麻黃附子細辛湯治療緩慢性心律失常的網絡藥理學機制*

馬春麗，于 藝，遲倩慧，張 蕾，劉 穎

山東中醫藥大學針灸推拿學院，山東 濟南 250300

緩慢性心律失常（bradyarrhythmia，BA）是以心率減慢為特點的心血管疾病，分為竇性緩慢性心律失常、房室交界性心率、心室自主心律、傳導阻滯，臨床上常見于竇性心動過緩、病態竇房結綜合征［1］。BA 病因形成復雜，主要原因是其沖動形成異常和傳導異常［2］。其癥狀主要表現為長時間的心動過緩所引起的臟器供血不足，通常會引起心絞痛、冠心病、心功能障礙等疾?。?］。

麻黃附子細辛湯出自張仲景《傷寒雜病論》，由麻黃、附子、細辛等3 味藥組成，其用量為麻黃、細辛各二兩，制附子一枚，常用于治療少陰感寒癥。近代醫家在繼承仲景之志的基礎上提出治療心血管疾病的原則是溫陽通氣，方中附子辛甘大熱，通行十二經之陽氣，麻黃與附子同用，既散表寒又逐里寒，加之辛溫發散的細辛，補散兼施，共奏溫陽散寒之效。

1 資料與方法

1.1 麻黃、附子、細辛化合物及作用靶點、相應基因的檢索與篩選通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）檢索麻黃、附子、細辛的化合物，再根據生物利用度（oral bioavailability OB）≥30%、類藥性（drug-likeness DL）≥0.18、半衰期（Half Life HL）≥4 h，篩選出符合條件的候選化合物及相應的靶點信息。借助Uniprot（https：//www.uniprot.org）數據庫中的UniProtKB 搜索功能，將物種設定為人，將所得到的靶點全部校正為基因名。

1.2 BA 相關靶點的檢索以bradyarrhythmia為關鍵詞，運用GeneCards 數據庫（https：//www，genecards.org）獲取疾病的相關靶點與基因，去除重復值，得到BA相關靶點基因的數據庫。

1.3 構建“麻黃附子細辛湯-化合物-靶點”的可視化網絡圖利用Venny 圖（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）將麻黃附子細辛湯有效成分的靶點基因與疾病的靶點基因取交集，得到麻黃附子細辛湯與BA 的關鍵靶點基因。運用Cytoscape 軟件，構建“麻黃附子細辛湯-BA-化合物—靶點”的可視化網絡圖，分析得出麻黃附子細辛湯治療BA的作用機制。

1.4 構建PPI網絡將疾病與藥物的共有關鍵靶點上傳至STRING數據庫，將物種設置為“人”，以獲取蛋白之間的相互作用關系，下載結果中的TSV格式文檔，摘取其中的node1、node2 和combined score 列數據并進行整理，利用Cytoscape 3.6.2軟件繪制關鍵靶蛋白PPI 網絡，根據degree 值找出關鍵靶點，以獲取蛋白之間的相互作用關系。

1.5 基因功能及作用通路分析為了進一步說明與中藥化合物對應的預測靶點在基因功能和作用通路中的作用，運用David 數據庫（http：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp）對疾病與藥物的關鍵靶點進行基因本體論（gene ontology，GO）富集分析和KEGG 生物通路分析，標識符選擇OFFICIAL GENE SYMBOL，列表類型選擇基因表，選擇物種為“Homo species”，將閾值設定為P＜0.05，篩選排名靠前的生物過程和通路，并繪制barplot柱狀圖和圖表，闡明麻黃附子細辛湯治療BA的基因功能和關鍵通路。

2 結果

2.1 麻黃附子細辛湯藥物活性成分借助TCMSP數據庫，以OB≥30%、DL≥0.18、HL≥4 h為標準，篩選出符合條件的候選化合物共52 個，其中麻黃23個，附子21個，細辛8個。除去無對應靶點后剩余主要活性成分36 個，其中麻黃的活性成分有22個，附子的活性成分有7 個，細辛的活性成分有8個，細辛與麻黃共有的活性成分有1個。見附表1。

表1 大黃附子細辛湯抗BA KEGG通路富集分析

表2 麻黃附子細辛湯候選化合物相關信息

2.2 麻黃附子細辛湯活性成分的作用靶點預測借助TCMSP、Uniprot 數據庫獲取麻黃附子細辛湯的作用靶點并去除重復值，共得到麻黃、附子、細辛的作用靶點229個，并轉化為基因。

2.3 BA的相關靶點運用GeneCards數據庫獲取BA的相關靶點，去除重復及人沒有的后得到595個。利用Venny 圖將麻黃附子細辛湯中的作用靶點與BA的相關靶點取交集，獲得交集靶點65個，見圖1。

圖1 麻黃附子細辛湯與BA交集靶點韋恩圖

2.4 “麻黃附子細辛湯-化合物-靶點”的可視化網絡圖將麻黃附子細辛湯的作用靶點基因的靶點基因上傳到Cytoscape 3.7.2 軟件，構建“麻黃附子細辛湯-化合物—靶點”的可視化網絡圖。其中淺綠色圓形代表藥物，深綠色菱形代表藥物的靶點基因，粉色、黃色、藍色六邊形代表化合物，紫色六邊形代表麻黃和細辛共有化合物，每條邊表示化合物與藥物靶點之間的關系，degree 越大說明化合物與靶點之間的關系越密切。其中排名前四的化合物為槲皮苷，山柰酚，木犀草素，多根烏頭堿，說明這些化合物可能是麻黃附子細辛湯治療緩慢性心律失常的關鍵化合物，而degree 值排名前5 的靶點為PRSS1、PTGS2、NCOA2、HSP90AB1、DPP4，作用于多個化合物有效成分，體現了麻黃附子細辛湯治療BA 中多成分、多靶點的作用機制，見圖2。

圖2 “麻黃附子細辛湯-化合物-靶點”的可視化網絡圖

2.5 構建PPI 網絡將藥物與疾病的65 個交集靶點上傳到STRING 數據庫，限定研究物種為“Homo sapiens”，獲得相應人源蛋白。并將從STRING 數據庫導出的文件中的node1、node2 和Combined score 信息導入Cytoscape 3.7.2 軟件構建藥物成分-靶點網絡，以探究麻黃細辛附子湯的藥理學作用機制，其中“節點”（node）表示分子、靶蛋白，“邊”（edge）表示成分與靶點之間的關系。見圖3。此網絡圖共包括關鍵節點65個，Degree越大，其節點越大，蛋白與蛋白之間的作用越大。結果表明麻黃附子細辛湯治療BA 的靶標中，degree值排前十的為IL-6、TNF、VEGFA、CXCL8、IL-1B、FOS、NOS3、IL-10、CAT、ICAM1。見圖4。

圖3 麻黃附子細辛湯抗BA網絡圖

圖4 麻黃附子細辛湯-緩慢性心律失常的PPI網絡示意圖

2.6 基因功能及作用通路分析將65 個關鍵靶點上傳至David 數據庫中的基因列表，標識碼為OFFICIAL GENE SYMBOL，清單類型為基因表，選擇物種為“Homo sapiens”，對關鍵基因進行GO 富集及KEGG 通路分析，GO 富集主要涉及100 個生物學過程（biological process，BP），14 個細胞組成（cellular component，CC）和15 個分子功能（molecular function，MF）。將GO 富集按P值大小進行排序，其中BP排名前20的條目為腺苷酸環化酶激活腎上腺素能受體信號通路、去甲腎上腺素-腎上腺素血管收縮參與全身動脈血壓調節、磷脂酶C激活G-蛋白耦合受體信號通路、細胞信號、氧化還原過程、過氧化氫生物合成過程、免疫反應、膜蛋白外膜蛋白的正調控、宿主共生體生長的負調控、通過死亡域受體對外在凋亡信號通路的負調控、正調控平滑肌收縮、細胞對脂多糖的反應、一氧化氮生物合成過程的正調控、胞質鈣離子濃度的正調控、炎癥反應、血管收縮的正向調節、平滑肌細胞增殖的正調控、內皮細胞凋亡過程的負調控、血管生成的正調控、正調控鈣化二醇1-單氧合酶活性，CC 排名前十的條目為細胞外隙、等離子膜的整體成分、神經元投影、細胞外基質、等離子膜的外側、細胞表面、線粒體外膜、受體復合體、GABA-A受體復合體、胞外體，MF排名前10的條目為α1-腎上腺素受體活性、去甲腎上腺素結合、血紅素結合、腎上腺素結合、細胞因子活性、NADP 綁定、蛋白質同二聚化活性、生長因子活性、腫瘤壞死因子受體結合、多巴胺綁定，見圖5。KEGG 通路分析主要涉及69 條通路，根據P值進行排序，其中排名前20 的分別為瘧疾、恰加斯?。绹F蟲?。?、風濕性關節炎、非洲錐蟲病、TNF 信號通路、炎癥性腸病、Toll 樣受體信號通路、乙肝、神經活性配體受體相互作用、異體排斥、鈣信號通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用、HIF-1 信號通路、癌癥中的轉錄失調、T 細胞受體信號通路、阿米巴病、弓形體病、cGMP-PKG 信號通路、利什曼病、5-羥色胺能突觸，見表1—2。

圖5 大黃附子細辛湯抗BA GO富集分析柱形圖

3 討論

BA 是以心率減慢為特征的心血管疾病，大多好發于老年人，其中以病態竇房結綜合征最為常見。病因主要是由于多種原因造成竇房結自律性降低，導致竇房功能衰竭、起搏功能障礙、傳導功能障礙、G蛋白基因表達障礙的疾病［4］。BA的臨床表現早期并不明顯，隨病情加劇逐漸表現為乏力、心悸、頭暈、嗜睡、記憶力減退，嚴重時導致心絞痛、心力衰竭等［5］?，F代醫學對BA的治療，一般采用阿托品、莨菪堿等藥物，藥物長期效果不穩定，副作用大，病情嚴重者通常安裝永久性心臟起搏器改善癥狀，價格昂貴且作用期限有限［6］。故中醫藥治療BA具有重要的臨床意義和發展前景。

祖國醫學通常將BA 歸為“心悸”“怔忡”“遲脈”范疇，歷代醫家對其病因病機都有不同的見解，大多認為本病為本虛標實之證。病機大多為“心脈瘀阻““心氣虧虛”“陽氣虧虛”。周次清［7-8］認為，陽氣虛衰是病態竇房結綜合征發病的根本，陽氣主動，對人體各臟腑起著溫煦和推動的作用。心陽虧虛無力鼓動心臟搏動，溫運血脈，脾為氣血生化之本，脾陽不振導致運化失常，脾濕生痰，痰濁心包，蒙蔽心神，影響氣血發源，進一步影響其他臟腑的生理功能。腎為元陰元陽之本，心陽、脾陽根于腎陽，腎陽不足影響心陽、脾陽等陽氣的生成。因陰陽互為對立又互相轉化，故腎陽不足日久，引起腎陰不足，陰不斂陽，陰陽不相順接，導致陰陽兩虛，形成寒凝、血瘀、痰濁等由虛轉實的病理產物。劉渡舟認為，心為陽中之陽臟，以陽氣為用，故心臟病亦恒多陽氣之病，或陽氣太過，或陽氣不足［9］。老年人陽氣虛弱，心陽不足時會出現心搏頻率下降、脈遲緩無力、胸悶氣短等癥狀。中醫藥治療BA 主要以麻黃附子細辛湯、四逆湯、參附湯、血府逐瘀湯等為主。劉小鋒等［10］篩選病態竇房結綜合征致BA患者41例，采用麻黃附子細辛湯加味進行治療，結果顯示總有效率95%。說明益氣溫陽、通絡活血的中藥可以改善竇房結功能，提高心率。王海波［11］選取BA患者60例，治療組采用麻黃附子細辛湯和陽和湯治療，對照組采用阿托品治療，結果治療組總有效率95%，對照組總有效率76.67%。楊周宇等［12］選取70 例BA 的患者，給予麻黃附子細辛湯加味治療，結果顯示顯效36例，有效29 例，說明麻黃附子細辛湯在提高BA 患者心率方面有明顯效果。

麻黃附子細辛湯出自《傷寒論》第301 條：“少陰病，始得之，反發熱，脈沉者，麻黃附子細辛湯主之?！痹街饕委熽柼撏飧兄C，腎陽為一身陽氣之本，溫煦腎陽，諸臟腑陽氣得之裨益［13］。《神農本草經》云附子：“主風寒咳逆邪氣，溫中，金瘡，破癥堅、積聚血癥”，上助心陽通利百脈，下補腎陽補益元氣，加之麻黃、細辛共奏溫經散寒，助陽解表之功。童妍等［14］通過觀察附子對BA 大鼠cAMPPKA 信號轉導通路的影響得出附子能提高緩BA大鼠Na+-K+-ATP 酶活性，升高大鼠心肌cAMP 含量，升高心肌PKA 含量，具有強心肌的作用。景紅娟［15］指出麻黃堿有興奮心臟的作用，且麻黃堿的濃度越高，加快心率、抑制心電圖上QT 間期的效果越明顯。黃順旺［16］證實細辛醇提液對離體兔和豚鼠心臟具有明顯的興奮作用，增強心肌收縮力，加快心率。研究表明，麻黃附子細辛湯可明顯提高BA的心率。

本次研究首先在TCMSP 中藥系統藥理學分析平臺研究了麻黃附子細辛湯（麻黃、附子、細辛）中的有效成分和作用靶點，通過化合物-藥物靶點網絡圖顯示：槲皮苷、木犀草素、山柰酚、多根烏頭堿、去甲烏藥堿、兒茶酚等化合物與多個藥物靶點相互作用，故說明它們是麻黃附子細辛湯中的有效化合物成分，PRSS1、PTGS2、NCOA2、HSP90AB1、DPP4 是化合物-藥物靶點中的關鍵靶點。麻黃附子細辛湯主要通過IL-6、TNF、VEGFA、CXCL8、IL1B、FOS、NOS3、IL10、CAT、ICAM1 作用于BA，可能是核心靶點。JANSSEN 等［17］通過體外試驗，發現IL-6對心肌有負性效應，低濃度的IL-6可能導致心肌肥大，而高濃度的IL-6 可能影響心肌并產生擴張，進一步導致心律失常的發生，可見IL-6 水平與心室擴張和心肌收縮功能的減退等程度呈正相關。

根據GO 富集分析顯示麻黃附子細辛湯治療BA 的生物學過程主要體現在腺苷酸環化酶激活腎上腺素能受體信號通路、去甲腎上腺素-腎上腺素血管收縮參與全身動節脈血壓調等方面。腺苷酸環化酶通過調控細胞內第二信使cAMP，引起細胞內的酶反應或者微環境變化，產生一系列的生理效應，包括心臟收縮、免疫反應等，AC6 從哺乳動物心臟中介導β-腎上腺素能受體刺激的信號異構體［18］。TANG 等［19］在心力衰竭小鼠模型的研究中發現，AC6 可明顯緩解心力衰竭，增強心肌收縮力。細胞組成主要體現在細胞外隙、等離子膜的整體成分、神經元投影等。分子組成則主要體現在α1-腎上腺素受體活性、去甲腎上腺素結合、血紅素結合等。去甲腎上腺素在心血管疾病中具有增加心率、加強心肌收縮的作用［20］。KEGG 通路主要涉及TNF信號通路、Toll樣受體信號通路、鈣信號通路、cGMP-PKG 信號通路等。心律失常與心肌細胞內Ca＋濃度有重要聯系，張青［21］證明TNF-α可能通過增加心室肌細胞胞內Ca＋濃度，致心肌細胞早期后除極，引起心肌梗死室性心律失常。本研究中麻黃細辛附子湯治療BA 的KEGG 分析結果中亦包含有鈣信號通路，說明鈣信號具有成為緩慢型心律失常治療靶點的潛質。研究表明，抑制炎癥途徑可能有助于預防血管損傷。TNF-α 也被證明能刺激內皮細胞釋放的內皮微粒，參與內皮細胞的凋亡。因此，TNF-α 抑制劑在預防血管功能障礙方面有新的作用［22］，可以增強心肌收縮力，提高心率。HAN 等［23］研究發現，cGMP 含量的增加可有效激活PKG，保護心肌細胞，進一步降低心律失常的發病率。趙燦等［24］發現，心肌肌鈣蛋白在被cAMP 活化的鈣調素依賴性蛋白激酶作用下磷酸化，參與細胞收縮等生理功能，增加心肌收縮力從而改善心律失常。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學對麻黃附子細辛湯干預BA 的作用靶點及相關通路進行深入分析，通過IL-6、TNF、VEGFA 等核心靶點的表達作用于腺苷酸環化酶激活腎上腺素能受體信號通路、去甲腎上腺素-腎上腺素血管收縮參與全身動脈血壓調節等生物過程，并作用于TNF 信號通路、Toll 樣受體信號通路、鈣信號通路、cGMP-PKG 等信號通路，從而增強心肌細胞收縮力，提高心率，達到治療緩慢性心律失常的目的。本研究仍有很多不足，比如像Toll 樣受體信號通路未找到其作用機制，但仍希望為中醫藥治療BA的藥理學研究提供新的思路，旨在為臨床應用麻黃附子細辛湯治療BA提供基礎的生物信息學支撐。