肝細胞鐵死亡在肝臟相關疾病的研究進展

吳姜杰 齊家龍 宋正己

肝病是全球疾病負擔及死亡相關病因的主要原因之一[1]。在中國,病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病及與之相關的肝硬化、肝癌等各類肝病約有3億人受累[2]。因此,探究肝病的發病機制具有重要的臨床意義和社會價值。

細胞死亡基于功能方面的差異可分為兩種類型,即意外細胞死亡(accidental cell death,ACD)和調節細胞死亡(regulated cell death,RCD)。隨著細胞檢測技術的發展,不同種類的RCD及其核心通路被解析。2012年,Dixon等發現Erastin的抗癌活性依賴于誘導一種新型調節性細胞死亡方式,后來被命名為鐵死亡。鐵死亡是鐵依賴活性的RCD,其與經典的細胞凋亡、細胞自噬及細胞壞死具有明顯的差異。在形態學上,鐵死亡表現為線粒體變小、外膜破裂、嵴減少或消失;從生物化學的角度來看,鐵死亡是通過鐵蓄積、過量的活性氧和脂質過氧化來介導的[3]。自從鐵死亡這種全新的死亡模式被揭示后,越來越多的證據顯示鐵死亡在肝病的發生和發展中起著關鍵作用。

一、鐵死亡的核心機制

(一)鐵穩態調節及其對鐵死亡的影響 鐵離子是引發鐵死亡途徑的觸發因素。膳食中的鐵從十二指腸絨毛上皮細胞吸收后通過轉鐵蛋白及轉鐵蛋白受體(transferrin receptor,TFR)導入并被分選到內體中,以Fe3+形式由前列腺六跨膜上皮抗原3(six-transmembrane epithelial antigen of the prostate 3,STEAP3)還原為Fe2+,之后通過二價金屬轉運蛋白1(divalent metal transport 1,DMT1)釋放到細胞質,儲存在不穩定的鐵池或鐵蛋白中發揮作用,多余的Fe2+可通過鐵轉運蛋白排泄到細胞外循環中[4],以上環節共同維持著鐵穩態的平衡。當細胞對鐵的攝入量增加或鐵的輸出量減少時,都會使細胞對鐵死亡更加敏感。此外,核受體共激活因子4 (nuclear receptor co-activator 4,NCOA4)將鐵蛋白轉運至溶酶體進行降解[5]。鐵蛋白解鏈后釋放的催化鐵又使細胞內不穩定鐵水平升高,過載的鐵與過氧化氫發生芬頓反應,導致羥基自由基和過氧化物的形成及細胞膜磷脂的破壞,這是引發鐵死亡的重要機制。

(二)脂代謝及其對鐵死亡的影響 脂質過氧化是鐵死亡的典型征象,包括兩大途徑。在非酶促反應中,磷脂中多不飽和脂肪酸(PUFA-PLS)的二烯丙基位置與氫結合,形成以碳為中心的磷脂自由基(PL·),隨之又與氧反應形成磷脂過氧化物自由基(PL-OO·),然后從其他多不飽和脂肪酸中獲取氫生成脂質過氧化物(PLOOH)和脂質自由基(PL·)[6]。相比之下,酶促反應主要由脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)執行,可催化PUFA的雙氧反應以產生各種PLOOH[7]。在此之前,游離多不飽和脂肪酸可以激活酰基輔酶 A 合酶長鏈家族成員4(acyl-coA synthetase long-chain family member 4,ACSL4)進行酯化,并通過溶血磷脂酰膽堿酰基轉移酶 3(recombinant lysophosphatidylcholine acyltransferase 3,LPCAT3)與膜磷脂結合,ACSL4上調被認為是鐵死亡的生物標志物[8]。脂代謝異常最終產生的脂質過氧化物會改變脂質雙層的物理性質,同時分解為反應性毒物(如4-羥基-2-壬烯醛和丙二醛),這些醛類可通過交聯促進鐵死亡[9]。

(三)系統Xc-及其對鐵死亡的影響 Xc-轉運蛋白系統由調節亞基溶質載體家族3成員2(solute carrier family 3 member 2,SLC3A2)和催化亞基溶質載體家族7成員11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)組成,以1∶1的比例從細胞中釋放谷氨酸同時攝取胱氨酸。胱氨酸被還原為半胱氨酸,在谷氨酰半胱氨酸合酶/谷胱甘肽合酶的作用下合成谷胱甘肽(glutathione,GSH)[10]。GSH是哺乳動物細胞中最豐富的抗氧化劑,可以降低細胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)的積累。研究發現GSH的缺失會導致谷胱甘肽過氧化物酶失活,隨后篩選出谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4),該基因的敲低或過表達可影響Erastin誘導的鐵死亡,但對其他形式的細胞死亡沒有影響[11]。綜上,GPX4利用含有半胱氨酸的谷胱甘肽來消除脂質過氧化物,如果此過程受阻就會引發鐵死亡。GPX4是一種硒蛋白,而甲羥戊酸途徑的產物異戊烯基焦磷酸鹽(isopentenyl pyrophosphate,IPP)是合成硒代半胱氨酸的重要來源[12]。因此,IPP 和甲羥戊酸通路的抑制劑(他汀類藥物)也可通過影響 GPX4 來調節鐵死亡。

(四)其他通路及其對鐵死亡的影響 Bersuker等[13]使用 CRISPR-Cas 9技術發現了一種完全獨立于GPX4-GSH-半胱氨酸軸的鐵死亡調控系統,當過表達線粒體凋亡誘導因子-2(AIFM2)時,可彌補GPX4缺失的影響。由于AIFM2在鐵死亡中發揮的作用,它被重新命名為鐵死亡抑制蛋白-1(ferroptosis-suppressor-protein 1,FSP1),其機制是通過NADPH將輔酶Q10(coenzyme Q10,CoQ10)還原為泛素醇,泛素醇再捕獲脂質過氧化物。Kraft等[14]通過全基因組篩選證實GTP水解酶1(GTP cyclohydrolase 1,GCH1)產生的代謝物四氫生物蝶呤(tetrahydrobiopterin,BH4)可生成還原性CoQ10,并且作為內源性自由基捕獲抗氧化劑防止細胞膜破壞,抑制鐵死亡。Mao等[15]發現二氫乳清酸脫氫酶(dihydroorotate dehydrogenase,DHODH)與線粒體GPX4協同作用,通過將泛醌還原為泛醇來抑制鐵死亡。

二、靶向鐵死亡在肝病中的作用

鐵死亡可見于不同類型的肝病,如酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、病毒性肝炎、肝纖維化、自身免疫性肝炎、肝細胞癌等,這表明靶向鐵死亡可能對肝臟相關疾病的治療有一定的價值。

(一)酒精性肝病 肝臟是酒精代謝的主要場所,過量飲酒產生的有毒代謝物作用于肝細胞后涉及許多細胞因子、趨化因子和活性氧的炎癥級聯反應,最終導致肝細胞死亡,這是酒精性肝病的基本病理過程[16]。有研究發現,酒精處理的小鼠肝臟中脂質代謝的下游標志物,前列腺素內過氧化物合酶 2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,Ptgs2)mRNA被上調,腹腔注射鐵死亡抑制劑(Fer-1)可減輕酒精誘導的肝損傷和脂質過氧化[17]。在另一項研究中,酒精性肝炎小鼠中脂蛋白-1的過表達促進了甘油三酯的合成和脂肪酸的氧化,加速了鐵的積累,導致鐵死亡和肝損傷的發生[18]。You等[19]發現酒精暴露增加了FNDC3B表達, FNDC3B缺失通過抑制AMP活化蛋白激酶(AMPK)來加重酒精誘導的肝脂肪變性。Zhou等[20]報道,腸道sirtuin1(SIRT1)缺乏可以抑制酒精性肝損傷小鼠的鐵死亡,與野生型組相比,在腸道SIRT1敲除的小鼠肝臟中觀察到鐵代謝功能障礙改善,肝臟谷胱甘肽含量增加,脂質過氧化減弱。Zhang等[21]發現,富馬酸二甲酯通過激活核因子E2相關因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)途徑抑制鐵死亡,對酒精誘導的氧化損傷具有保護作用。總的來說,鐵死亡與酒精性肝病密切相關,抑制鐵死亡可作為該疾病治療的新靶點。

(二)非酒精性脂肪性肝病 非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)與酒精無關,其主要特征是肝脂肪積累過多。當除外酒精或其他次要因素導致肝內脂肪含量>5%時,絕大多數會發生單純性脂肪變性,隨著疾病的進展可發展為非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)、肝硬化甚至肝細胞癌[22]。高鐵飲食加劇了氧化應激和炎癥反應,加速了小鼠NAFLD 向 NASH 的進展[23]。Tsurusaki等[24]證明了在NASH小鼠模型中,鐵死亡抑制劑(trolox或去鐵胺)可逆轉脂質過氧化,同時抑制免疫細胞的浸潤和炎癥反應,從而改善肝功能。Qi等[25]觀察到RSL3(一種鐵死亡誘導劑)治療可加重蛋氨酸/膽堿缺乏飲食(methionine and choline deficient diet,MCD)誘導的NASH小鼠的生化及炎癥表現,而給予亞硒酸鈉(一種GPx4激活劑)、甲磺酸去鐵胺鹽或利普他汀可阻礙脂質過氧化和細胞死亡,說明GPX4及其相關的鐵死亡可能在NASH的發展中起主要作用。Li等[26]證明花生四烯酸代謝可觸發鐵死亡,靶向鐵死亡可減輕MCD飲食誘導的NASH小鼠的病理狀態。Liu等[27]發現烯酰輔酶A水合酶1(ECH1)在NASH患者活檢標本和喂食MCD飲食的小鼠中顯著增加,ECH1過表達極大地緩解了肝臟氧化應激。Zhu等[28]發現胸腺素β4(Tβ4)可有效改善高脂飲食(high-fat diet,HFD)誘導的NAFLD大鼠模型中的肝脂代謝相關指標,并抑制肝細胞系LO2中棕櫚酸誘導的鐵死亡。

(三)病毒性肝炎 病毒性肝炎的進展與鐵死亡進程也存在一定的關聯。在一項體外實驗[29]中發現,甲型肝炎病毒 3C 蛋白酶(3Cpro)誘導的細胞死亡伴隨著強烈的脂質過氧化,并被Fer-1有效抑制。此外,HBV X 蛋白 (HBx) 被證實通過 EZH2 介導抑制SLC7A11表達以促進急性肝衰竭中的鐵死亡[30]。Su等[31]通過采用TCGA數據庫進行病例對照研究,發現鐵死亡相關基因 SLC1A5 可能是 HBV 相關肝細胞癌的極好預測因子,并與不良預后、晚期進展和免疫抑制微環境相關。Liu等[32]發現HBV可抑制 SRSF2 來調節 PCLAF 異常可變剪接,并通過 SRSF2/PCLAF tv1 軸減少鐵死亡導致索拉非尼耐藥。Yamane等[33]發現 HCV復制受到鐵死亡的影響,并由脂肪酸去飽和酶2(fatty acid desaturase 2,FADS2)介導,通過抑制FADS2可以顯著抑制鐵死亡,進而增強了HCV的復制能力。

(四)肝纖維化 肝纖維化的機制涉及上皮或內皮屏障破壞、慢性炎癥和肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)活化[34]。與正常肝臟相比,在纖維化肝臟中觀察到HSC中的鐵離子顯著增加和脂質過氧化,說明鐵死亡可能參與肝纖維化過程[35]。相關研究發現,天然藥物通過靶向鐵死亡作用于肝纖維化的治療。蒿甲醚通過抑制SLC7A11重組蛋白介導的p53表達上調,間接導致GPX4失活,最終促進HSC中的鐵死亡,改善肝纖維化[36]。青蒿琥酯是青蒿素的水溶性半琥珀酸衍生物,以鐵蛋白吞噬介導的方式顯著促進HSC的鐵死亡來緩解肝纖維化[37]。此外,野生苦瓜提取物作為肝纖維化的潛在抗纖維化劑,通過調節ER應激和鐵死亡來減弱脂多糖誘導的HSC活化[38]。RNA結合蛋白ZFP36 / TTP(ZFP36無名指蛋白)和ELAVL1 / HuR(ELAV樣RNA結合蛋白1)在調節HSC的鐵死亡中也起著重要的作用[39, 40]。Erastin或索拉非尼通過含溴蛋白 7 (BRD7)-p53 -溶質載體家族25 成員28 (BRD7-P53-SLC25A28)軸誘導HSC鐵死亡來抑制小鼠肝纖維化[41]。TRF是一種富含血清的金屬結合蛋白,已被證明可通過鐵死亡緩解肝纖維化[42]。最近,Shen等[43]發現YTHDF1 N6-甲基腺苷(m6A)修飾可能通過促進BECN1 mRNA的穩定性并激活自噬來增強HSC鐵死亡。因此,靶向鐵死亡是治療肝纖維化的一種潛在的策略。

(五)自身免疫性肝炎 有研究表明,用Fer-1處理后自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)模型小鼠的Nrf2和血紅素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)水平下調。抑制鐵死亡顯著改善了AIH對Nrf2/HO-1信號通路的影響,鐵死亡可作為導致AIH的引發劑或中間介質[44]。另一項研究報道鐵死亡與刀豆球蛋白A(ConA)誘導的AIH肝損傷中成纖維細胞生長因子4(FGF4)表達有關,表明FGF4可能是AIH細胞鐵死亡發展中不可或缺的調節因子[45]。Zeng等[46]發現,AIH小鼠中抑制鐵死亡也顯著抑制了肝臟吲哚胺 2,3-雙加氧酶 1(indoleamine 2,3-dioxygenase1,IDO1)的上調和硝化應激,表明IDO1依賴性鐵死亡確定為治療AIH的新靶點。

(六)肝癌 肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)由于起病隱匿、治療效果不佳等原因預后極差。索拉非尼作為多激酶抑制劑被廣泛應用于治療晚期HCC,通過抑制系統Xc-功能,進而抑制胱氨酸輸入和GSH合成,最終導致脂質過氧化和鐵死亡[47],鐵螯合劑去鐵胺(DFX)能明顯抑制索拉非尼對肝癌細胞的毒性作用[48]。Bai等[49]發現氟哌啶醇作為一種sigma受體拮抗劑,能促進Erastin和索拉非尼誘導的鐵死亡。Sun等[50]證實奎西辛巰基氧化酶1(quiescin sulfhydryl oxidase 1,QSOX1)通過驅動 EGFR 內體運輸和抑制Nrf2 活化來促進索拉非尼誘導的HCC鐵死亡。另外,納米顆粒藥物為鐵死亡治療肝癌提供了新的途徑。Tang等[51]將索拉非尼與錳硅納米顆粒結合,通過快速吞噬細胞內GSH導致腫瘤細胞發生鐵死亡。Ou等[52]成功設計并制造了一種新型的低密度脂蛋白納米顆粒,該顆粒以天然ω-3多不飽和脂肪酸二十二碳六烯酸(LDL-DHA)為主要成分,可通過抑制GPX4活性來引發脂質過氧化和鐵死亡,從而抑制腫瘤生長,并且還能擾亂HCC中氧化還原平衡。還有研究發現,低表達的視網膜母細胞瘤蛋白(Rb)能有效促進索拉非尼引起的HCC細胞鐵死亡[53]。γ干擾素(interferon γ,IFNγ)通過抑制系統Xc-使HCC細胞對鐵死亡敏感[54]。

除了誘導鐵死亡外,防止產生耐藥性也是HCC治療的替代策略。Sun等[55]發現索拉非尼以Nrf2依賴方式誘導金屬硫蛋白-1G(MT-1G)的表達,這進一步促進了索拉非尼的耐藥。Jennies等[56]發現TP53基因與Pro47(S47變異型)發生突變時,對Erastin導的鐵死亡表現出顯著的抵抗力。Zhao 等[57]發現富含乳酸的癌細胞可使 AMP 活化蛋白激酶(AMPK)失活,從而增強具有抗鐵死亡特性的單不飽和脂肪酸的產生。Shang等[58]發現,銅藍蛋白(ceruloplasmin ,CP)的缺失可促進厄拉斯汀和RSL3引起的HCC細胞的鐵死亡,并導致細胞內亞鐵離子和脂質ROS的積累。白血病抑制因子受體亞基α(LIFR)的缺失也可通過上調由核因子κ-B(NF-κB)介導的鐵螯合細胞因子脂質運載蛋白2(LCN2)來誘導肝臟腫瘤的發生和對藥物相關性鐵死亡的抵抗[59]。所以,通過調控上述的分子靶標可降低索拉非尼的耐藥情況。除此以外,YAP/TAZ和ATF4[60]、BAP1[61]、 DAZAP1[62]、 GSTZ1[63]、 lncRNA GABPB1-AS1[64]及環狀RNA cIARS[65]等,都可通過靶向鐵死亡在HCC的進展中發揮關鍵作用,這為進一步臨床轉化奠定了基礎。

三、鐵死亡的誘導劑和抑制劑

鐵死亡是一把雙刃劍,抑制鐵死亡可用于預防鐵過載和脂質代謝異常引起的各種慢性肝損傷,而誘導鐵死亡有助于肝細胞癌的治療。因此,研究鐵死亡誘導劑和抑制劑的作用機制,對開發新的靶向鐵死亡藥物治療不同類型的肝病意義深遠。以下是經典鐵死亡誘導劑和抑制劑的分類(表1和表2)。

表1 鐵死亡誘導劑

表2 鐵死亡抑制劑

四、總結與展望

綜上所述,鐵死亡涉及多種通路的復雜機制,并且參與各類肝病的發生與發展。例如,HBV感染會導致肝細胞鐵死亡而加劇炎性進展,但是從宿主角度來說,肝細胞鐵死亡又提醒宿主驅動免疫系統清除HBV。目前靶向鐵死亡被很多學者視為治療肝病新途徑,但在鐵死亡的研究中也存在一定的局限性。首先,研究結果多基于動物模型,缺乏可靠的臨床證據,并且其治療的安全性和毒副作用仍有待認證;其次,許多肝病可能同時具有多種細胞死亡模式,鐵死亡與其他細胞死亡之間的聯系需要進一步研究。最后,現階段對鐵死亡的研究多集中在HCC上,對其他肝臟疾病及鐵死亡通路上游機制研究相對較少。未來在肝病的背景下,需要更多的證據來揭示鐵死亡在不同時期疾病中的作用,尋找高特異性、靈敏性的生物標志物和檢測方法來闡明鐵死亡的特征。隨著鐵死亡相關研究的不斷深入,勢必將會對各類肝病的診斷及治療提供新的臨床策略。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。