基于高產胞外粗多糖的白靈芝發酵茶培養基配方優化

卯明娟，劉 迪，周會明,*，白玉英，洪 鵬，王佳琳，楊流波，陳真敏

（1.滇西科技師范學院生物技術與工程學院，云南臨滄 677000；2.延邊大學農學院，吉林延吉 133002）

白靈芝（Ganoderma leucocontextum）又稱為藏靈芝、白肉靈芝或藏白靈芝，作為一種常見的中藥材，其生長于高海拔地區，是靈芝屬少有且具有重要經濟價值的低溫型靈芝種質資源[1-3]。該菇菌肉潔白，菇體富含多糖類物質[4]、三萜類化合物[5]、粗蛋白質等活性成分[6-7]，其中，多糖類物質是白靈芝最主要的活性成分[8]且含量高于其他普通靈芝品種[9]，具有抗氧化應激[10]、增強免疫力[11]、延緩衰老[12]等多種生物活性和藥理作用，為該菇在治療多種疾病方面提供了一定的理論基礎，也已成為保健食品研發的重要資源[13-14]，被稱為高品質的種類，售價高于普通靈芝數倍，市場開發前景好[7,15]。

胞外粗多糖是大型真菌細胞分泌到胞外的多糖物質，參與了多種生理和病理過程，其生物合成過程涉及多種酶催化反應，各種酶的表達和活性受到多種內外因素的調節，如菌株遺傳特性[16]、營養條件[17]、非營養條件[18]等因素影響下菇體胞外多糖的產量存在明顯的差異，白靈芝也不例外。據胡惠萍等[15]報道，西藏林芝地區的兩株白靈芝菌株其多糖含量差異較大，同時，劉艷芳等[14]對該菇子實體與菌絲體中多糖含量進行了測定，結果顯示，白靈芝液體發酵后菌絲體中的多糖含量明顯高于人工栽培子實體，但關于營養因素與非營養因素對該菇胞外粗多糖的影響未見報道。白靈芝作為多糖類活性成分豐富且稀有的藥用種質資源，因該菇基礎研究系統性不足、人工培養歷史短、栽培技術不完善、優良菌種選育滯后、產品開發技術落后等導致其市場供應受限[19-20]，功能性成分有待深入研究。液體發酵技術可提供大型真菌適宜的營養條件，具有生產周期短、成本低、產量高等優點[21]，能在短時間內生產大量的胞外粗多糖[22]。因此，通過液體發酵技術的手段提高白靈芝胞外粗多糖的產量對推進該菇的開發利用進程具有重要意義。

茶葉是世界公認的健康飲品且具有多重保健功效[23]，對靈芝多糖的形成有顯著的促進作用[24]。馬鈴薯營養豐富、全面，葡萄糖容易被菌絲體吸收，均能為大型真菌液體發酵提供充足的碳源和能量[25-26]。紅土是茶樹生長適宜的土壤類型之一，其浸出液有利于提高菇類的菌絲生物量[27]。

本研究結合當地的低檔茶葉資源，采用液體發酵技術，在馬鈴薯紅土葡萄糖培養基的基礎上，以其胞外粗多糖產量為考察指標，探究了基礎培養基各組分的濃度、茶葉的種類及其顆粒大小對白靈芝液體培養特性與胞外粗多糖分泌的影響。同時，采用正交試驗、方差分析、相關性分析等方法明確白靈芝高產胞外粗多糖的最佳營養條件及其影響因素，以期為該菇多糖的提取、功能性產品的開發提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白靈芝（Ganoderma leucocontextum）菌種由云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所提供；綠茶、白茶、紅茶 均購于云南省臨滄市雙江縣邦丙鄉茶農；普洱茶 購于云南省西雙版納州勐海縣茶農；馬鈴薯 購于臨滄市臨翔區老祥云；紅土 采集于滇西科技師范學院校園綠化林；瓊脂、葡萄糖 均為分析純，北京奧博生物技術有限公司。

LS-75HG 型立式壓力蒸汽滅菌器 江陰濱江醫療設備有限公司；PB-21PH 酸度計 德國賽多利斯公司；TS-2102 恒溫搖床 上海天呈實驗儀器制造有限公司；TDL-4 臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；RE-52 系列旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；TD-35 數字折光儀 浙江托普儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化、接種及培養 將常溫活化的白靈芝菌種轉接至PDA 平板培養基內，27 ℃下恒溫培養5～7 d[28]。待菌絲長滿培養基平板后，用孔徑為0.5 cm 的打孔器對菌落均勻打孔，取同心圓3 個菌塊接于各液體培養基內，在27 ℃、遮光、121 r/min的恒溫搖床內培養15 d，記錄菌絲萌發與菌球形成時間（d）[29]。

1.2.2 單因素實驗 基于發酵基礎培養基（馬鈴薯200 g，紅土3 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 L，pH 自然）分別制作馬鈴薯（100、200、300 g/L）、葡萄糖（0、10、20、30 g/L）、紅土（0、1、2、3 g/L）、茶葉（0、16、20、24 g/L）各單因素液體培養基，其中馬鈴薯洗凈切成1 cm3的小方塊，煮至玻璃棒戳后散開，經層紗布過濾，取馬鈴薯汁；紅土研磨后經200 目網篩處理，粉末煮10 min 后8 層紗布過濾，取濾液；有關采用液體發酵法測定食用菌在茶葉基質上其胞外粗多糖產量的研究僅在綠茶上有所報道[24]，故本研究以綠茶為代表開展茶葉添加量篩選試驗，試驗采用無糖培養基，茶葉在500 mL 自來水中煮沸10 min，取茶湯，同時，以上述質量濃度為20 g/L 的綠茶配方對照，茶葉處理方式由茶湯變為茶粉，干茶葉粉碎后過200 目網篩（孔徑0.075 mm），取茶粉。上述培養液分裝于三角瓶（100 mL/250 mL）內，每處理3 次重復，121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min，冷卻后趁熱（30 ℃左右）接菌。

1.2.3 正交試驗 根據單因素實驗結果，明確正交試驗的因素數值范圍，在茶葉的質量濃度為20 g/L 的基礎上，參考茶粉顆粒直徑相關文獻[30]，以馬鈴薯（A）、葡萄糖（B）、紅土（C）、茶葉種類（D）、茶粉顆粒大?。‥）為因子，設計L16（45）正交試驗（表1），每處理3 次重復，以多糖產量為主要指標，并綜合其他指標設計篩選出最佳的組合。

表1 正交試驗因素與水平設計Table 1 Orthogonal test factor and level design

1.2.4 指標測定 發酵液的顏色參照日本傳統色彩CMYK 標準色卡進行比對測定；邀請10 位食品科學專業且味覺敏感的大學生組成評定小組，采用感官評價法測定發酵液的味道，以甜味、酸味、澀味、苦味、甘甜五個主要感官標準來評價，每個標準又分為輕微、適中、較重三個程度，綜合考慮各味道的標準和程度作為試驗結果；取過濾后的發酵液80 mL，在4000 r/min 轉速下離心10 min，取1/2 體積上清液，置于旋轉蒸發儀上濃縮至20 mL，再將得到液體用95%的乙醇溶液定容至40 mL，裝入三角瓶，置于4 ℃溫度下靜置12 h，4000 r/min 下離心10 min，棄上清液，取沉淀37 ℃下烘干、稱重，即為胞外粗多糖含量（g/L）[31]；取上述發酵液，采用數字折光儀上測定其可溶性固形物[32]；用酸度計測定pH[33]；記錄菌球的形狀與表面特征，取100 粒菌球，置于培養皿內排成一排直線，測量其長度，計算其菌球直徑（mm）[34]；取10 mL 初始發酵液檢測菌球的數量，并計算菌球總數（個/L）；發酵液經200 目篩過濾后的記錄菌球濕重，37 ℃下烘干至恒重，測定菌球干重（g/L），即為菌球生物量[35]。

1.3 數據處理

采用SPSS 22.0 軟件對試驗數據進行顯著性（P＜0.05）、相關性以及通徑分析[36]，每組實驗重復測定三次，結果均用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 不同馬鈴薯添加量對白靈芝液體培養特性的影響

由表2 可知，馬鈴薯為100 g/L 時，其胞外粗多糖產量與菌球生物量最大，分別達到0.15 g/L、4.82±0.55 g/L；馬鈴薯為200 g/L 時，白靈芝菌球數量（404.45±54.54 個/L）與菌球直徑（11.24±1.75 mm）最大；馬鈴薯為300 g/L 時，菌絲萌發（2 d）與菌球形成（3.3 d）時間最短，白靈芝發酵液可溶性固形物含量（1.33%±0.15%）與pH（4.16）均最大，上述所有最大值與其相應同列最小值相比差異均顯著（P＜0.05）。同時，馬鈴薯為200 g/L 時發酵液呈淡黃色，微酸，其余處理均為半透明色、淡菌香味；菌球為球形，表面有少量毛刺?？傊?，適宜的馬鈴薯添加量能顯著提高該菇胞外粗多糖的產量，正交試驗中其4 個水平設置為50、100、200、300 g/L。

表2 不同馬鈴薯添加量對白靈芝液體培養特性的影響Table 2 Effects of different potato additions on the liquid culture characteristics of Ganoderma leucocontextum

2.2 不同葡萄糖添加量對白靈芝液體培養特性的影響

由表3 可知，不同葡萄糖添加量對白靈芝液體培養特性的影響較大，葡萄糖為0 g/L 時菌絲萌發（2 d）與菌球形成（3 d）時間最短，其發酵液pH（5.16）最大，葡萄糖為10 g/L 時其胞外粗多糖產量（0.36±0.02 g/L）與菌球數量（1631.11±93.65 個/L）均最大，葡萄糖為30 g/L 時其發酵液可溶性固形物含量（1.87%±0.06%）、菌球生物量（6.34±1.14 g/L）、菌球直徑（15.21±1.99 mm）均最大，上述所有最大值與其他梯度相比差異均極顯著（P＜0.01）。同時，4 個處理發酵液均為淡黃色，以淡菌香味為主，其中處理4有輕微酸味；菌球為球形，表面有少量毛刺?？傊?，添加葡萄糖均能極顯著提高該菇胞外粗多糖的產量，正交試驗中的4 個水平分別設置為10、20、30、40 g/L。

表3 不同葡萄糖添加量對白靈芝液體培養特性的影響Table 3 Effects of different glucose additions on the liquid culture characteristics of Ganoderma leucocontextum

2.3 不同紅土添加量對白靈芝液體培養特性的影響

由表4 可知，發酵液紅土添加量為2 g/L 時，其菌球形成時間（3 d）最短，發酵液pH（4.18）與菌球數量（491.11±74.33 個/L）均達到最大；未添加紅土時，該菇胞外粗多糖產量（0.55±0.04 g/L）、菌球生物量（7.14±0.28 g/L）、菌球直徑（12.88±0.75 mm）均最大；紅土添加量為1 g/L 時，其菌絲萌發時間最短（2 d）。除發酵液酸堿度外，上述所有最大值與其相應同列最小值相比差異均顯著（P＜0.05）。同時，4 個處理發酵液為淡黃色，以淡菌香味為主，但添加2 g/L 紅土配方上為香甜味；菌球為球形，除未添加紅土配方菌球毛刺較多外，其他處理表面毛刺較少?？傊?，添加紅土不利于該菇胞外粗多糖的分泌，但為驗證是否與其它因素存在交互作用，故設置其正交4 個水平分別為0.5、1、2、3 g/L。

表4 不同紅土添加量對白靈芝液體培養特性的影響Table 4 Effects of different red soil additions on the liquid culture characteristics of Ganoderma leucocontextum

2.4 不同茶葉添加量及其處理方式對白靈芝液體培養特性的影響

試驗結果表明，不同茶葉（以綠茶為代表）濃度對白靈芝液體培養特性的影響較大，由表5 可知，未添加綠茶茶湯時，該菇菌絲萌發（2 d）與菌球形成（3 d）時間最短，其發酵液可溶性固形物含量（1.27%±0.12%）、菌球數量（1153.33±80.00 個/L）、菌球生物量（4.42±0.32 g/L）均最大；綠茶添加量為16 g/L 時，發酵液pH（5.61）、菌球直徑（33.51±3.63 mm）均最大；綠茶添加量為20 g/L 時，其胞外粗多糖含量（0.29±0.03 g/L）最大。上述所有最大值與其他梯度相比差異均顯著（P＜0.05）。同時，4 個處理發酵液為深褐色，淡菌香味和茶香味；菌球球形，毛刺多?？傊?，添加綠茶能極顯著提高該菇胞外粗多糖的產量，且不同茶葉種類其營養成分差距較大，為獲得更多胞外粗多糖產量，故固定茶葉的濃度為20 g/L，設置不同種類的茶葉（綠茶、白茶、紅茶、普洱茶）作為正交試驗的4 個水平。

表5 不同綠茶添加量對白靈芝液體培養特性的影響Table 5 Effects of different green tea additions on the liquid culture characteristics of Ganoderma leucocontextum

由表6 可知，該菇在2 種茶葉處理方式上其菌絲萌發時間相同，其中添加茶粉濃度為20 g/L 的培養基上該菇胞外粗多糖產量是茶湯處理上的5.07 倍，除發酵液可溶性固形物（0.97±0.06%）與pH（4.61）外，其余參數均明顯高于茶湯組，故添加茶粉更有利于多糖分泌和菌絲體生長，且菌液具有清香味，菌香味更濃?？傊?，為探究不同茶葉顆粒大小對該菇胞外粗多糖產量的影響，故設置不同茶粉顆粒大?。?.5、0.9、0.15、0.075 mm）作為正交試驗的4 個水平。

表6 不同綠茶處理方式對白靈芝液體培養特性的影響Table 6 Effects of different green tea treatments on liquid culture characteristics of Ganoderma leucocontextum

2.5 正交試驗組合對白靈芝液體培養特性的影響

由表7 可知，極差分析法結果顯示，5 個因素對白靈芝胞外粗多糖分泌的影響從大到小順序為：葡萄糖＞茶葉種類＞紅土＞馬鈴薯＞茶粉顆粒大小，其最優組合（A2B4C4D4E4）與顯著性分析（A1B4C4D4E4）結果不一致，經進一步驗證試驗，該菇在組合A1B4C4D4E4上除發酵液pH 與菌球直徑值均略小于組合A2B4C4D4E4外，其余參數均優于后者，其中胞外粗多糖產量達到1.49±0.33 g/L。因此，以胞外粗多糖為指標，最優組合為：馬鈴薯50 g/L、葡萄糖40 g/L、紅土3 g/L、普洱茶20 g/L、茶粉顆粒大小0.075 mm。

表7 以胞外粗多糖產量為指標的極差分析表Table 7 Range analysis table with extracellular crude polysaccharide production as index

由表8 可知，16 種正交組合對該菇液體培養特性影響較大，其中該菇在配方9、配方16 上菌絲萌發（2 d）與菌球形成（3 d）時間均最短，配方12 均最長；其發酵液可溶性固形物含量（4.87±0.25%）、pH（4.89）、菌球直徑（12.90±8.32 mm）、菌球數量（5493.33±170.10 個/L）、菌球生物量（32.18±5.19 g/L）分別在配方12、配方6、配方9、配方4、配方8 上最大，而在配方5、配方1、配方4、配方13、配方9 上最小，且上述所有最大值與其他梯度相比在0.05 與0.01 水平上差異均顯著（P＜0.05）。同時，發酵液多為枯茶色和赤褐色（圖1），以甜菌香味為主且伴有清涼和微澀口感；菌球以球形或卵形為主，少數不規則，均有毛刺，配方3 和11 毛刺較長，配方4、6、7 毛刺較短，配方9、11、12 發酵液較清澈。

圖1 不同正交組合下白靈芝在搖瓶內菌絲培養情況Fig.1 Mycelial culture of Ganoderma leucocontextum in shake flasks under different orthogonal combinations

表8 不同正交組合對白靈芝液體培養特性的影響Table 8 Effects of different orthogonal combinations on liquid culture characteristics of Ganoderma leucocontextum

2.6 白靈芝胞外粗多糖含量與其它液體培養特性相關性與通徑分析

由表9 可知，白靈芝的胞外粗多糖含量與發酵液pH、菌球生物量呈不顯著正相關，與發酵液可溶性固形物、菌球數量呈顯著正相關（P＜0.05），與菌絲萌發時間、菌球形成時間、菌球直徑呈不顯著負相關（P＞0.05）。因此，該菇胞外粗多糖含量與其它液體培養特性之間均存在一定程度的相關性。

表9 胞外粗多糖含量與其它液體培養特性相關性Table 9 Correlation between extracellular polysaccharide content and other liquid culture characteristics

上述相關性僅表明白靈芝胞外粗多糖含量與其它液體培養特性之間的直接關系，需要通過逐步回歸分析法把上述相關性分解為直接作用與間接作用，以明確不同液體培養特性的相互作用對該菇胞外粗多糖分泌的影響。

以胞外粗多糖含量為因變量Y，菌絲萌發時間、菌球形成時間、可溶性固形物含量、pH、菌球直徑、菌球數量、菌球生物量分別為自變量X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7，剔除回歸系數不顯著的自變量，建立多元線形回歸方程Y=0.048+0.111X3+9.939X6（F=28.365，P=0.000＜0.01）且該方程F檢驗達到極顯著，有必要再次做通徑分析。

由表10 可知，在與胞外粗多糖含量（Y）的相關性中，自變量與Y 的相關系數、直接通徑系數以及決策系數均為X6＞X3，間接通徑系數總和卻相反（X3＞X6），說明X6對Y 的相關程度、直接作用、綜合作用均大于X3，X3通過X6對Y 的間接作用大于X6通過X3對Y 的間接作用（0.120＞0.083），即發酵液可溶性固形物含量對該菇胞外粗多糖分泌的間接影響大于其菌球數量，但菌球數量對其分泌的直接作用與綜合作用最大（R2=0.588）。

表10 以胞外粗多糖含量為因變量的通徑分析Table 10 Path analysis referring to extracellular polysaccharide content as dependent variables

3 討論與結論

營養物質與環境因素是大型真菌生長發育的主要影響因素之一，各種因素的脅迫下菇體的培養特性及其代謝產物差異較大，香菇[37]、白樺茸[26]、羊肚菌[38]等。同時，靈芝菌在茶培養基中進行發酵時，處于一個陌生的生活環境中，因而生理特性發生較大改變，對靈芝菌絲體形態、生長以及代謝產物的合成產生一定的影響[39]。

本研究結果顯示：馬鈴薯和紅土浸出液能縮短菌絲萌發和菌球形成時間，提高發酵液可溶性固形物含量、菌球數量，說明馬鈴薯富含淀粉等碳水化合物[40]，是一種優質的碳源[25]，紅土浸出液又有利于大型真菌液體培養[27]且富含無機鹽類、微量元素、有機物等營養成分，這兩種添加物為菌絲的萌發與成球提供了充足的能量和各類營養物質，同時，白靈芝發酵過程中會利用這些營養物質進行代謝，產生糖類、有機酸、維生素等代謝產物，從而提高發酵液的可溶性固形物含量。葡萄糖能增加白靈芝發酵液可溶性固形物含量、菌球數量、菌球生物量，并增大菌球直徑，說明葡萄糖是大型真菌液體發酵較為適宜的碳源，既能增加菌絲生物量，又能促進糖類等代謝產物的積累[26]，同時，葡萄糖作為一種單糖，為菌球的形成和體積的增大提供充足的碳源和能量。茶葉能提高白靈芝發酵液的pH 和胞外粗多糖產量且茶粉優于茶湯，與靈芝（Ganoderma lucidum）菌的研究結果一致[24]，說明茶葉中的某些營養物質可以作為白靈芝的碳源和能量，從而促進其胞外粗多糖的合成，茶葉中含有大量的茶堿等堿性物質，可以中和發酵液中固體分泌的有機酸等酸性物質，從而提高發酵液的酸度。同時，茶粉營養物質多于茶湯，更適合作為該菇的液體發酵培養基成分。白靈芝胞外粗多糖的分泌與菌絲萌發時間、菌球形成時間和菌球直徑呈負相關，與菌球數量、菌球生物量、可溶性固形物等呈正相關，說明綠茶中一些多酚類等抗菌物質抑制了靈芝的菌絲生長[24]，同時，菌球數量、菌球生物量[41]、可溶性固形物含量越大，大型真菌胞外粗多糖分泌越多。最后，除茶葉顆粒大小外，白靈芝高產胞外粗多糖的最佳營養條件組合與其單因素最佳水平均不相符，尤其葡萄糖與茶葉種類（普洱茶優于其它茶葉）是影響其產量的主要因素，說明不同單因素營養條件或正交組合下該菇胞外粗多糖的分泌存在差異，葡萄糖能為該菇胞外粗多糖的形成快速提供足夠的碳源和能源，同時，普洱茶作為白靈芝高產胞外粗多糖的發酵基質，極有可能與普洱茶比綠茶、紅茶、白茶含有更多的茶多糖有關[42]。

總之，白靈芝發酵茶培養基受營養物的種類、濃度、顆粒大小等影響較大，可溶性固形物含量對該菇胞外粗多糖的分泌間接影響最大，菌球數量對其直接作用與綜合作用最大，除此之外，該菇高產多糖新品種的選育、多糖的結構與功效分析、多糖的臨床應用等有待深入研究。