益氣活血通絡(luò)湯與低分子肝素抗凝對大鼠骨折愈合、血液流變學及TGF-β1表達的影響

李啟義 張江濤 常守亞

(河南省洛陽正骨醫(yī)院(河南省骨科醫(yī)院),河南 洛陽 471000)

骨折裂性病變,通常是由于外力作用或內(nèi)部病理因素導致〔1〕。據(jù)統(tǒng)計,我國每年有近千萬人因不同原因發(fā)生骨折,其中骨折延遲愈合或不愈合情況是影響骨折患者功能康復的主要因素〔2〕。血液流變學對維持正常的血液循環(huán)和組織灌注具有重要意義,研究發(fā)現(xiàn)在骨折愈合過程中,血液流變學因素的改變可能會影響血液流動和組織的營養(yǎng)供應,從而影響骨折愈合的速度和質(zhì)量〔3〕。近年來研究發(fā)現(xiàn),多種生長因子在創(chuàng)口愈合、骨折愈合過程中起重要作用,如轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1,其在細胞增殖及分化方面扮演著重要角色,同時對骨折修復的啟動、調(diào)控、發(fā)育及塑形均有重要作用〔4〕。目前臨床上治療骨折除西醫(yī)治療外,中醫(yī)治療也是常用方法,且近年來隨著現(xiàn)代醫(yī)學的不斷發(fā)展,中醫(yī)治療也在不斷更新和發(fā)展,其在臨床上取得了良好的效果,因此中藥加速骨折愈合方面已經(jīng)成為當今醫(yī)學領(lǐng)域的研究熱點〔5〕。益氣活血通絡(luò)湯是中醫(yī)傳統(tǒng)制劑,主要以黃芪、黨參為君藥,以當歸、丹參、川芎為臣藥,在諸藥的共同作用下,共奏活血化瘀、益氣固表、舒經(jīng)活絡(luò)、祛風培正、調(diào)和氣血之功效,故其對骨折愈合當有奇效〔6〕。而低分子肝素Ⅲ主要治療預防血栓性栓塞性疾病,但有研究表明其與中藥聯(lián)用,抗凝、抗血栓、擴張血管及增加血流等作用會形成疊加,對骨折形成的深靜脈具有顯著療效,且不易并發(fā)出血〔7〕。本文探討益氣活血通絡(luò)湯與低分子肝素抗凝對大鼠骨折愈合、血液流變學及TGF-β1表達的影響。

1 材料與方法

1.1動物材料 選取溫州清江生物科技有限公司提供的60只SPF級SD雄性大鼠〔合格證書為:SCXK(浙)2019-0037〕,體質(zhì)量205～255 g,飼養(yǎng)條件:23～26 ℃,相對濕度44%～73%,噪音<85 dB,提供充足日常飲水和食物,按照《實驗動物管理條例》規(guī)定進行實驗。

1.2實驗材料 克氏針(貨號:02jh2,新鄉(xiāng)市金環(huán)有限公司);骨鉗(貨號:guj,南京卡爾文有限公司);益氣活血通絡(luò)湯(由本院中醫(yī)部自制);低分子肝素鈣(貨號:國藥準字H20060191,深圳賽保爾有限公司);蘇木素染液(貨號:RT-S004,北京興怡雅創(chuàng)有限公司);伊紅染液(貨號:E301879-500ml,上海阿拉丁股份有限公司);光學顯微鏡(型號:CX23,美國奧林巴斯公司);全自動血流變分析儀(型號:HT-100B,濰坊嘉松有限公司);免疫組化試劑盒(貨號:R200826,上海瑞楚有限公司);二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(貨號:R110010,上海瑞楚有限公司);TGF-β1抗體(貨號:YS-0086R,上海雅吉有限公司)。

1.3建模 隨機選取50只大鼠,麻醉后將其仰臥位固定,然后暴露脛骨骨干,用骨鉗截斷形成骨折模型,將2 mm克氏針逆行向上打入脛骨上端,穿出皮膚后鉗斷克氏針尾,再順行打入脛骨干,固定好后活力碘沖洗,在骨折周圍滴入3滴慶大霉素,縫合傷口,術(shù)畢肌注青霉素7萬U,連續(xù)3 d,建模中死亡5只,其余全部建模成功。

1.4分組及給藥 從建模成功的大鼠中隨機選取40只,將其分模型(B)組、益氣活血通絡(luò)湯(C)組、低分子肝素(D)組、益氣活血通絡(luò)湯聯(lián)合低分子肝素(E)組,每組10只,同時隨機選取10只正常大鼠作為正常對照(A)組,C組4 g/kg益氣活血通絡(luò)湯灌胃,D組500 U/kg低分子肝素灌胃,E組給予益氣活血通絡(luò)湯聯(lián)合低分子肝素治療,均1次/d,持續(xù)28 d,A、B組同期給予同體積生理鹽水。

1.5X線攝片檢測大鼠骨折愈合情況 實驗完成后,給予大鼠腹腔注射0.5%的戊巴比妥鈉進行麻醉,將其固定好后,對患肢行X線攝片檢查,檢查電壓為60 V,電流為1.2 mA,距離為90 cm,以此觀察大鼠骨折愈合情況。

1.6標本采集 各組在X線攝片拍攝完成后,腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉處死大鼠,從下腔靜脈取血,加入抗凝劑后密封保存于冰箱中,同時游離出脛骨,洗凈后,加入脫鈣液進行脫鈣處理,處理完成后用梯度乙醇脫水,二甲苯透明2次后常規(guī)石蠟包埋、切片,脫蠟后用4%多聚甲醛固定10 d,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后放入冰箱中密封保存。

1.7蘇木素-伊紅(HE)印跡檢測大鼠骨組織病理形態(tài) 取部分脛骨組織,經(jīng)二甲苯脫蠟→梯度乙醇水化→蒸餾水洗滌→蘇木素染色5 min→伊紅染液染色2 min→脫水→透明→中性樹膠封片后,用光學顯微鏡進行組織病理學觀察,然后應用IPP醫(yī)學圖像處理系統(tǒng),計算軟骨、骨性骨痂、纖維性骨痂在骨痂總面積的比例,以反映骨折愈合情況。

1.8血液流變學指標的測定 取各組靜脈血,全自動血流變分析儀檢測全血低切黏度、中切黏度、高切黏度及血漿黏度,檢測于 25 ℃條件下進行,由專人操作,且需嚴格按照儀器說明書進行操作。

1.9免疫組化法檢測骨組織中TGF-β1蛋白表達 取各組脛骨組織,使用抗原修復液(10 mmol/L Tris-EDTA緩沖液,pH9.0)用微波方式對組織切片進行抗原修復,用5%～10%的普通血清(牛血清)對組織切片進行蛋白質(zhì)阻斷,然后進行一抗孵育、二抗孵育,在每個孵育步驟之后,使用Tris緩沖液輕輕地洗滌組織切片,以去除非特異性結(jié)合的抗體,然后用DAB進行顯色,脫水、透明、封片后,光學顯微鏡觀察,并應用計算機病理圖像處理系統(tǒng)對 TGF-β1的陽性表達進行定量分析,用積分吸光度值來展示統(tǒng)計結(jié)果。

1.10統(tǒng)計學分析 采用GraphPad Prism8.0軟件進行t、χ2檢驗,方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組脛骨骨折X線攝片結(jié)果 與A組相比,B組骨折線清晰,且沒有形成明顯骨痂;與B組相比,C、D、E組骨愈合速度明顯加快;C、D組骨折線仍可見但折斷端邊緣趨于模糊,且形成明顯骨痂;而E組骨折基本消失,髓腔再通,外骨痂減少,可見大部分骨痂長入骨折線,已有骨外膜形成并可見骨連接形成,見圖1。

圖1 各組脛骨骨折X線攝片

2.2各組HE染色結(jié)果 A組骨組織形態(tài)完整,骨小梁生長旺盛,排列規(guī)則有序,且無壞死區(qū)域;B組骨組織形態(tài)紊亂,出現(xiàn)部分壞死區(qū)域,并可見少量纖維組織;C、D組骨痂組織中可見大量肉芽組織、纖維組織長入,成軟骨細胞增生活躍,并有網(wǎng)狀交織的骨小梁;E組骨組織形態(tài)已趨于完整,排列有序且部分已被正常組織替代,骨小梁排列相對規(guī)則,可見部分成熟板狀骨形成,見圖2。

圖2 各組脛骨組織(HE染色,×100)

2.3各組脛骨組織TGF-β1蛋白表達 5組脛骨組織TGF-β1蛋白表達差異有統(tǒng)計學意義(F=18.000,P<0.001)。與A組(2.13±0.12)比較,B組脛骨組織TGF-β1蛋白表達顯著降低(0.98±0.08,P<0.05);與B組比較,C、D、E組脛骨組織TGF-β1蛋白表達顯著升高(1.54±0.11、1.53±0.12、2.14±0.12,P<0.05);與C、D組相比,E組上述指標顯著升高(P<0.05),見圖3。

圖3 各組脛骨組織TGF-β1蛋白表達(免疫組化,×400)

2.4各組骨折愈合相關(guān)指標結(jié)果 與A組比較,B、C、D、E組軟骨比例顯著降低,纖維骨痂比例顯著升高(均P<0.05);與B組比較,C、D、E組軟骨比例顯著升高,纖維骨痂比例顯著降低(P<0.05);與C、D組相比,E組軟骨比例顯著升高,纖維性骨痂比例明顯降低(P<0.05),而各組骨性骨痂比例相比無明顯差異(P>0.05),見表1。

2.5各組血液流變學相關(guān)指標結(jié)果 與A組比較,B、C、D、E組全血低切黏度、中切黏度、高切黏度及血漿黏度顯著升高(P<0.05);與B組比較,C、D、E組血低切黏度、中切黏度、高切黏度及血漿黏度顯著降低(P<0.05);與C、D組相比,E組上述指標降低顯著(P<0.05),見表1。

表1 各組骨折愈合、血液流變學相關(guān)指標

3 討 論

在臨床上,一般通過治療多數(shù)患者骨折都會到達愈合,但骨折愈合是一個復雜且相對漫長的生物學過程,其會受到如缺血、感染、年齡和健康狀況等多方面因素的影響 ,因此骨折延遲愈合及不愈合的情況也時有發(fā)生,這不僅使得患者的行動及生活受限極大,還對患者及其家屬造成了一定負擔〔8〕。

本研究發(fā)現(xiàn),益氣活血通絡(luò)湯與低分子肝素均具有顯著療效,可顯著促進骨折愈合,改善大鼠骨組織形態(tài),且聯(lián)合效果更佳。低分子肝素是治療及預防深靜脈血栓的重要藥物,是由肝素裂解、純化后得到的低分子量肝素組成的混合物,具有明顯的抗凝血因子Xa活性,可有效抑制體內(nèi)外血栓和動靜脈血栓的形成〔9〕。而益氣活血通絡(luò)湯則充分體現(xiàn)了中醫(yī)的兩大特點之一“整體觀念”,并運用“益氣活血舒筋活絡(luò)”為治則,從而達到標本兼治,局部與全身兼顧,祛邪與扶正兼施的目的〔10〕。在中醫(yī)中,骨折被稱為“骨碎”或“骨折”,中醫(yī)認為骨折是由于外傷引起的氣血瘀滯、經(jīng)絡(luò)阻塞等問題導致,因此在中醫(yī)治療骨折時,主要是通過活血化瘀、通絡(luò)舒筋以及調(diào)和氣血等方法來促進骨折的愈合〔11〕。近年來雖然隨著醫(yī)學的不斷發(fā)展,骨折愈合率越來越高,但骨折愈合時間仍然較長,大多數(shù)骨折仍需6～12 w才能達到臨床愈合,此外還時有骨折愈合延遲或不愈合的情況,有調(diào)查顯示這種情況可占骨折的10%左右,是影響骨折病人功能康復的重要問題,已經(jīng)廣泛受到醫(yī)學領(lǐng)域的關(guān)注〔12〕。而對于骨折大鼠,益氣活血通絡(luò)湯聯(lián)合低分子肝素可能是通過活血通絡(luò)、抗凝、抗血小板聚集的作用,來改善血液循環(huán),從而增強新陳代謝、促進基質(zhì)膠原的合成、提高成骨細胞的活性、增強機體清除血腫的能力等,進而促進骨痂形成、并有效促進骨形成及骨重建,最終到達加速骨折愈合的目的。周志豪〔13〕研究表明,養(yǎng)血固腎湯具有顯著療效,可顯著促進鈣鹽沉積、增強體內(nèi)成骨細胞的活動、進而促進骨折大鼠骨折愈合,改善其病理形態(tài),這與本文結(jié)果類似。

本研究表明,益氣活血通絡(luò)湯與低分子肝素可顯著改善骨折大鼠血液流變學,且聯(lián)合效果更佳。在骨折初期,受傷組織會發(fā)生出血,形成血腫,而血腫的形成會導致骨折處血液的供應情況變差,從而直接影響新骨的生成,因此,良好的血供是促使骨折愈合的首要條件〔14〕。而血液流變學是研究血液在血管內(nèi)流動時的性質(zhì)和特性的科學領(lǐng)域,也是判斷血瘀程度的客觀指標,故檢測其變化可有效明確機體血液循環(huán)及血瘀情況〔15〕。而對于骨折大鼠,益氣活血通絡(luò)湯聯(lián)合低分子肝素可能是通過促進全身氣血循環(huán),來加強血液循環(huán)及離子的運轉(zhuǎn),從而加速代謝、提高肢體血流量、改善缺血、缺氧、乳酸蓄積情況,進而改善骨折處的血液供應、降低血液黏稠度、提高骨痂的生物力學性能、刺激骨生長因子的分泌與合成等,最終加快骨吸收愈合,改善骨生物力學。李書良〔16〕研究發(fā)現(xiàn),益氣活血通絡(luò)湯聯(lián)合低分子肝素鈣對老年股骨轉(zhuǎn)子間骨折具有顯著療效,可有效降低骨折術(shù)后下肢深靜脈血栓的發(fā)生率,且無不良反應,這與本文結(jié)果類似。

本研究說明,益氣活血通絡(luò)湯與低分子肝素可顯著促進TGF-β1表達,且聯(lián)合效果更佳。TGF-β1與許多病理、生理的發(fā)生發(fā)展過程都有著密切聯(lián)系,有研究表明,其是成纖維細胞、成骨細胞的促有絲分裂原,可促進細胞增殖、分化和基質(zhì)蛋白的合成,同時具有刺激骨膜內(nèi)骨形成的作用,因此,研究其表達情況可作為闡明骨折愈合分子機制的重要步驟〔17～19〕。而對于骨折大鼠,益氣活血通絡(luò)湯聯(lián)合低分子肝素可能是通過活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)、去瘀生新等功效,來加速毛細血管的形成,從而促進血液運行、刺激降鈣素基因相關(guān)肽等神經(jīng)肽類物質(zhì)的釋放、刺激骨細胞增殖分化、刺激成骨細胞活性等,進而促進TGF-β1表達、達到促進骨蛋白的合成、增加骨基質(zhì)等的目的,最終有效提高骨折愈合程度。郇義超等〔20〕研究發(fā)現(xiàn),益氣健骨補腎方可顯著改善股骨骨折大鼠骨轉(zhuǎn)化指標,提升骨生物力學性能,促進TGF-β1表達,這與本文結(jié)果類似。

綜上,益氣活血通絡(luò)湯聯(lián)合低分子肝素抗凝具有顯著療效,其可顯著促進骨折愈合,改善血液流變學,并促進TGF-β1表達。