基于網絡藥理學及分子對接探討散結鎮痛膠囊治療子宮內膜異位癥的分子機制*

趙秀萍，馬小娜，郭亞楠

北京中醫藥大學第三附屬醫院，北京 100029

子宮內膜異位癥（endometriosis，EMS，以下簡稱內異癥）是指子宮內膜腺體和間質在子宮腔以外的部位種植、浸潤的一種臨床常見多發疾病，全球育齡婦女患病率約5～10%［1］。因異位內膜種植部位不同，臨床表現多種多樣，被認為是一種全身性多系統疾病。有報道指出EMS 可影響肝臟和脂肪組織的代謝，導致全身炎癥，并改變大腦中的基因表達，導致患者出現疼痛敏感和情緒障礙［2］。

古代中醫學中，無內異癥的病名記載，根據其痛經、繼發不孕、異位囊腫等癥狀可歸屬于“痛經”“不孕”“癥瘕”等范疇。中醫理論認為異位的內膜形似離經之血，即瘀血，可作為病理產物，也可為致病因素，核心病機為胞宮、沖任氣血瘀滯，臨床治療多從活血化瘀散結著手［3］。散結鎮痛膠囊為婦科臨床常用中成藥，具有活血化瘀、散結止痛的功效，可有效治療內異癥所致的痛經、卵巢囊腫、慢性盆腔痛等［4］。網絡藥理學可以全方位、多角度對中藥多成分的藥理作用靶點進行預測、拓撲分析，并可以將藥物-靶點、靶點-通路等關系抽象成網絡模型圖，目前已成為中醫藥治療臨床疾病作用機制的新興研究技術［5］。本研究應用網絡藥理學及分子對接技術，從系統生物學角度探索散結鎮痛膠囊治療內異癥的有效成分、作用靶點、信號通路等分子機制。

1 資料與方法

1.1 資料來源系統網絡藥理學是基于若干數據庫及軟件基礎上開展的，這些數據庫也成為中醫藥與現代生物醫學之間的橋梁。本研究使用的數據庫及軟件主要包括：TCMSP 數據庫（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）、Pubchem 數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、TTD 數據庫（https：//db.idrblab.org/ttd/）、Drugbank數據庫（https：//www.drugbank.ca/）、DisGeNET數據庫（http：//www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home）、Swiss Target Prediction 數據庫（http：//www.swisstargetprediction.ch/）數據庫、DAVID6.8 數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）、STRING 數據庫（https：//string-db.org/）、PDB 數據庫（https：//www.rcsb.org/）、Venny 2.1 在線繪圖軟件、Cytoscape3.7.2（http：∥www.cytoscape.org/）軟件等。

1.2 散結鎮痛膠囊活性成分及內異癥交集靶點的篩選將三七、薏苡仁、浙貝母分別輸入TCMSP數據庫，以口服生物利用度（oral bio-availability，OB）值≥30%和類藥性（drug-likeness，DL）值≥0.18 為合并篩選條件，得到各自活性成分，查找國內外文獻［6-7］，篩選龍血竭的主要活性成分。通過Pubchem、TCMSP 數據庫進一步獲得這些成分的Smiles結構并導入Swiss Target Prediction 數據庫，預測散結鎮痛膠囊活性成分的靶點信息。借助TTD、Drugbank、DisGeNET 數據庫檢索子宮內膜異位癥疾病相關靶點信息。檢索關鍵詞為“endometriosis”，刪去重復值后合并數據集獲得疾病靶點信息，利用Venny 2.1 工具繪制韋恩圖獲得交集基因。

1.3 靶點預測及核心蛋白互作網絡構建構建成分-疾病靶點映射關系，運用Cytoscape 3.7.2軟件構建“成分-疾病靶點”網絡圖，得到拓撲分析參數，經篩選后得到的核心靶點上傳到STRING 數據庫，進行蛋白-蛋白互作分析，保存TSV 結構，再上傳Cytoscape 軟件進行PPI 網絡構建，利用Network Analyzer 獲得自由度（degree）、中介中心性（betweenness）、接近中心性（closeness）等相關參數。

1.4 GO 功能富集分析將上述靶點信息輸入DAVID 6.8 數據庫Gene List，選擇“OFFICIALGENE-SYMBOL”，設定基因物種和背景為“Homo sapiens”，進行GO功能富集分析，具體包括生物過程（biological process，BP）、細胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）三部分，根據P-value 值選取前20 個條目，以氣泡圖進行可視化展示。

1.5 KEGG 通路富集分析及靶點-信號通路網絡構建通過DAVID6.8 數據庫選擇“KEGG_PATHWAY”，進行KEGG通路富集分析，根據P-value值篩選信號通路，利用Cytoscape 軟件構建活性成分-疾病靶點-信號通路網絡關系圖，進一步說明靶點和信號通路在散結鎮痛膠囊治療內異癥的作用。

1.6 成分-靶點對接選擇PPI 網絡中度值靠前的靶點與藥物關鍵成分進行對接，下載小分子配體mol2 格式。通過PDB 數據庫篩選下載靶蛋白pdb結構，導入PyMOL 2.4軟件進行去水、刪除配體等處理。將優化后的大分子蛋白導入AutoDock-Tools，進行加氫、計算電荷數等處理，導入小分子配體，設置Gird Box 為默認值，再通過AutoDock在Windows10環境下將大分子蛋白與小分子配體進行對接，按Binding energy排序，選取結構最穩定的對接目標，將pdbqt 結構轉化為pdb 結構，導入PyMOL軟件將對接結果進行可視化。

2 結果

2.1 散結鎮痛膠囊的活性成分與作用靶點篩選散結鎮痛膠囊中包括三七、薏苡仁、浙貝母和龍血竭4 味中藥。通過TCMSP 數據庫及文獻檢索篩選，共得到散結鎮痛膠囊54 個活性成分，其中三七8 個、薏苡仁8 個、浙貝母7 個、龍血竭31 個。其中beta-sitosterol 為三七、龍血竭、浙貝母的共有成分，Stigmasterol 為三七、薏苡仁、龍血竭共有成分，Mandenol 為三七、薏苡仁共有成分。保存每個化學成分的Smiles 結構，導入Swiss Target Prediction 數據庫，選擇物種為Homo sapiens，共預測成分靶點943個。見表1—2。

表1 藥物有效成分（除龍血竭）

表2 龍血竭有效成分

2.2 內異癥疾病靶點篩選從TTD、Drugbank、DisGeNET 數據庫以“endometriosis”為關鍵詞檢索，合并后刪除重復值得到EMS 靶點1088 個。將獲得的藥物成分靶點和疾病靶點錄入Venny 2.1在線工具繪制韋恩圖，兩者交集部分可能即為散結鎮痛膠囊治療內異癥的關鍵核心靶點。最終獲得NR3C2、CYP19A1、MMP9、PGR、EGFR、IL-2 等231個潛在靶點。見圖1。

圖1 散結鎮痛膠囊藥物成分-靶點韋恩圖

2.3 “藥物成分-疾病靶點”網絡構建將獲得的231 個交集基因導入Cytoscape 3.7.2 軟件，構建藥物成分-疾病靶點網絡圖，利用Tool 模塊中的Network Analyzer獲得Degree值，Degree值越高表示節點在網絡中越重要，排名前5 位成分為Stigmasterol（豆甾醇）、beta-sitosterol（beta-谷甾醇）、Mandenol（亞油酸乙酯）、Resveratrol（白藜蘆醇）、pterostilbene（紫檀芪）。見圖2。

圖2 散結鎮痛膠囊藥物成分-靶點網絡圖

2.4 PPI 靶點蛋白網絡分析將獲得的231 個交集靶點蛋白進行拓撲網絡分析，以degree 和betweenness 均大于中位數為條件進行篩選，共獲得45 個核心靶點，以gene symbol 的形式輸入STRING 數據庫，限定研究物種為Homo sapiens，設置選擇置信度分數score≥0.400（高置信度），隱藏無關聯的節點，默認其他參數，下載保存為tsv形式后導入Cytoscape軟件進行PPI互作可視化展示。中間圓形節點代表10個核心靶點，周圍圓形節點為其他核心靶點，圓形越大、顏色越深表示degree 越大。可見血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、ALB、蛋白激酶B（Protein kinase B，Akt1）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3）、類固醇激素受體輔激活子（steroid receptor coactivator，SRC）、表皮生長因子（epidermal growth factor receptor，EGFR）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、半胱天冬蛋白酶3（recombinant caspase 3，CASP3）、抑癌基因（tumor protein P53，TP53）、前列腺素內過氧化物合酶2（prostaglandin endoperoxide synthase2，PTGS2）等位于核心基因位置。見圖3。

圖3 PPI 網絡圖

2.5 散結鎮痛膠囊-內異癥交集基因的GO富集分析GO 富集分析共獲得328 個生物學過程（biological process，BP），74 個分子功能（molecular function，MF）和37 個（cellular component，CC）細胞組分。其中生物過程顯著富集在對RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、蛋白質磷酸化的正調控、凋亡過程的負調控、內皮細胞增殖的正調控等；分子功能主要富集酶結合、轉錄因子結合、相同蛋白質結合、轉錄調控區DNA 結合；細胞組分主要富集在細胞核、蛋白質復合物、核染色質、核質等。紅色圓點越大表示富集基因數量越多，顏色越紅則富集越顯著。見圖4—6。

圖4 散結鎮痛膠囊治療內異癥的生物過程富集分析

圖5 散結鎮痛膠囊治療內異癥的分子功能富集分析

圖6 散結鎮痛膠囊治療內異癥的細胞組分富集分析

2.6 KEGG 通路富集分析通過DAVID 數據庫對核心靶點進行KEGG 富集分析，獲得102 條相關通路，按P值排序挑選出前20條信號通路，使用氣泡圖進行展示，見圖7。可見核心靶點主要富集在癌癥通路、VEGF 信號通路、HIF-1 信號通路、雌激素信號通路、TNF 信號通路等。紅色氣泡越大則富集基因數目越多，顏色越紅富集越顯著。通過Cytoscape 軟件繪制“成分-疾病靶點-信號通路網絡圖，見圖8。根據度值排序可見成分、靶點關聯最主要的通路為HIF-1 信號通路、雌激素信號通路、TNF信號通路。

圖7 散結鎮痛膠囊治療內異癥的KEGG富集分析

圖8 成分-靶點-通路網絡圖

2.7 藥物成分-靶點對接將PPI 網絡中度值排名前5 的靶點蛋白分別與散結鎮痛膠囊關鍵成分進行分子對接驗證，見表3。結合能（binding energy）小于0 提示配體與受體可自發結合，數值越低結合構象越穩定，所需結合能越低，Binding energy≤-4.0 kcal/mol 說明有較好結合活性，≤-7.0 kcal/mol表明有強的結合活性［8］。結果顯示β-谷甾醇與AKT1、β-谷甾醇與SRC、紫檀芪與AKT1、紫檀芪與MAPK3 的結合能較小，分子結合構象更穩定，見圖9。結合上述結果，散結鎮痛膠囊有效成分與核心靶點具有較好的結合活性，β-谷甾醇、紫檀芪可能是散結鎮痛膠囊對內異癥發揮治療作用的關鍵成分。

圖9 散結鎮痛活性成分與核心靶點對接圖（結合能≤6.3 kcal/mol）

表3 藥物成分與核心靶點的對接結果kcal/mol

3 討論

散結鎮痛膠囊中龍血竭、三七專入血分，可活血散瘀止痛；浙貝母散結消癰；薏苡仁健脾利濕。諸藥合用，可使氣血通暢而無瘀滯，脾氣健運而無痰濕。研究表明，散結鎮痛膠囊可有效減輕內異癥及子宮腺肌病患者痛經癥狀［9］，改善子宮內膜的血管形成和血液循環、抑制平滑肌收縮、炎癥反應、降低雌激素分泌，從而有效減輕臨床癥狀［10］。

本研究在TCMSP 數據庫中共得到散結鎮痛膠囊有效活性成分54 個，預測成分靶點943 個。檢索獲得內異癥靶點1088個，兩者取交集后獲得231個靶點，可見散結鎮痛膠囊治療內異癥是通過多成分、多靶點發揮作用。借助Cytoscape軟件構建成分-疾病靶點作用網絡圖，分析篩選有效核心成分為豆甾醇、β-谷甾醇、亞油酸乙酯、白藜蘆醇、紫檀芪等，分子對接結果顯示β-谷甾醇、紫檀芪具有較強的結合效能，可能是散結鎮痛膠囊對內異癥發揮治療作用的關鍵成分。現代藥理研究認為，豆甾醇作為諸多中藥的關鍵成分之一，具有調節炎癥、免疫反應、血管生成等藥理作用，可通過神經系統相關通路緩解內異癥患者臨床癥狀［11］。β-谷甾醇可阻滯細胞周期，誘導細胞凋亡，具有抗菌、消炎、抗氧化等作用，從而對內異癥起治療效果［12］。而紫檀芪具有抗癌、抗氧化、抑制炎癥因子IL-6、TNF-α等作用［13-14］。以degree 和betweenness 為條件篩選出45個核心靶點，借助STRING數據庫根據度值獲得VEGFA、AKT1、MAPK3、SRC 等10 個核心靶點，這些靶點涉及血管生成、細胞凋亡、炎癥反應、腫瘤生成等多個生物過程。

本研究GO 功能富集分析得出散結鎮痛膠囊可能影響細胞凋亡、內皮細胞增殖、細胞缺氧等多個生物學過程。KEGG 分析顯示散結鎮痛膠囊治療內異癥主要涉及血管內皮生長因子信號通路、HIF-1 信號通路、雌激素信號通路、TNF 信號通路等。提示散結鎮痛膠囊可能通過干預雌激素的分泌、改善缺氧環境及影響子宮內膜血管形成等作用來對內異癥起治療作用。

綜上所述，散結鎮痛膠囊可通過多成分、多靶點、多通路協同作用治療內異癥，為從分子機制探討中醫藥治療內異癥疾病的研究提供了一定依據，但該研究是基于在線數據庫及生物信息軟件計算得出的，結果可能存在一定偏差，還需進一步通過臨床試驗及動物實驗進行驗證。