益氣養(yǎng)陰方對動脈粥樣硬化大鼠免疫炎癥因子和胸主動脈內(nèi)、中膜厚度的影響*

謝 心，徐浣白，樊月月，羅 浩，吳 堅△

1 上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200082； 2 上海市第一人民醫(yī)院，上海 200080

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是多種因素相互作用下發(fā)生的一種慢性炎癥性血管病變［1］，是一種以脂質(zhì)蓄積和炎性細胞浸潤為主要特征的動脈血管壁慢性炎性反應［2］，通常伴有大量免疫細胞參與，為眾多心腦血管疾病的共同病理基礎(chǔ)［3］。超敏C 反應蛋白（hypersensitive Creactive protein，hs-CRP）、轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）、白細胞介素8（Interleukin-8，IL-8）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）是反映動脈粥樣硬化炎癥反應的免疫炎癥因子。頸動脈內(nèi)中膜厚度是反映動脈粥樣硬化的窗口，有利于在早期發(fā)現(xiàn)病變［4］。益氣養(yǎng)陰方是在經(jīng)典名方生脈散基礎(chǔ)上結(jié)合上海市名中醫(yī)林鐘香教授的臨證經(jīng)驗加減化裁而來的方劑，由黃芪、黨參、麥冬、五味子、枸杞子、桑寄生6 味中藥組成，可益氣養(yǎng)陰、調(diào)養(yǎng)心腎。既往的研究也發(fā)現(xiàn)益氣養(yǎng)陰方治療動脈粥樣硬化大鼠，治療前后白細胞介素6（interleukin-8，IL-6）、人可溶性血管細胞黏附分子1（human soluble vascular cell adhesion molecule 1，sVCAM-1）、人可溶性細胞間黏附分子1（human soluble intercellular adhesion molecule-1，sICAM-1）及核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的表達水平明顯改善，較模型組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），能明顯改善糖尿病動脈粥樣硬化患者的血脂代謝、降低血尿酸水平，改善患者的臨床癥狀［5-7］。為進一步探討益氣養(yǎng)陰方對動脈粥樣硬化大鼠的作用機制，本研究觀察治療前后hs-CRP、TGF-β1、IL-8、MMP-9的表達水平變化及胸主動脈內(nèi)中膜厚度的改變，從炎癥因子及內(nèi)膜變化方面來揭示益氣養(yǎng)陰方防治動脈粥樣硬化的作用機制，以減少急性心腦血管事件的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 實驗動物清潔級Wistar 雄性大鼠46 只，由上海中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供，實驗動物許可證號：SCXK（滬）2016-0003，飼養(yǎng)條件：室溫22～24 ℃，相對濕度40%～60%。每5 只裝1 個鼠籠，自由飲水，進食普通標準飼料，每天7∶00 至19∶00予以光照，適應性飼養(yǎng)1周后進行試驗。動物實驗嚴格遵守《實驗動物福利倫理審查指南》。

1.2 實驗藥物益氣養(yǎng)陰方（四川新綠色藥業(yè)有限公司，中藥顆粒劑，批號：20181202，規(guī)格：20 g/包，由黃芪、黨參、麥冬、五味子、枸杞子、桑寄生6味中藥組成）。瑞舒伐他汀鈣片（浙江京新藥業(yè)股份有限公司，批號：B2014381，規(guī)格：10 mg/片）。

1.3 試劑及儀器

1.3.1 實驗儀器 普通高速離心機（Eppendorf公司，德國）；SM600 型酶標儀（上海永創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司）；AU2700 型全自動生化分析儀（貝克曼公司，美國）；HistoCore ArcadiaH 包埋機、RM2235 型石蠟切片機、ASP300s 型組織病理脫水機（徠卡公司，德國）；BX51 型熒光生物顯微鏡（Olympus 公司，日本）；XW-80A 型旋渦振蕩混合器（上海青浦瀘西儀器廠，中國）；GL-1800 型干式恒溫器（江蘇海門其林貝爾儀器有限公司）。

1.3.2 實驗試劑 大鼠TGF-β1ELISA 試劑盒，大鼠MMP-9ELISA 試劑盒，大鼠IL-8 ELISA 試劑盒（江蘇酶免實業(yè)有限公司，批號：MM-0181R1，MM-20918R1，MM-037351）；hs-CRP（乳膠增強免疫散射比濁法）試劑盒（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，批號：M100）；Masson 染液套裝，蘇木素-伊紅染液（北京索萊寶生物科技有限公司，批號：G1006，G1005）。

1.4 分組與造模46 只4 周齡SPF 級Wistar 雄性大鼠，隨機選出10 只為空白組，只給予基礎(chǔ)飼料，其余36 只為造模組。造模方法：主動脈內(nèi)膜球囊拉傷術(shù)結(jié)合高脂飼料喂養(yǎng)法：大鼠仰臥固定，局部剃毛消毒，應用0.5%戊巴比妥鈉30 mg/kg經(jīng)腹腔靜脈注射麻醉后，沿頸部前正中線，切開皮膚，游離出左頸外動脈3～4 cm，將頸外動脈先結(jié)扎其遠端，近端應用線挑起以阻斷血流，在兩線之間血管段的血管上壁剪一小切口，逆行插入2.5～3.0 F 標準球囊導管至胸主動脈，深度約5 cm，向球囊內(nèi)注入生理鹽水0.1 mL，應用手推式壓力注射器維持壓力為4 個大氣壓，然后回拉導管至主動脈弓處，再回抽至囊內(nèi)壓為零，反復抽拉導管3次，以拉傷胸主動脈內(nèi)皮，最后退出導管，結(jié)扎頸外動脈，逐層縫合。術(shù)前靜脈注射肝素0.1 μg/kg予以抗凝，術(shù)后每只予青霉素80 萬IU 肌肉注射3天，預防感染。術(shù)后造模組予高脂飼料喂養(yǎng)，高脂飼料配方：4%膽固醇+10%蛋黃粉+4%白糖+5%豬油+87%基礎(chǔ)飼料，加工成顆粒狀。高脂喂養(yǎng)8 周后各組隨機取出2 只殺死，解剖頸動脈、胸主動脈以確定造模是否成功。造模成功后，各組在原有飼料喂養(yǎng)下，將實驗動物30 只按隨機數(shù)字表分為模型組、益氣養(yǎng)陰方及瑞舒伐他汀鈣組，每組10只。

1.5 藥物干預空白組、模型組予等劑量的生理鹽水灌胃。益氣養(yǎng)陰方正常人劑量每日20 g，瑞舒伐他汀鈣劑量每日10 mg，參考徐叔云教授主編的《藥理實驗方法學》大鼠的等效劑量=正常人每日劑量/60 kg×6.3；瑞舒伐他汀鈣組予瑞舒伐他汀鈣1.05 mg/（kg·d），每日1 次；益氣養(yǎng)陰方組給予2.1 g/（kg·d），每日1 次。各組均干預6 周，所有動物自由飲水。

1.6 標本采集6 周后，腹主動脈取血后，應用過量的戊巴比妥鈉處死所有實驗大鼠，開胸截取胸主動脈至腹主動脈全長，生理鹽水沖洗干凈后，觀察斑塊形成情況，然后剪取斑塊形成處組織分別作病理學HE及Masson染色及分子生物學檢查。

1.7 觀察指標

1.7.1 動物一般情況 觀察所有大鼠，精神狀態(tài)、毛色、日常活動能力，反應靈敏度、進食等情況。1.7.2 TGF-β1、IL-8、MMP-9 及hs-CRP 水平 嚴格按照ELISA 試劑盒說明書操作步驟測定大鼠血清中TGF-β1、IL-8、MMP-9 的水平。采用乳膠增強免疫散射比濁法測定hs-CRP的濃度變化。

1.7.3 大鼠胸主動脈內(nèi)、中膜厚度及病理學表現(xiàn) 采用OLYMPUS BX51 顯微鏡觀察，軟件分析：ImageView。染色方法：HE 染色及Masson 染色，放大比例為200。

1.8 統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)錄入采用Excel 2019 完成，統(tǒng)計分析采用SPSS 24.0 軟件進行，圖片制作采用GraphPad Prism 8.0 軟件實現(xiàn)。計量資料以描述，多組間比較采用完全隨機設(shè)計資料的方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 動物一般情況適應性飼養(yǎng)期間，大鼠精神狀態(tài)佳，毛色平順有光澤，日常活動正常，反應靈敏，在進食量、飲水量、大小便方面都沒有問題出現(xiàn)。造模后所有造模成功大鼠的精神狀態(tài)變得萎靡不振，毛色變得枯槁、沒有造模前的光澤感，活動量相對減少，反應相對遲鈍，進食量、飲水量、小便相較于造模前均有明顯的增加。經(jīng)灌胃給藥干預后，各給藥組大鼠的精神狀態(tài)、毛色、日常活動等一般情況均有不同程度的轉(zhuǎn)好，各組均無大鼠死亡，體質(zhì)量增長良好。

2.2 大鼠hs-CRP、TGF-β1表達水平與空白組比較，其余各組hs-CRP、TGF-β1表達水平增高（P＜0.05）；與模型組比較，益氣養(yǎng)陰方組、瑞舒伐他汀組hs-CRP、TGF-β1表達水平均降低（P＜0.05），且瑞舒伐他汀組低于益氣養(yǎng)陰方組（P＜0.05））。見表1。

表1 各組大鼠炎癥細胞因子水平、IT及MT比較（）

表1 各組大鼠炎癥細胞因子水平、IT及MT比較（）

注：*表示與空白組比較，P＜0.05；#表示與模型組比較，P＜0.05；△表示與益氣養(yǎng)陰方組比較，P＜0.05

?

2.3 大鼠IL-8、MMP-9表達水平與空白組比較，其余各組IL-8、MMP-9 表達水平增高（P＜0.05）；與模型組比較，益氣養(yǎng)陰方組、瑞舒伐他汀組hs-CRP、TGF-β1表達水平均降低（P＜0.05），且瑞舒伐他汀組低于益氣養(yǎng)陰方組（P＜0.05））。見表1。

2.4 大鼠胸主動脈內(nèi)膜、中膜厚度與空白組比較，其余各組大鼠胸主動脈內(nèi)膜（thoracic aortic intima，IT）、胸主動脈中膜（thoracic aortic media，MT）厚度均增加（P＜0.05）；與模型組比較，益氣養(yǎng)陰方組、瑞舒伐他汀組IT 及MT 厚度均降低（P＜0.05），且瑞舒伐他汀組低于益氣養(yǎng)陰方組（P＜0.05））。見表1。

2.5 大鼠主動脈內(nèi)膜病理學表現(xiàn)

2.5.1 胸主動脈各層細胞結(jié)構(gòu)病理學表現(xiàn) 模型組胸主動脈壁黏膜層動脈粥樣硬化斑塊形成，內(nèi)見大量泡沫細胞、膽固醇結(jié)晶和少量淋巴細胞，其余各組相比病變明顯減輕，可見腹主動脈壁黏膜層局部薄層粥樣斑塊形成，斑塊內(nèi)見膽固醇結(jié)晶，少量增生的纖維組織、泡沫細胞和淋巴細胞。見圖1。

圖1 各組大鼠胸主動脈各層細胞結(jié)構(gòu)病理學表現(xiàn)（HE，×200）

2.5.2 腹主動脈各層細胞結(jié)構(gòu)病理學表現(xiàn) 模型組腹主動脈脂質(zhì)沉積和炎性細胞浸潤，纖維組織增生明顯，內(nèi)見大量泡沫細胞、膽固醇結(jié)晶，其余各組病變炎性細胞浸潤、纖維組織增生明顯減輕，可以看出益氣養(yǎng)陰方組大鼠胸主動脈各層細胞結(jié)構(gòu)的組織修復方面與模型組有顯著差異。見圖2。

圖2 各組大鼠腹主動脈各層細胞結(jié)構(gòu)病理學表現(xiàn)（Masson，×200）

3 討論

動脈粥樣硬化在中醫(yī)學中沒有專有病名，但與其相關(guān)的臨床表現(xiàn)及發(fā)病特點的論述散見于歷代文獻，如“消渴”“胸痹”“中風”“瘀證”“痰證”“脈痹”等。究其基本病機多為本虛標實，其發(fā)病多見于中老年人，臟器虛損，機能紊亂，臟腑陰陽氣血虧虛，而諸虛中又以氣陰兩虛為主，治療方法以益氣養(yǎng)陰為主。益氣養(yǎng)陰方是在經(jīng)典名方生脈散基礎(chǔ)上結(jié)合上海市名中醫(yī)林鐘香教授的臨證經(jīng)驗加減化裁而來，由黃芪、黨參、麥冬、五味子、枸杞子、桑寄生6 味中藥組合而成。方中黃芪味甘、性微溫，可健脾益氣，補益后天，充養(yǎng)先天；黨參味甘、性平，健脾補氣，補肺益氣；麥冬、五味子入肺、胃、心經(jīng)，養(yǎng)陰清熱，養(yǎng)心除煩；桑寄生、枸杞子補肝血，滋腎陰，使水火相濟，心腎相交，培陰精之本。諸藥合用，共奏益氣養(yǎng)陰、補益肝腎之功。

hs-CRP 直接影響動脈粥樣硬化斑塊與血栓形成，且已被證實是慢性炎癥引發(fā)心血管疾病的獨立危險因素［8］。TGF-β1是一種含有兩個肽鏈的蛋白質(zhì)，在體內(nèi)經(jīng)蛋白水解酶（如纖溶酶和組織蛋白酶D）激活與靶細胞膜上特異性受體結(jié)合介導跨膜信號轉(zhuǎn)導［9］。IL-8在炎癥反應中起核心調(diào)節(jié)作用，是炎癥免疫反應的重要介質(zhì)［10-11］，而且與疾病的活動性相關(guān)，是動脈粥樣硬化的一個重要的危險因子［12-14］。MMP-9通過降解基底膜膠原，減少纖維帽內(nèi)膠原纖維及結(jié)締組織，使纖維帽變薄，在斑塊纖維帽的崩解和隨后的斑塊破裂中起重要作用，促進中膜內(nèi)平滑肌細胞向內(nèi)膜遷移，因此在動脈粥樣硬化斑塊中，斑塊表面纖維帽的厚度、強度及其膠原組織含量的多少對于防止粥樣斑塊破裂至關(guān)重要，因此hs-CRP、TGF-β1、IL-8、MMP-9 影響著動脈粥樣硬化的發(fā)生和進展［15-18］。

本研究結(jié)果表明，益氣養(yǎng)陰方對動脈粥樣硬化大鼠治療前后hs-CRP、TGF-β1、IL-8、MMP-9的表達水平有明顯的下降，對胸主動脈內(nèi)膜及中膜的厚度有明顯改善作用，說明益氣養(yǎng)陰方能明顯降低動脈粥樣硬化大鼠炎癥因子的表達，改善胸主動脈內(nèi)中膜厚度，有助于動脈粥樣硬化大鼠主動脈各層細胞結(jié)構(gòu)的組織修復，減輕斑塊組織中炎癥細胞浸潤及纖維組織增生，為我們進一步挖掘干預糖尿病動脈粥樣硬化患者免疫炎癥損傷進展的有效中藥復方提供了一個研究思路，有助于減少急性心腦血管事件的發(fā)生及發(fā)展。