不同熱處理方法對(duì)元寶楓葉與花中酚類成分及抗氧化活性的影響

楊靈光，劉欣欣，鄧 闖，尹培培

（宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西宜春 336000）

元寶楓（Acer truncatumBunge）屬無患子科槭屬落葉喬木，是我國重要的鄉(xiāng)土樹種。作為多功能資源植物，元寶楓集觀賞、生態(tài)、工業(yè)[1-2]、食用[3-4]、藥用[5]等多種價(jià)值于一身，已在全國20 多個(gè)省、市和地區(qū)人工種植，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值及深入開發(fā)前景[6]。元寶楓葉被認(rèn)為具有多種藥理活性，是元寶楓最有開發(fā)價(jià)值的部位之一。其生物活性成分以酚類物質(zhì)為主，其中黃酮類化合物和綠原酸最早被報(bào)道[7]，隨后其酚類圖譜進(jìn)一步通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）等技術(shù)進(jìn)行表征[8]。藥理活性方面，元寶楓葉提取物被報(bào)道具有抗氧化、抗腫瘤細(xì)胞生長、抑制脂肪酸合酶、抑菌、抗肥胖、抗糖尿病等多種生物活性[9]。團(tuán)隊(duì)前期工作初步優(yōu)化了其酚類提取工藝[10]，明確了酚類組成[11]及季節(jié)性變化特征[12]。元寶楓葉與花具有食用屬性，元寶楓葉茶（又名楓露茶）是我國食用歷史悠久的珍貴茶飲之一[5,13]，元寶楓葉與花在民間也以蒸制等烹飪手段進(jìn)行食用。

加工處理是延長食品保質(zhì)期與提升食品口感品質(zhì)的常用方法，也是茶類飲品生產(chǎn)中的必需過程。熱處理是一種重要的加工方式，它可以將食物轉(zhuǎn)化為可食用狀態(tài)同時(shí)能夠破壞植物中不可溶的結(jié)合態(tài)酚類的共價(jià)鍵從而達(dá)到釋放天然抗氧化物的效果[14]。截止至今，大量關(guān)于熱處理對(duì)于茄子[15]、巴西黑莓[16]、藍(lán)莓[17]、蘋果[18]等食品原料中酚類成分或抗氧化活性影響的研究已經(jīng)得到開展，研究結(jié)果顯示不同種類熱處理對(duì)于不同食品基質(zhì)中的酚類組成及抗氧化活性具有不同影響。作者前期針對(duì)元寶楓葉與花酚類提取物在長時(shí)間高溫環(huán)境中的降解機(jī)制進(jìn)行研究，為其提取物作為抗氧化劑的工業(yè)化制備提供了參考[11]。但目前元寶楓葉與花在食品應(yīng)用相關(guān)熱處理方面的研究尚不深入。

過長時(shí)間的高溫處理并不符合食品生產(chǎn)的要求與實(shí)際流程，且熱處理過程中活性成分與植物基質(zhì)中復(fù)雜環(huán)境發(fā)生的相互作用未能得到描述。由此，亟需對(duì)葉與花進(jìn)行短時(shí)間內(nèi)不同熱處理方法的影響研究。綜上所述，元寶楓葉與花作為具有獨(dú)特風(fēng)味與生物活性的食品及代用茶原料，其加工過程中涉及的短時(shí)間加熱過程對(duì)于葉與花中生物活性成分的影響尚不明確。由此，本研究將探究包括蒸制、微波、烘烤在內(nèi)的熱處理對(duì)于元寶楓葉與花中酚類組成以及抗氧化能力的影響，從而為元寶楓葉與花作為食品的加工處理與深度開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

元寶楓葉與花 于4 月20 日采集自北京市海淀區(qū)八家郊野公園（GPS 坐標(biāo)，40°00'57.21N,116°19'43.36E）中具有相近樹齡及生長環(huán)境的元寶楓樹，植株由北京林業(yè)大學(xué)劉忠華副教授鑒定為元寶楓。采樣時(shí)間是元寶楓的花期，同時(shí)也是元寶楓葉的最佳采收時(shí)間之一[16]。樣品帶回實(shí)驗(yàn)室簡單清理后凍干并研磨為粉末于-80 ℃保存；沒食子酸（gallic acid）、沒食子酸乙酯（ethyl gallate）、1,2,3,4,6-五-O-烯丙基-β-d-葡萄糖（1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-dglucose）、新綠原酸（neochlorogenic acid）、山奈酚-3-O-鼠李糖苷（kaempferol-3-O-rhamnoside）、槲皮素-3-O-阿拉伯吡喃糖苷（quercetin-3-O-arabinopyranoside）、槲皮素-3-O-半乳糖苷（quercetin-3-O-galactoside）、槲皮素-3-O-葡萄糖苷（quercetin-3-O-glucoside）、槲皮素-3-O-鼠李糖苷（quercetin-3-O-rhamnoside）、楊梅素-3-O-鼠李糖苷（myricetin-3-O-rhamnoside）等標(biāo)準(zhǔn)品 色譜級(jí)，中國國家食品藥品監(jiān)督管理局；福林酚、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2-聯(lián) 氮-二（3-乙 基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、6-羥基-2,5,7,8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸（Trolox）、乙腈（色譜級(jí)）和甲酸（色譜級(jí)）美國西格瑪奧德里奇（Sigma-Aldrich）公司；其它試劑 購自上海源葉生物科技有限公司或天津市大茂化學(xué)試劑廠等。

高效液相色譜儀（由兩臺(tái)LC-20AT VP 色譜泵、SPDM20A 紫外分光光度檢測(cè)器、SIL-20AC TH 自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-10AS VP 恒溫箱構(gòu)成）日本島津公司；Tecan Infinite 200 多功能酶標(biāo)儀 瑞士帝肯公司；KQ 300DE 型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品熱處理方法 取元寶楓葉與花樣品，分別以蒸制、微波及烘烤的方式進(jìn)行短時(shí)間熱處理以模擬食品熱加工過程，詳細(xì)參數(shù)如下：

蒸制處理方法[19]：以2100 W 將容器中水煮沸，后將元寶楓樣品干粉以薄層形式平鋪并置放于沸騰后的蒸鍋中，以1000 W 分別蒸制5、15、30 min，蒸制后樣品粉末重新冷凍干燥用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

微波處理方法[20]：將元寶楓樣品干粉以薄層形式平鋪于容器，以2450 MHz，1200 watts 分別微波2、5、10 min，微波后樣品粉末重新冷凍干燥用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

烘烤處理方法[21]：將元寶楓樣品干粉以薄層形式平鋪于容器，置于180 ℃預(yù)熱后的鼓風(fēng)烘箱分別放置5、15、30 min，烘烤后樣品粉末重新冷凍干燥用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 酚類物質(zhì)提取 熱處理后元寶楓葉與花干粉中酚類成分提取以前期優(yōu)化的超聲波輔助乙醇提取法進(jìn)行[10]。提取重復(fù)三次，最終將三次提取所得上清液定容后用于后續(xù)檢測(cè)。

1.2.3 總酚含量測(cè)定 總酚的測(cè)定采用優(yōu)化后的福林酚法[22]。將40 μL 25%的福林酚試劑加入96 孔板，隨后分別加入20 μL 的標(biāo)準(zhǔn)品（10～400 mg/L 沒食子酸，R2=0.999）、不同濃度樣品及空白溶液。混勻后加入140 μL 700 mmol/L Na2CO3溶液，再次混勻后40 ℃避光孵育30 min，使用多功能酶標(biāo)儀在765 nm 波長下測(cè)定吸光度，以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)（x），吸光度值（OD）為縱坐標(biāo)（y），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出被測(cè)樣品溶液中沒食子酸含量，結(jié)果表示為沒食子酸當(dāng)量，表達(dá)為mg GAE/g d.w.。

1.2.4 抗氧化活性測(cè)定

1.2.4.1 DPPH·清除能力測(cè)定 DPPH·清除實(shí)驗(yàn)參照Brand-Williams 等[23]的方法并稍加修改。10 μL標(biāo)準(zhǔn)品（0～400 mg/L Trolox，R2=0.998）、樣品和空白溶液分別加入96 孔板，隨后加入40 μL 濃度1 mmol/L的DPPH 溶液與190 μL 甲醇溶液，混勻后室溫避光孵育30 min。隨后以酶標(biāo)儀在517 nm 處測(cè)定吸光度。自由基清除活性RSA（%）=（A0-AS）/A0×100，A0：空白溶液吸光度值，AS：樣品溶液吸光度值，以Trolox 濃度為橫坐標(biāo)（x），自由基清除率（RSA）為縱坐標(biāo)（y），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出被測(cè)樣品溶液中Trolox 濃度，結(jié)果表示為Trolox 當(dāng)量（μmol TE/100 g d.w.）。

1.2.4.2 ABTS+·清除能力測(cè)定 ABTS+·清除實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[24]報(bào)道方法，并稍作修改。將7 mmol/L的ABTS 水溶液與2.4 mmol/L 的K2S2O8水溶液等量混合，于室溫條件下，避光孵育12～16 h。隨后，以甲醇溶液將上述儲(chǔ)液稀釋到波長734 nm 處吸光度為0.70±0.02 范圍內(nèi)，即得ABTS 工作液。將5 μL的標(biāo)準(zhǔn)品（0～800 mg/L Trolox，R2=0.999）、樣品或空白溶液分別加到96 孔板中，然后各加入200 μL ABTS 工作液。在30 ℃的黑暗條件下孵育5 min后，隨后以酶標(biāo)儀于734 nm 處測(cè)定其吸光度。自由基清除活性RSA（%）=（A0-AS）/A0×100，A0：空白溶液吸光度值，AS：樣品溶液吸光度值，以Trolox 濃度為橫坐標(biāo)（x），自由基清除率（RSA）為縱坐標(biāo)（y），建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出被測(cè)樣品溶液中Trolox 濃度，結(jié)果表示為Trolox 當(dāng)量（μmol TE/100 g d.w.）。

1.2.4.3 氧自由基吸收能力（ORAC）測(cè)定 ORAC實(shí)驗(yàn)參照Ou 等[25]，實(shí)驗(yàn)所需試劑均用75 mmol/L 的磷酸鹽緩沖液（pH7.4）進(jìn)行溶解，實(shí)驗(yàn)全程避光。將25 μL 標(biāo)準(zhǔn)品（Trolox 5～50 μmol/L，R2=0.995）、樣品和空白溶液分別加入96 孔板，加入75 μL 的熒光素（0.20 μmol/L），混勻后37 ℃孵育15 min。隨后，分別加入100 μL 37 ℃預(yù)熱AAPH 溶液，放入37 ℃預(yù)熱的多功能酶標(biāo)儀中測(cè)定，激發(fā)光為530 nm，發(fā)射光為485 nm。每1.5 min 記錄一次數(shù)據(jù)，共記錄75 min。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的凈面積為標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液的曲線下面積減去空白溶液的曲線下面積。以Trolox 濃度為橫坐標(biāo)（x），曲線下面積（AUC）為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出被測(cè)樣品溶液中Trolox 濃度，結(jié)果表示為Trolox 當(dāng)量（μmol TE/100 g d.w.）。

1.2.5 高效液相色譜（HPLC）測(cè)定10 種主要酚類單體含量 色譜條件：色譜柱為Dikma Diamonsil C18（5 μm，250×4.6 mm i.d.）反相色譜柱，柱溫箱溫度設(shè)為30 °C，流速1.0 mL/min，單次進(jìn)樣量為10 μL，流動(dòng)相A 為含有0.4%甲酸的水溶液，流動(dòng)相B 為乙腈。紫外檢測(cè)器波長設(shè)定為280 nm，梯度洗脫條件見表1。

表1 元寶楓葉與花中的單體酚類化合物HPLC梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions for phenolic compounds of Acer truncatum leaves and flowers

標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備：為了檢測(cè)元寶楓葉與花內(nèi)酚類單體物質(zhì)的變化規(guī)律，包括沒食子酸、沒食子酸乙酯、1,2,3,4,6-五-O-烯丙基-β-d-葡萄糖、新綠原酸、山奈酚-3-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-阿拉伯吡喃糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、以及楊梅素-3-O-鼠李糖苷在內(nèi)的10 種標(biāo)準(zhǔn)品混標(biāo)儲(chǔ)備液由66%乙醇配制并進(jìn)行線性檢測(cè)。混標(biāo)溶液由上述相同HPLC 條件檢測(cè)。由此高效液相法測(cè)得10 種酚類單體含量之和為液相法測(cè)定所得總酚含量（TPLC）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

主成分分析（PCA）及聚類分析使用SIMCA 軟件（版本14.0）進(jìn)行。本文涉及數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)重復(fù)至少為3 次。使用SPSS軟件（版本22.0）單因素方差分析（one-way ANOVA）中的Tukey’s HSD 檢驗(yàn)確認(rèn)統(tǒng)計(jì)學(xué)是否存在顯著差異，P＜0.05 被設(shè)定為存在顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同熱處理前后總酚含量的變化

首先對(duì)熱處理前后元寶楓葉與花的總酚含量分別進(jìn)行測(cè)定，以觀測(cè)熱處理對(duì)福林酚法測(cè)得總酚含量（TPFC）的影響。如圖1A 所示，未處理元寶楓葉的TPFC 為75.80±3.54 mg GAE/g，而蒸制及微波處理并未導(dǎo)致其含量產(chǎn)生顯著性變化（P＞0.05）。但三個(gè)烘烤時(shí)間處理均使得元寶楓葉的TPFC 相較于未處理組顯著提高（82.55±2.54～87.78±1.53 mg GAE/g）（P＜0.05），其中LB30 的TPFC 含量最高，為L0 的1.16 倍。而未處理元寶楓花樣品的TPFC 為90.11±1.84 mg GAE/g，其中各樣品組之間總酚含量均未產(chǎn)生顯著性變化（P＞0.05）。以液相色譜法測(cè)定得到各酚類單體含量，求和得到液相法總酚含量（TPLC），并與TPFC 進(jìn)行比較探究其所占份額。總體而言，TPLC 構(gòu)成了TPFC 含量的主體部分，在未處理及任一處理組別中均占比84%以上（圖1B）。從整體含量上來看，30 min 蒸制、微波以及烘烤處理均造成元寶楓葉中TPLC 含量顯著增加（圖1C）（P＜0.05）。而在元寶楓花中，F(xiàn)S10、FB5 中TPLC 含量顯著提高，而FM10 中TPLC 顯著降低（圖1D）（P＜0.05）。蒸制、微波和烘烤三種熱處理都存在加劇破壞細(xì)胞壁從而利于酚類物質(zhì)的釋放的能力，并在高溫下分子運(yùn)動(dòng)加快，從而形成更多游離的酚類化合物[26]。

圖1 不同熱處理?xiàng)l件下元寶楓葉（A、C）、花（B、D）的總酚含量變化Fig.1 Variation of total phenolic contents of Acer truncatum leaves (A,C)and flowers (B,D)upon different thermal treatments

2.2 不同熱處理前后酚類單體化合物的變化

縱使總酚含量近似，熱處理仍可能導(dǎo)致不同酚類單體化合物含量產(chǎn)生變化從而改變其酚類組成。由此，對(duì)前期工作篩選得到的元寶楓葉與花中共同存在的10 種高表達(dá)酚類單體化合物進(jìn)行測(cè)定（表2），以觀察主要酚類單體受熱處理影響的變化趨勢(shì)[11]。如表2 所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線在檢測(cè)范圍內(nèi)均具有較高的線性相關(guān)性（R2＞0.998）。

表2 元寶楓葉與花中10 種主要酚類單體高效液相色譜測(cè)定中的回歸方程、模型決定系數(shù)和檢測(cè)范圍Table 2 Regression equations,determination coefficients and linear ranges of the ten major phenolics from Acer truncatum leaves and flowers

如圖2 所示，未處理元寶楓葉中黃酮醇類化合物含量最高，其中的楊梅素-3-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷、山奈酚-3-O-鼠李糖苷含量分別達(dá)到15.95±1.39、10.98±1.07、10.78±1.16 mg/g。沒食子酸類物質(zhì)中，1,2,3,4,6-五-O-烯丙基-β-d-葡萄糖與沒食子酸乙酯含量分別達(dá)到11.3±0.57 與7.37±0.61 mg/g，而新綠原酸含量為3.01±0.11 mg/g。包括沒食子酸、沒食子酸乙酯、1,2,3,4,6-五-O-烯丙基-β-d-葡萄糖在內(nèi)的沒食子酸類物質(zhì)含量在三種熱處理方法中均有不同程度上升。具體來說，沒食子酸類化合物含量隨著蒸制時(shí)間增長而進(jìn)一步提升（圖2A 中酚類單體1～3），而較長時(shí)間的微波或烘烤處理反而導(dǎo)致其含量增加幅度有所降低（圖2B、圖2C 中酚類單體1～3）。新綠原酸除在LB30 中含量顯著性下降外（P＜0.05），其余加熱組與未處理樣品均無明顯變化（圖2 中酚類單體4）。黃酮醇類化合物變化趨勢(shì)較為復(fù)雜，其中山奈酚-3-O-鼠李糖苷、槲皮素-3-O-阿拉伯吡喃糖苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、楊梅素-3-O-鼠李糖苷含量不變或稍有下降（圖2 中酚類單體5、6、8、10），而槲皮素-3-O-半乳糖苷與槲皮素-3-O-鼠李糖苷含量顯著上升（圖2 中酚類單體7、9）（P＜0.05）。

圖2 元寶楓葉單體酚類在蒸制（A）、微波（B）、烘烤（C）下的含量變化Fig.2 Variation of phenolic compounds of Acer truncatum leaves upon steam (A),microwave (B),and baking (C)treatments

如圖3 所示，在未處理元寶楓花中沒食子酸類物質(zhì)含量最高，其中1,2,3,4,6-五-O-烯丙基-β-d-葡萄糖與沒食子酸乙酯含量分別達(dá)到30.62±1.63 與13.46±1.71 mg/g。黃酮醇類含量次之，其中山奈酚-3-O-鼠李糖苷與槲皮素-3-O-半乳糖苷最高，分別為7.09±0.25 與5.58±0.76 mg/g，而新綠原酸含量僅為0.64±0.08 mg/g。元寶楓花樣品中沒食子酸與1,2,3,4,6-五-O-烯丙基-β-d-葡萄糖含量同樣整體呈上升趨勢(shì)，但沒食子酸乙酯含量幾乎不變或反而有所下降（圖3 中酚類單體1～3）。元寶楓花和葉中沒食子酸含量的增加可能是由于加熱過程中單寧酸或其它成分發(fā)生水解導(dǎo)致[27]。而微波熱處理則顯著提高了元寶楓花中的新綠原酸含量（P＜0.05），且提高幅度與時(shí)間長度呈正相關(guān)（圖3B 中酚類單體4）。花中多數(shù)黃酮醇單體含量呈下降趨勢(shì)，僅有部分單體在特定處理時(shí)間下含量顯著上升（P＜0.05），如FS10、FM5、FB10 中的槲皮素-3-O-鼠李糖苷（圖3 中酚類單體9）。從整體趨勢(shì)上來看，元寶楓花內(nèi)單體酚類變化趨勢(shì)相較于元寶楓葉相對(duì)平緩。

圖3 元寶楓花單體酚類在蒸制（A）、微波（B）、烘烤（C）下的含量變化Fig.3 Variation of phenolic compounds of Acer truncatum flowers upon steam (A),microwave (B),and baking (C)treatments

2.3 不同熱處理前后抗氧化活性的變化

自由基導(dǎo)致的氧化應(yīng)激是細(xì)胞內(nèi)的重要事件，與包括癌癥、心血管疾病、帕金森病和自身免疫性疾病在內(nèi)的多種退行性疾病密切相關(guān)，因此抗氧化劑在預(yù)防及干預(yù)上述疾病過程中具有重要意義[28]。抗氧化活性是酚類及黃酮類化合物的特征活性之一，為了對(duì)不同處理下元寶楓葉與花的抗氧化能力進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，以三種不同的檢測(cè)方法對(duì)各熱處理組樣品進(jìn)行測(cè)定。

如圖4 所示，未處理元寶楓葉與花在DPPH、ABTS、ORAC 三組評(píng)價(jià)體系下分別具有接近的Trolox當(dāng)量，具體數(shù)值為690.18±14.21～800.94±44.52 μmol TE/100 g d.w.與1065.55±22.67～1211.06±13.20 μmol TE/100 g d.w.。DPPH 法測(cè)定結(jié)果顯示葉與花的DPPH 法測(cè)定結(jié)果變化趨勢(shì)近似，蒸制與烘烤導(dǎo)致葉與花的DPPH 值整體不變或下降（圖4A～圖4B，圖4E～圖4F），但微波法整體導(dǎo)致DPPH 值呈不依賴于處理時(shí)間的交錯(cuò)上升（圖4C、圖4D）。然而ABTS 值的變化趨勢(shì)在葉與花中并不一致，蒸制熱處理導(dǎo)致葉的ABTS 值呈時(shí)間依賴性顯著上升（圖4A），但花中的ABTS 值不變或顯著性下降（圖4B）。與之相反，微波導(dǎo)致葉中ABTS 值不變或下降（圖4C），而FM10 中ABTS 值顯著提高（圖4D）（P＜0.05）。ORAC 法測(cè)定結(jié)果顯示，三種熱處理方法均造成了處理后樣品ORAC 值的顯著上升。值得注意的是，過長時(shí)間的烘烤處理（30 min）導(dǎo)致元寶楓葉與花中ORAC 值上升幅度相較于10 min 烘烤處理顯著下降，表明抗氧化活性物質(zhì)存在復(fù)雜的變化（圖4E、圖4F）。

圖4 不同熱處理?xiàng)l件下元寶楓葉（A,C,E）與花（B,D,F）的抗氧化活性變化Fig.4 Variation of antioxidant capacities of Acer truncatum leaves (A,C,E)and flowers (B,D,F)upon different thermal treatments

2.4 總酚和主要單體酚類含量的主成分及聚類分析

以總酚及單體含量為觀測(cè)值對(duì)不同熱處理組進(jìn)行主成分分析（PCA）以及聚類分析（HCA），以檢驗(yàn)樣品之間差異情況并直觀評(píng)價(jià)樣品分類合理性。基于元寶楓葉與花模型匯總擁有最高貢獻(xiàn)率的兩個(gè)主成分建立投影，分別得到對(duì)應(yīng)散點(diǎn)圖（圖5A、圖6A）、載荷圖（圖5B、圖6B），并對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析（圖7）。如圖5A 所示，基于其總體與單體酚類成分差異，元寶楓葉在不同處理之間存在較好區(qū)分。與此同時(shí)，在相同處理的不同時(shí)長上，不同處理組間同樣存在區(qū)分。如蒸制處理中，由L0 到LS5 與LS10，樣品點(diǎn)分布由第2 象限移至第3 象限，而由LS10 到LS30，樣品點(diǎn)移動(dòng)至趨近原點(diǎn)中心。圖5B 所示載荷圖中各數(shù)據(jù)點(diǎn)距離原點(diǎn)中心的距離表明各單體酚類及總酚含量對(duì)于組間差異影響程度貢獻(xiàn)大小。其中LB15 與槲皮素-3-O-半乳糖苷、山奈酚-3-O-鼠李糖苷同屬于第4 象限，顯示槲皮素-3-O-半乳糖苷、山奈酚-3-O-鼠李糖苷在LB15 中含量較高并貢獻(xiàn)于其與其他組樣品的區(qū)分。而LB30 與楊梅素-3-O-鼠李糖苷及TPFC 同處于第二象限，顯示楊梅素-3-O-鼠李糖苷含量變化所導(dǎo)致的總酚含量變化可能貢獻(xiàn)于LB30 的區(qū)分度。

圖5 不同熱處理?xiàng)l件下元寶楓葉主成分分析得分圖（A）與載荷圖（B）Fig.5 Scoring (A)and loading (B)plot of principle components analysis on the variation of Acer truncatum leaves upon different thermal treatments

圖6 不同熱處理?xiàng)l件下元寶楓花主成分分析得分圖（A）與載荷圖（B）Fig.6 Scoring (A)and loading (B)plot principle components analysis on the variation of Acer truncatum flowers upon different thermal treatments

圖7 不同熱處理?xiàng)l件下元寶楓葉（A）與花（B）主成分分析的聚類分析圖Fig.7 Hierarchical clustering plot of principle components analysis on the variation of Acer truncatum leaves (A)and flowers (B)upon different thermal treatments

如圖6A 所示，除FM10 外，不同處理下的元寶楓花樣品間存在交叉較多，這符合花中酚類成分在不同處理下含量變化較少的前期結(jié)果。如圖6B 所示，F(xiàn)M10 與其中含量較高的沒食子酸、新綠原酸、楊梅素-3-O-鼠李糖苷一同被歸屬于第4 象限。

樣品聚類分析（HCA）結(jié)果如圖7 所示，具有接近分類距離樣品被歸為一類。元寶楓葉聚類結(jié)果如圖7A 所示，L0 與LS5、LS10 聚類為第I 大類，而剩余樣品聚類為第II 大類。第II 聚類中LB30 組與其它組具有明顯的分類距離從而被單獨(dú)歸為一小類。上述結(jié)果顯示短時(shí)間蒸制處理對(duì)于元寶楓葉內(nèi)酚類成分及抗氧化活性改變較小，而長時(shí)間烘烤處理造成獨(dú)特的轉(zhuǎn)變。如圖7B 所示，F(xiàn)M10 單獨(dú)聚為第I 大類，而剩余樣品組成的第II 大類可進(jìn)一步被劃分為三小類。具體來說，F(xiàn)0 為第一小類，F(xiàn)B15、FB30、FM5 為第二小類，F(xiàn)M2、FB5 與蒸制樣品為第三小類。上述結(jié)果說明長時(shí)間微波處理造成元寶楓花中酚類成分轉(zhuǎn)變幅度最大。

2.5 不同熱處理前后總酚、單體酚類化合物含量及抗氧化活性水平的相關(guān)性分析

對(duì)測(cè)定所得的總酚、單體酚類化合物含量，以及抗氧化活性水平在各組熱處理之間的相關(guān)性進(jìn)行分析。結(jié)果如圖8A 所示，元寶楓葉中福林酚法測(cè)得總酚（TPFC）與沒食子酸與1,2,3,4,6-五-O-烯丙基-β-d-葡萄糖呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），而液相色譜法測(cè)得總酚（TPLC）與包括沒食子酸、沒食子酸乙酯，以及1,2,3,4,6-五-O-烯丙基-β-d-葡萄糖在內(nèi)的沒食子酸類物質(zhì)呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），表明沒食子酸類物質(zhì)是元寶楓葉中酚類的重要組成。除此之外，槲皮素-3-O-鼠李糖苷與DPPH 值顯著正相關(guān)，而槲皮素-3-O-半乳糖苷與ORAC 值顯著正相關(guān)（P＜0.05），說明槲皮素類物質(zhì)對(duì)于抗氧化活性起主要貢獻(xiàn)。如圖8B 所示，上述含量與水平在元寶楓花中分主要為兩大類。其中，新綠原酸與DPPH、ABTS 兩種抗氧化水平呈顯著正相關(guān)，而楊梅素-3-O-鼠李糖苷與ORAC 水平顯著正相關(guān)（P＜0.05），反應(yīng)上述兩種單體化合物在元寶楓花的抗氧化活性變化中起主導(dǎo)作用。而槲皮素-3-O-阿拉伯吡喃糖苷、槲皮素-3-O-半乳糖苷、1,2,3,4,6-五-O-烯丙基-β-d-葡萄糖、以及TPLC 含量與DPPH、ABTS 兩種抗氧化水平呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），說明上述成分在元寶楓花的熱處理過程中可能是主要的降解成分，所生成的其他物質(zhì)具有更高的抗氧化能力。

圖8 不同熱處理?xiàng)l件下元寶楓葉（A）與花（B）酚類成分及抗氧化活性之間相關(guān)性熱圖Fig.8 Correlation heat map of phenolic constitutions and antioxidant levels of Acer truncatum leaves (A)and flowers (B)among different thermal treatments

3 討論

本文對(duì)元寶楓花與葉進(jìn)行多種短時(shí)間處理以模擬食品生產(chǎn)過程中的熱加工手段，從而表征其對(duì)樣品中酚類成分及抗氧化活性的影響。研究結(jié)果顯示，元寶楓葉與花在多數(shù)熱處理下總酚含量未產(chǎn)生顯著性變化。即使總酚含量相同，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)元寶楓葉與花中酚類組成及抗氧化活性變化并不相同。Rodriguez-Mateos 等[17]探究了烹飪、發(fā)酵和烘烤對(duì)于野生藍(lán)莓中酚類成分的影響，結(jié)果同樣顯示總體酚類含量不變而多種單體成分含量具有顯著差異。

雖然前期工作表明元寶楓葉與花中具有相近的單體酚類組成[11]，但本文發(fā)現(xiàn)在相同熱處理中葉與花酚類含量變化呈現(xiàn)不同的規(guī)律，沒食子酸類化合物在三組元寶楓葉熱處理樣品中均顯著升高，而元寶楓花中酚類單體變化趨勢(shì)整體相較于葉更為平緩。葉與花中抗氧化活性成分的差異化改變可能與葉與花的基質(zhì)組成與結(jié)構(gòu)不同有關(guān)。滕紅梅等[29]通過解剖葉片發(fā)現(xiàn)，元寶楓葉細(xì)胞整體呈長柱形，排列緊密，且具有海綿組織及2～3 層?xùn)艡诒”诮M織，從結(jié)構(gòu)層面印證了元寶楓葉對(duì)于熱處理反應(yīng)較不敏感的原因。

據(jù)研究報(bào)道，熱處理可導(dǎo)致存在于食品基質(zhì)中的高分子量聚合物產(chǎn)生降解，從而釋放構(gòu)成聚合物的低分子量亞基，并且這些低分子量化合物常具有較高的生物活性及吸收效率[30-31]。本研究中，元寶楓葉與花內(nèi)沒食子酸類化合物含量在熱處理后均有較大幅度的提升。沒食子酸及其衍生物作為水解單寧的基本構(gòu)成單元，經(jīng)不斷聚合形成沒食子單寧，在槭樹中廣泛存在[32]。由此，本文中新生成的沒食子酸類化合物推測(cè)為由沒食子單寧在加熱環(huán)境中經(jīng)水解產(chǎn)生，上述沒食子酸水解過程在Lu 等[33]、Munteanu 等[34]和Kim 等[35]的研究中均有報(bào)道。

不同處理對(duì)于抗氧化水平造成不同影響，ORAC 水平在多數(shù)元寶楓葉與花熱處理后顯著提高。ORAC 法測(cè)定一段時(shí)間內(nèi)抗氧化劑對(duì)于過氧自由基脅迫的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)保護(hù)能力，相較于DPPH 與ABTS 法單一時(shí)間點(diǎn)清除率的計(jì)算模式而言能夠更全面與準(zhǔn)確描述抗氧化活性[34]。Zhang 等[15]測(cè)定了紫茄在熱處理過程中的酚類及抗氧化活性變化，結(jié)果顯示其中沒食子酸含量在多種處理中均有提升，但DPPH 與ABTS 法測(cè)定的抗氧化活性卻均呈下降趨勢(shì)，本研究結(jié)果與其一致。

主成分及相關(guān)性分析顯示，沒食子酸類衍生物含量的變化與TPFC 及TPLC 含量變化顯著相關(guān)，再次說明高溫導(dǎo)致的沒食子酸單寧類物質(zhì)的降解生成了以沒食子酸、沒食子酸乙酯，以及1,2,3,4,6-五-O-烯丙基-β-d-葡萄糖為代表的的小分子衍生物[35-36]。整體而言，在葉與花中不同酚類單體對(duì)于整體抗氧化活性具有差異化貢獻(xiàn)。

4 結(jié)論

本研究對(duì)元寶楓花與葉進(jìn)行多種短時(shí)間熱處理以模擬食品熱加工手段，從而表征樣品中酚類成分及抗氧化活性的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果顯示，不同熱處理方法造成的影響之間差異明顯。此外，元寶楓葉與花的總酚含量變化不大，而其中酚類單體成分變化顯著。于此同時(shí)，以O(shè)RAC 水平為代表的抗氧化能力在多數(shù)元寶楓葉與花熱處理后顯著提高。綜上所述，熱處理方式與加熱時(shí)間對(duì)于元寶楓葉與花中的酚類組成及抗氧化能力具有不同影響，因此選擇合適的熱處理?xiàng)l件對(duì)于其生物活性及商品價(jià)值的提升尤為重要。作為食品資源而言，元寶楓葉在熱處理過程中的酚類組成改變及抗氧化活性提成表現(xiàn)優(yōu)于元寶楓花，本研究為元寶楓葉與花在食品領(lǐng)域的加工處理與深入開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。