癌作用。另外,根據現有研究報告顯示,敲低DDX52可通過調節抗鼠源原癌基因(c-Myc)信號傳導抑制前列腺癌〔8〕、黑色素瘤〔21〕的發展。于是,筆者推測miR-541-5p可能通過調控DDX52調節c-Myc信號抑制EC細胞增殖和遷移,但其具體機制還需更深入探討。然而,miR-541-5p亦可能與其他基因結合,通過其他信號通路參與EC進展。因此,接下來將探討miR-541-5p在EC細胞增殖和遷移中的作用機制。此外,許多miRNA可能參與EC治療,隨后將在進一步的研究中探索一組miRNA在EC治療中的作用。總之,本研究首次證明了miR-541-5p可能通過抑制DDX52來抑制EC細胞的增殖和遷移,為EC患者提供了一個新的治療靶點。