鮑魚臟器堿提多糖的分離純化、結構表征及抗氧化活性研究

林志超，潘曉明，吳啟賜，薛 鈺，黃家福，潘裕添,*

（1.閩南師范大學菌物產業工程技術中心，福建漳州 363000；2.萌得爾（廈門）生物科技有限公司，福建廈門 361000）

鮑魚是一種海洋單殼軟體貝類，具有重要的營養價值[1]，富含蛋白質[2]、脂肪[3]、糖類[4-5]、氨基酸、維生素、微量元素等營養成分，有重要的生物功能和很高的生物活性[6-7]，在生命科學和醫藥上具有巨大的研究和應用價值[8]。而在鮑魚的深加工過程中，占鮑魚體重的20%～30%的臟器通常被廢棄[9-11]，造成經濟損失和環境污染。研究表明，鮑魚臟器多糖有廣泛的生物學活性，如抗氧化[12]、抗腫瘤[13]、免疫調節、降血糖、降血脂[14]、抗病毒等[15-16]。

鮑魚臟器多糖提取方法有水提、堿提和酶法提取等[17]。這些方法各有優缺點：水提法成本低，對多糖結構影響小，但提取率低且耗時；酶法提取效率高，條件溫和，但成本高，對多糖結構影響較大；堿提法成本低，效率高，但要注意控制提取條件，pH 應迅速調中性，以防止多糖降解[18]。堿提法適用于酸性多糖的提取[19]，而海洋生物多糖大都為酸性多糖[20]。但鮑魚臟器堿提多糖鮮有報道，因此，對比鮑魚臟器堿提多糖與其他方法提取的鮑魚臟器多糖在單糖組成、分子量大小等結構及組成上的異同，具有一定的研究價值和意義。

本文采用熱堿水浸提法和層析法制備高純度Aavp，并利用紅外光譜法、高效液相色譜、氣相色譜和化學方法等分析純化Aavp 的初級結構，最后檢測其體外抗氧化活性。本文著眼于海洋生物資源的高效開發，旨在提高鮑魚的經濟附加值，充分利用廢棄的鮑魚臟器資源，為鮑魚產業的可持續發展提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雜色鮑（Haliotis diversicolor）福建省東山縣長盛食品有限公司；單糖標準品（D-木糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-甘露糖、D-阿拉伯糖和D-鼠李糖）、葡聚糖（Dextran T-10、T-40、T-70、T-110 和T-500）優級純，美國Sigma 公司；Tris、硫酸、苯酚、乙醇、鹽酸、溴化鉀、乙酸酐、高碘酸鈉、鹽酸羥胺、吡啶、氫氧化鋇、乙二醇、抗壞血酸、鄰苯三酚、DPPH 等分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

UV-2102PC 型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；Senco R1002B 旋轉蒸發儀 上海申生科技有限公司；SBS-100 數控計滴自動部分收集器 上海滬西分析儀器有限公司；Pellicon XL 超濾膜包 Biomax 5 kDa 0.005 m2美國Millipore 公司；7890B 氣相色譜、Agilent 1200 HPLC 系統、1260 Infinity II 示差檢測器 美國Agilent 公司；?KTA pure 蛋白純化系統 美國GE 公司；NICOLET iS10傅里葉紅外光譜儀 德國賽默飛世爾公司；TG209-F1 熱重分析儀 德國耐馳公司；UV-3200PC 紫外可見光譜儀 上海美譜達儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 Aavp 粗多糖提取 參考戴宏杰等[21]的方法加以改進。具體方法如下：從雜色鮑中剝離鮑魚臟器，并去除鮑魚臟器的結締組織及脂肪組織，洗凈消化道中的食物殘渣，勻漿后凍干，研磨后過30 目篩備用。取10 g 凍干粉，用4 倍質量95%乙醇60 ℃下回流6 h 進行脫脂[22]，重復兩次，干燥，用8 倍質量超純水在95 ℃下提取3 h，重復三次，過濾。濾渣加入100 mL 0.5 mol/L NaOH 溶液中，95 ℃水浴攪拌3 h，離心（10000 r/min，10 min）。濾渣提取2 次，合并上清液。調節上清液至pH7，經旋轉蒸發濃縮得濃縮液。將4 倍質量95%乙醇與濃縮液混合過夜，離心（12000 r/min，20 ℃，15 min），沉淀用超純水溶解，并用旋轉蒸發儀脫去殘余乙醇（60 ℃）。再用超濾（5000 Da）除鹽濃縮，Sevage 法去除蛋白質[23]，旋蒸去除有機溶劑，凍干備用。

1.2.2 多糖含量及多糖得率計算 用苯酚-硫酸法測定多糖含量[24]，其標準曲線回歸方程為y=0.0125x+0.0625，R2=0.9983。分別按公式（1）和（2）計算多糖含量及多糖得率。

式中：D，純化后凍干粉多糖含量，%；c，樣品溶液多糖濃度，mg/mL；v，溶液總體積，mL；n，稀釋倍數；m1，鮑魚臟器多糖凍干粉質量，g。

式中：G，鮑魚臟器凍干粉多糖得率，%；c，樣品溶液多糖濃度，mg/mL；v，溶液總體積，mL；n，稀釋倍數；m2，鮑魚臟器凍干粉質量，g。

1.2.3 Aavp 純化

1.2.3.1 DEAE Sepharose Fast Flow（DFF）柱層析參考林志超等[25]方法加以改進，確定層析方法如下：稱取5 g 粗多糖Aavp，充分溶解于40 mL Tris-HCl（pH7.2，50 mmol/L）溶液，0.2 μm 微孔濾膜過濾，上樣至DFF 陰離子交換柱（柱體積為Φ 5.0 cm×25 cm），用0.5 mol/L NaCl 溶液梯度洗脫，流速為2 mL/min，收集洗脫液，檢測多糖含量。以管數為橫坐標，多糖含量為縱坐標，繪制洗脫曲線。根據洗脫曲線收集主峰，減壓旋轉蒸發濃縮，真空冷凍干燥備用。

1.2.3.2 Sephacryl S-400 HR 柱層析 經過預實驗，確定層析方法如下：采用0.2 mol/L NH4HCO3溶液在流速30 mL/h 下平衡Sephacryl S-400 HR 柱（柱體積為Φ 2.6 cm×90 cm）24 h 后，40 mg 通過上述DFF 柱層析獲得的多糖組分溶解于1 mL 0.2 mol/L NH4HCO3溶液后上樣，收集洗脫液并檢測多糖含量，繪制洗脫曲線，收集洗脫曲線主峰，減壓旋轉蒸發，超純水透析（4 ℃），至超純水中檢測不出Cl-（AgNO3沉淀法[26]），真空冷凍干燥備用。

1.2.4 Aavp 初級結構分析

1.2.4.1 Aavp 純度檢測及分子量測定 利用HPLC檢測Aavp 組分純度及分子量[27]。多糖標準溶液：Dextran T-10、T-40、T-70、T-110 和T-500，濃度為10 mg/mL。HPLC 色譜條件：Agilent ZORBAX GF-250 分析柱，流速0.3 mL/min，柱溫65 ℃，流動相為超純水，采用示差檢測器檢測，溫度65 ℃，進樣體積20 μL。以標準樣品色譜峰的保留時間對Mw 的對數進行回歸，得回歸方程。將Aavp 樣品的保留時間代入回歸方程，得Mw。

1.2.4.2 紫外光譜分析 將多糖樣品配制成0.5 mg/mL 的水溶液，在200～500 nm 波長范圍內進行紫外波長掃描[28]。

1.2.4.3 紅外光譜分析 將1 mg 干燥的純化多糖樣品和100 mg 溴化鉀研磨均勻，壓成透明薄片后，上傅里葉紅外光譜儀分析，掃描波數為400～4000 cm-1[29]。

1.2.4.4 單糖組成分析 稱取200 mg 純化Aavp 樣品，溶于4 mL 1 mol/L 的H2SO4溶液，封管，100 ℃水浴反應8 h 后，用飽和Ba（OH）2溶液中和，離心（3000 r/min，10 min），上清液濃縮至4 mL，再離心（12000 r/min，10 min）去除沉淀物，上清液真空冷凍干燥，備用。稱取10 mg 上述凍干樣品和系列單糖標準品，加入10 mg 鹽酸羥胺和0.5 mL 吡啶，90 ℃水浴30 min，冷卻至室溫，再加0.5 mL 乙酸酐，90 ℃水浴30 min，樣品經0.45 μm 有機膜過濾后進行GC分析。

氣相色譜條件：A.T.農殘1 號毛細管柱（Φ 0.53 mm×30 m）；氫火焰離子化檢測器（FID）；氣化室溫度270 ℃；柱溫恒溫220 ℃；檢測器溫度300 ℃；氣體流速：載氣N2為20 mL/min；H2為30 mL/min；空氣為200 mL/min；進樣量1 μL。

1.2.4.5 糖苷鍵測定 采用張惟杰[30]的方法加以修改。

標準曲線繪制：分別吸取0、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0 mL 濃度為15 mmol/L NaIO4標準溶液于試管中，加純水至4 mL。從上述各管中分別吸取20 μL溶液，加水定容至5 mL，在223 nm 下測定吸光度。以NaIO4溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

高碘酸氧化：稱取樣品205 mg，加入150 mL NaIO4溶液，避光反應。于4、24、48 h 等間隔時間取樣稀釋250 倍后，223 nm 測定吸光度值。待其穩定后，加入過量乙二醇并攪拌30 min。吸取2 mL 樣液，以酚酞為指示劑，用0.01 mol/L NaOH 溶液標定，以NaIO4溶液為空白對照測定HCOOH 產生量。剩余樣液加入過量KBH4，避光反應18～24 h。將經上述處理后的樣液用5000 Da 超濾膜超濾去除過量KBH4，凍干得多糖醇干品。

Smith 降解：取多糖醇10 mg 加入5 mL 2 mol/L硫酸溶液，酒精噴燈封管，100 ℃水浴8 h。結束后，加入Ba（OH）2粉末中和，過濾，濾渣用少量水洗滌，合并濾液與洗液，凍干。

氣相分析：方法同1.2.4.4。

1.2.4.6 熱重分析 通過熱失重分析儀測定Aavp 的熱穩定性。條件為：N2流速：50 mL/min；溫度范圍：28～900 ℃；升溫速率：10 ℃/min。

1.2.5 抗氧化活性測定

1.2.5.1 多糖體外清除O2-·能力測定 根據王麗娟等[31]的方法進行適當改進。用超純水配制不同濃度的抗壞血酸，分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL；同時分別配制0.2、0.8、1.6、3.2、6.4 mg/mL 的Aavp 粗多糖溶液和Aavp IIa 溶液。取2.55 mL Tris-HCl 溶液（pH8.2，0.05 mol/L），25 ℃恒溫預熱20 min，加入0.4 mL 上述不同濃度的抗壞血酸溶液、Aavp 粗多糖溶液和Aavp IIa 溶液，再加入10 mmol/L 鄰苯三酚0.05 mL，振蕩搖勻，反應4 min后立即加入50 μL 10 mol/L HCl 終止反應，325 nm處測定其吸光度。按公式（3）計算清除率。

式中：B，O2-·清除率，%；A0，空白組在波長325 nm 處的吸光值；Ai，試樣組在波長325 nm 處的吸光值。

1.2.5.2 多糖體外清除DPPH·能力測定 抗壞血酸和Aavp IIa 分別用1.2.5.1 方法配制成溶液。將2 mL 0.2 mmol/L DPPH·溶液（無水乙醇溶解）加入2 mL 不同濃度上述的抗壞血酸和Aavp IIa 溶液中，混勻，室溫避光反應30 min，在517 nm 下測定吸光度。按公式（4）計算DPPH·清除率。

式中：C，DPPH·清除率，%；A0，空白組在波長517 nm 處的吸光值；Ai，試樣組在波長517 nm 處的吸光值。

1.3 數據處理

試驗重復三次，利用Design Expert 8.0.6 進行數據統計分析，采用Origin 2017 軟件繪圖，SPSS 26.0軟件進行顯著性分析（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 Aavp 的分離純化

2.1.1 DEAE Sepharose Fast Flow 純化 經過方法

1.2.3.1 處理，Aavp 得率為11.21%。Aavp 經DFF 層析柱分離后，分別得Aavp I 和Aavp II（圖1），得率分別為3.08%和61.63%。經真空冷凍干燥后，獲得Aavp I 和Aavp II 為質地較硬的白色晶體，可能是洗脫液中鹽分未除去，進一步采用尺寸排阻層析分離。

圖1 Aavp 的DEAE Sepharose Fast Flow 柱層析洗脫曲線Fig.1 Elution curve of Aavp on a DEAE Sepharose Fast Flow column

2.1.2 Sephacryl S-400 HR 純 化 Aavp I 和Aavp II 分別進行Sephacryl S-400 HR 層析，結果如圖2所示。Aavp Ia 得率及多糖含量分別為78.62%和90.99%，呈白色絮狀固體，可能是因為小分子鹽大部分被洗脫，剩下主要是大分子多糖，不易結晶，從而呈絮狀。Aavp IIa 得率及多糖含量分別為90.34%和98.66%，也呈白色絮狀固體。Aavp Ia 保留時間和Aavp IIa 相差不大，說明兩者分子量可能較為接近。結合圖1 和圖2 可看出，Aavp II 組分得率較高，而組分Aavp IIa 得率也高于組分Aavp IIb。因此，選擇Aavp IIa 進行結構初步分析。

圖2 Aavp 的Sephacryl S-400 HR 柱洗脫曲線圖Fig.2 Elution curve of Aavp on a Sephacryl S-400 HR column

2.1.3 Aavp IIa 純度和分子量 由圖3A 可得回歸方程：lgMw=32.254-4.4177tR，R2=0.9902。如圖3B所示，Aavp IIa 在9.1872 min 時具有一個對稱尖銳單峰，說明該組分純度高。將Aavp IIa 保留時間代入方程，得Aavp IIa Mw 為166513 Da。與程婷婷等[32]的結果相比，其鮑魚臟器多糖分子量約為3×105Da，顯著高于Aavp IIa，這可能是因為程婷婷采用的酶解法與本文的提取方法不同。

圖3 分子量標準曲線（A）和Aavp IIa HPLC 圖譜（B）Fig.3 Standard curve of molecular weight (A)and HPLC spectrum of Aavp IIa (B)

2.2 Aavp IIa 的初級結構分析

2.2.1 紫外光譜分析 由圖4 可知，Aavp IIa 在260和280 nm 處沒有紫外吸收，而粗多糖有紫外吸收，說明經過純化后的Aavp IIa 基本不含核酸和蛋白質。

圖4 鮑魚臟器堿性多糖紫外圖譜Fig.4 Ultraviolet spectra of Aavp

2.2.2 紅外光譜分析 Aavp IIa 與溴化鉀混勻壓片后進行紅外光譜分析，如圖5 所示，Aavp IIa 具有典型的多糖光譜信號[33]，3367.1 cm-1峰是O-H 伸縮振動造成的；2892.7 cm-1峰是C-H 伸縮振動造成的；1643.05 cm-1峰是-CHO 的C=O 伸縮振動造成；Aavp IIa 在1730～1700 cm-1不產生吸收峰，表明其不含糖醛酸或者是含量極少[34]；1369.21 與1419.35 cm-1是 C-H 變角振動造成的；1029.73、1076.08 和1155.115 cm-1處的吸收峰說明有吡喃糖單元結構片段[28]；858.17 cm-1處存在吸收峰，說明Aavp IIa含有α-型吡喃多糖[35]。本紅外圖譜與李冬梅等[36]的紅外圖譜相比，都具有典型多糖信號，但是沒有硫酸基吸收峰，說明兩種多糖還是存在一定的差別。

圖5 Aavp IIa 傅里葉紅外圖譜Fig.5 Infrared spectra of Aavp IIa

2.2.3 單糖組成分析 單糖標樣的保留時間如下：木糖（xyl）1.529 min、葡萄糖（glu）2.253 min、半乳糖（gal）2.361 min 和阿拉伯糖（ara）1.506 min。由表1可知，組分Aavp IIa 有兩個峰，保留時間分別為1.53 和2.359 min，可推知Aavp IIa 單糖組分分別為木糖和半乳糖。根據峰面積推算，兩者摩爾百分比分別為43.91%和56.09%。李冬梅等[36]的研究結果顯示，皺紋盤鮑臟器多糖的單糖組成為巖藻糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和鼠李糖，與本文有所差異。這可能是因為李冬梅是用堿性蛋白酶解法獲得皺紋盤鮑臟器多糖，而本文則用堿處理水煮的濾渣制備得堿提多糖，從而造成Aavp IIa 的單糖組分較少的情況。

表1 多糖組分Aavp IIa 單糖組分分析Table 1 Analysis of monosaccharide component of Aavp IIa

2.2.4 糖苷鍵測定結果 Aavp IIa 經高碘酸氧化處理，每摩爾己糖殘基消耗2.694 9 mol 高碘酸，沒有甲酸產生。對圖6 分析，產物中各個組分摩爾百分比為：甘油20.20%，赤蘚醇11.81%，木糖33.85%，半乳糖34.14%。根據高碘酸氧化-Smith 降解原理，半乳糖殘基1→4 糖苷鍵生成赤蘚醇，1→3 糖苷鍵生成半乳糖，半乳糖1→2、1→6 糖苷鍵生成甘油；木糖殘基1→2、1→4 糖苷鍵生成甘油，1→3 糖苷鍵生成木糖。根據上述數據可計算出，Aavp IIa 中半乳糖1→4 糖苷鍵摩爾百分比為11.81%，半乳糖1→3 糖苷鍵為34.14%，由于甲酸沒有產生，所以Aavp IIa 中沒有半乳糖1→6 糖苷鍵，同時可推知，半乳糖1→2 糖苷鍵為10.14%。Aavp IIa 中木糖1→3 糖苷鍵摩爾百分比為33.85%，由于木糖1→2、1→4 糖苷鍵的最終產物都為甘油，通過高碘酸氧化和Smith 降解無法分辨出兩種糖苷鍵的比例，只能得到以下結論：可能性1，當只含木糖1→4 和木糖1→3 時，木糖1→4 摩爾百分比為10.06%；可能性2，當只含木糖1→2 和木糖1→3 時，木糖1→2 摩爾百分比為10.06%；可能性3，當含有木糖1→4、1→2 和木糖1→3 時，木糖1→4 和木糖1→2 總的摩爾百分比為10.06%。

圖6 單糖標樣及Aavp IIa 的Smith 降解產物GC 圖譜Fig.6 Gas chromatogram spectrum of monosaccharide standard samples and Smith degradation products of Aavp IIa

2.2.5 熱重分析 從圖7 可知，Aavp IIa 的熱失重有三個階段：第一階段是在室溫到102.4 ℃之間，這一階段的熱失重主要是水分的丟失引起的，熱失重率約為11.59%；第二階段為Aavp IIa 的急速熱分解，在302.4 ℃熱失重達到最大，拐點在226.4 ℃，這階段的熱失重率為43.65%，說明此時多糖分子的化學鍵被破壞，多糖正在被分解；第三階段為Aavp IIa 的緩慢熱分解，拐點在332.6 ℃，這階段的熱失重率為30.89%。熱重結果顯示Aavp IIa 多糖分子在226.4～332.6 ℃劇烈分解，說明Aavp IIa 可在226 ℃以下保持較好的穩定性。

圖7 Aavp IIa 熱重圖Fig.7 TGA curves of Aavp IIa

2.3 Aavp IIa 的抗氧化活性分析

2.3.1 體外清除O2-·能力 如圖8 所示，Aavp IIa 有較強的清除能力，但要弱于抗壞血酸（VC）。當濃度從0～6.5 mg/mL 時，Aavp IIa 的濃度與其清除能力成正相關。當Aavp IIa 的濃度為6.5 mg/mL 時，其對O2-·清除能力最強，達到85.89%。相對地，Aavp粗多糖的消除能力要比Aavp IIa 低，只有30.51%。羅曉航等[37]酶法提取的鮑魚臟器粗多糖濃度低于10 mg/mL 時，幾乎無自由基清除能力；濃度為20 mg/mL 時，清除率也僅為25.4%。這說明堿提多糖對于O2-·清除能力要好于酶法提取的鮑魚臟器多糖。Aavp IIa 多糖分子具有還原性的半縮醛羥基，當其接觸到O2-·之后，就會發生氧化還原反應[38]。

圖8 Aavp IIa 和Aavp 對O2-·的清除能力Fig.8 Scavenging ability of Aavp IIa and Aavp on superoxide anion free radical

2.3.2 體外清除DPPH·能力 多糖作為大分子化合物可以為DPPH·提供質子，從而生成穩定的化合物。因此，多糖具有清除DPPH·的可能，可在517 nm波長處出現吸收減弱，吸收程度與清除活性有關[39]。如圖9 所示，當濃度從0～6.5 mg/mL 時，Aavp IIa 的濃度與其對DPPH·清除能力成正相關。當Aavp IIa 的濃度為6.5 mg/mL 時，其對DPPH 清除能力最高，為62.17%。這說明Aavp IIa 有一定的DPPH 自由基清除能力，但要弱于抗壞血酸（VC），而Aavp 粗多糖的清除率為25.39%。陳勝軍等[40]提取的10 mg/mL 鮑魚內臟多糖的DPPH·的清除率可達97.39%，其清除能力要高于Aavp IIa。這可能是由于Avap IIa 提供電子的能力弱于陳勝軍提取的鮑魚臟器多糖[41]。

圖9 Aavp IIa 和Aavp 對DPPH·的清除能力Fig.9 DPPH· scavenging ability of Aavp IIa and Aavp

3 結論

本研究采用熱堿水浸提法和柱層析法分離制備Aavp，并利用HPLC、GC、紅外光譜、熱重分析及高碘酸氧化-Smith 降解等方法對其進行結構表征。結果顯示，粗多糖經DEAE Sepharose Fast Flow 和Sephacryl S-400 HR 層析，可得Aavp Ia、Aavp Ib、Aavp IIa 和Aavp IIb 等4 種組分，其中Aavp IIa 得率最高，為90.34%，多糖含量為98.66%。對得率最高的Aavp IIa 組分進行表征，分子量為166513 Da，由木糖和半乳糖組成，其摩爾比43.91 : 56.09，為α-型吡喃多糖，在226.4～332.6 ℃范圍內劇烈分解，熱失重率為43.65%。糖苷鍵類型可能為：a.半乳糖1→4 糖苷鍵摩爾百分比為11.81%，半乳糖1→3 糖苷鍵為34.14%，半乳糖1→6 糖苷鍵為0，半乳糖1→2 糖苷鍵為10.14%；b.木糖1→3 糖苷鍵摩爾百分比為33.85%，木糖1→4 和木糖1→2 總的摩爾百分比為10.06%。Aavp IIa 對O2-·的清除率為85.89%，對DPPH·的清除率為62.17%，體現了良好的抗氧化能力。本研究采用熱堿提取法制備鮑魚臟器堿提多糖，并分析其抗氧化活性，為開發利用鮑魚臟器等副產品提供理論依據，也為鮑魚臟器堿提多糖的生物活性研究提供初步證據，后續研究將聚焦于鮑魚臟器堿提多糖其他的生物學活性進行研究。