酶法輔助提取人工培育蟬花多糖工藝優(yōu)化及其動力學(xué)、熱力學(xué)、抗氧化研究

謝 娜，程俊文，徐 娟，吳學(xué)謙，李春如，王玉芹，熊科輝，賀 亮,*

（1.浙江省特色中藥資源保護(hù)與創(chuàng)新利用重點實驗室，浙江農(nóng)林大學(xué)食品與健康學(xué)院，浙江杭州 311300；2.浙江省森林資源生物與化學(xué)利用重點實驗室，浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江杭州 310023；3.泛亞生命科學(xué)研究院，浙江泛亞生物醫(yī)藥股份有限公司，浙江嘉興 314200；4.浙江五養(yǎng)堂藥業(yè)有限公司，浙江麗水 323000）

蟬花（Cordyceps cicadae）屬于蟲草科，分布于我國長江以南，是與冬蟲夏草相類似的蟲草，其是蟬的幼蟲在羽化前被蟲草菌感染、寄生、吸收營養(yǎng)，最終被菌絲體完全占據(jù)后的軀殼[1]。早在明代《本草綱目》就已記載包括冬蟲夏草、蟬花、黑木耳在內(nèi)的40 多種食用菌，這類食用菌受到學(xué)者的廣泛關(guān)注。但因野生資源較少，嚴(yán)重限制了蟬花商業(yè)化的應(yīng)用。蟬擬青霉（Paecilomyces cicadaeMiq.Samson）又名雌蟬花，是從天然蟬花子實體中有絲分裂出的孢子真菌[2-3]，可通過人工培育的方法進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，有效解決資源短缺的問題。2021 年底，利用該食用菌培育出的蟲草被衛(wèi)健委批準(zhǔn)列入“新資源食品”目錄（2021 年第9 號公告），因此，吸引了大量學(xué)者圍繞該真菌進(jìn)行人工培育。

越來越多的文獻(xiàn)報道，人工培育的蟬花含有多糖、核苷、腺苷、麥角甾醇、蟲草酸等多種活性成分[4]。其中多糖組分能夠改善機(jī)體自身的免疫功能，提升機(jī)體的抗病、抗風(fēng)險能力，減少各種常見病的發(fā)生，毒副作用較小，不容易造成藥物的殘留，可以放心食用。研究表明，天然蟬花多糖具有抗氧化[5]、抗腫瘤[6]、保護(hù)腎臟[7]、增強(qiáng)免疫活性[8]等藥理作用。目前，報道的提取人工培育蟬花多糖的方法主要為微波法[9]。而多糖提取方法有熱水浸泡、酸、堿提法、酶法輔助提取等[10]。單純的熱水浸提法耗時且得率不高；酸、堿提法多糖對設(shè)備要求較高，且容易破壞多糖的內(nèi)部結(jié)構(gòu)；酶法提取是將酶作為一種生物催化劑來破壞植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，有效去除蛋白質(zhì)等成分干擾，加快細(xì)胞中活性物質(zhì)溶出，該方法操作安全，易于控制，提取效率高[11]，所以本次實驗采用木瓜蛋白酶法提取人工培育蟬花多糖。

本文擬采取酶法提取人工培育蟬花多糖，結(jié)合響應(yīng)面法對其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，重點考察料液比、酶添加量、酶解溫度、提取時間等單因素對多糖得率的影響，建立該多糖提取工藝的數(shù)學(xué)模型，獲得其最佳提取工藝，并探究其動力學(xué)和熱力學(xué)性質(zhì)，再根據(jù)DPPH·、·OH 及ORAC 等指標(biāo)，測定該蟲草多糖的體外抗氧化活性，為進(jìn)一步深度開發(fā)人工培育蟬花資源及其活性多糖組分提供可能。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人工培育蟬花菌粉 浙江泛亞醫(yī)藥有限公司；酚類、單糖標(biāo)品、無水葡萄糖、水楊酸、過氧化氫、硫酸亞鐵、濃硫酸 徐州淞譽(yù)化工科技有限公司；維生素C、2,2-聯(lián)苯基-1-大苦基肼基（DPPH）、熒光素、水溶性VE衍生物（Trolox）、2,2-偶氮二（2-甲基丙基咪）二鹽酸鹽（AAPH）、木瓜蛋白酶（3 units/mg）上海阿拉丁生物科技股份有限公司；所用試劑均為分析純。

RE-201D 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 常州亞旺儀器有限公司；SB25-YZ-120DB 超聲波清洗機(jī) 上海越眾儀器設(shè)備有限公司；IEC-CL31R 多功能高速離心機(jī) 美國Thermo 公司；熒光微孔板細(xì)胞分析儀 美國Thermo 公司；LT-DBX60N 精密可編程烘干箱 上海博迅設(shè)備有限公司；DL-3020 低溫冷卻液循環(huán)泵寧波新芝有限公司；電子天平 北京正聯(lián)興業(yè)稱重科技有限公司；電熱恒溫水浴鍋 蘇州正基儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 人工培育蟬花的預(yù)處理及提取 將原料用95%乙醇按料液比1:10（g/L）除脂，水浴90 ℃回流，每次3 h，放在55 ℃ 的烘箱之中烘干，過40 目篩，放置備用。

取一定量的人工培育蟬花，用蒸餾水做溶劑，調(diào)節(jié)pH 為6.5，放入65 ℃水浴鍋中攪拌30 min，調(diào)節(jié)pH 至7.0。90 ℃回流提取，每次2 h，過濾，將濾渣復(fù)提一次。將2 次所得濾液混合，按溶液體積的1%加入木瓜蛋白酶，放入70 ℃烘箱2 h，進(jìn)行多次攪拌，5000 r/min 離心5 min，取上清液。60 ℃下進(jìn)行減壓濃縮，濃縮液與95%乙醇體積比例為1:4，醇沉（4 ℃，12 h），5000 r/min 離心8 min，收集沉淀，冷凍干燥后，得到即為蟬花粗多糖。

1.2.2 粗多糖得率的測定 采用苯酚-硫酸法測定多糖含量[12]。利用葡萄糖溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用紫外分光光度計在490 nm 處測定其吸光值，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線y=15.94x-0.0622，R2=0.9581，說明該標(biāo)準(zhǔn)曲線具有線性關(guān)系。將10 mg 樣品稱取到燒杯中進(jìn)行溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL 容量瓶定容，按照制定標(biāo)準(zhǔn)曲線的同樣方法測定樣品吸光度值，計算蟬花菌粉多糖得率：

式中：m 為人工培育蟬花菌粉質(zhì)量，g；C 為樣品多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；V 為樣品溶液總體積，mL；n 為稀釋倍數(shù)。

1.2.3 單因素實驗 考慮料液比、酶添加量、酶解溫度、提取時間不同因素對蟬花蟲草多糖得率的影響。將酶添加量控制為1.5%，酶解溫度控制為65 ℃，提取時間為90 min，考察料液比（1:10、1:20、1:30、1:40、1:50 g/mL）對多糖得率的影響；將料液比控制在1:30 g/mL，酶解溫度控制為65 ℃，提取時間為90 min，考察酶添加量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）對多糖得率的影響；將料液比控制在1:30 g/mL，酶添加量控制為1.5%，提取時間為90 min，考察酶解溫度（45、55、65、75、85 ℃）對多糖得率的影響；將料液比控制在1:30 g/mL，酶添加量控制為1.5%，酶解溫度為65 ℃，考察提取時間（70、80、90、100、110 min）對多糖得率的影響。

1.2.4 人工培育蟬花多糖提取工藝響應(yīng)面試驗優(yōu)化根據(jù)單因素實驗，將料液比、酶添加量、酶解溫度、提取時間為4 個因素，每個因素選取3 個水平，進(jìn)行Box-Behnken 原理設(shè)計響應(yīng)面試驗見表1，將蟬花多糖得率作為響應(yīng)值，對其提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface test

1.2.5 人工培育蟬花多糖提取動力學(xué)分析 參考文獻(xiàn)[13]可知，多糖的提取過程一般分為三個階段：溶劑向內(nèi)滲透、有效成分內(nèi)部擴(kuò)散到表面中以及有效成分向外擴(kuò)散到溶劑。假設(shè)人工培育蟬花樣品為球形，根據(jù)Fick 第二定律[14]：

設(shè)f=r·c，方程可以變成

根據(jù)傅里葉變換求得：

通常情況下，高次項分布趨近于0，可忽略，式（4）取n=1，則：

等式左右兩邊同時取對數(shù)得：

式（5）、式（6）為蟬花多糖提取過程的動力學(xué)模型，該模型反映了多糖提取過程中提取的酶添加量、料液比、酶解溫度、提取時間參數(shù)對蟬花多糖濃度的影響。

式中：Ds為擴(kuò)散系數(shù)；C 為任意時間的得率，%；C∞為平衡時的得率，%；C0為提取溶液中多糖的初始得率，%；K 為速率常數(shù)，min-4；t 為提取時間，min。

1.2.6 熱力學(xué)分析 根據(jù)文獻(xiàn)[15]，將Arrhenius 公式進(jìn)行下列推導(dǎo)：

式中：A 為阿倫尼烏斯常數(shù)；R 為氣體常數(shù)，8.314 J/mol·K；T 為提取溫度，K；K 為分配系數(shù)；Ea 為活化能，kJ/mol；ΔGm 為吉布斯自由能，kJ/mol；ΔHm 為焓自由能，kJ/mol；ΔSm 為熵自由能，kJ/mol。

1.2.7 抗氧化活性分析

1.2.7.1 DPPH 自由基清除能力的測定 參考文獻(xiàn)[16-17]方法，制備不同濃度梯度（0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg/mL）的粗多糖溶液，依次添加2 mL DPPH 乙醇溶液，混合均勻，避光室溫放置30 min，用蒸餾水作空白，VC溶液作對照，在517 nm 處測定其吸光度，計算DPPH 自由基清除率：

式中：A0為空白對照品在517 nm 處的吸光值；A1為樣品溶液的在517 nm 處吸光值；A2為以蒸餾水代替DPPH 的樣品溶液在517 nm 處的吸光值。

1.2.7.2 羥自由基清除能力的測定 參考文獻(xiàn)[18-19]的方法，制備不同濃度梯度（0.25，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg/mL）的粗多糖溶液，取1～5 號試管，加入2 mL 多糖溶液，再依次加入9.0 mmol/L FeSO4溶液、9.0 mmol/L 水楊酸乙醇液、8.8 mmol/L H2O2溶液各2.0 mL，搖勻，在室溫下放置30 min 待其穩(wěn)定，紫外分光光度計510 nm 處測定不同濃度多糖溶液吸光度值，維生素C 溶液作對照液，計算羥自由基清除率：

式中：A0為空白對照品在510 nm 處的吸光值；A1為樣品溶液在510 nm 處的吸光值；A2為多糖溶液不加顯色劑H2O2在510 nm 處的吸光值。

1.2.7.3 氧化自由基清除能力的測定 根據(jù)文獻(xiàn)[20]的方法，取熒光96 孔板，分別做對照組、標(biāo)準(zhǔn)曲線組、樣品組。三組同時加入熒光素鹽（700 nmol/mL）40 μL，對照組加入20 μL 磷酸鹽緩沖液，標(biāo)準(zhǔn)曲線組加入20 μL 水溶性VE衍生物Trolox（200 μmol/mL），樣品組加入20 μL 待測樣品。37 ℃烘箱孵育15 min，陰性對照組加入140 μL 磷酸鹽緩沖液，其他待測孔全部加入140 μL AAPH（12 mmol/mL）。迅速用酶標(biāo)儀進(jìn)行測量。在485 nm 激發(fā)條件下，538 nm發(fā)射波長處記錄熒光發(fā)射強(qiáng)度的變化。從0 min 開始，每隔2 min 測量一次，記錄120 min，計算樣品熒光變化零階矩曲線下面積（area under curve，AUC），并繪制Trolox 標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣品ORAC 值：

式中：f1：初始熒光讀數(shù)；fn：時間為一定時間（min）后熒光讀數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有單因素及響應(yīng)面試驗進(jìn)行3 組重復(fù)并取平均值，使用Origin8.0 軟件對獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，響應(yīng)面設(shè)計和數(shù)據(jù)處理采用Design Expert 12.0 分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 料液比的確定 由圖1 可知，料液比在1:10～1:50 g/mL 范圍內(nèi)，多糖得率隨功率增大顯著（P＜0.05）增加。當(dāng)料液比在1:30 g/mL 時，多糖得率達(dá)到最大，可能是樣品與溶劑的接觸達(dá)到平衡，多糖不再析出；當(dāng)料液比大于1:30 g/mL 時，多糖得率不再繼續(xù)升高，因為過多的加溶劑會導(dǎo)致雜質(zhì)的溶出，從而抑制多糖的溶解[21]。所以，料液比控制在1:30 g/mL 時為最佳。

圖1 料液比對多糖得率的影響Fig.1 Effect of liquid to solid ratio on polysaccharide yield

2.1.2 酶添加量的確定 由圖2 可知，酶添加量在0.5%～1.5%范圍內(nèi)，多糖得率隨酶添加量增加顯著（P＜0.05）增大。當(dāng)酶添加量在1.5%時，多糖得率達(dá)到最大；當(dāng)酶添加量大于1.5%時，多糖得率不再因為酶添加量增多繼續(xù)升高，可能是在固定量的原料下，酶添加量已經(jīng)最大化，對于多糖的溶出不再起作用。所以，酶添加量在1.5%時為最佳。

圖2 酶添加量對多糖得率的影響Fig.2 Effect of enzyme dosage on polysaccharide yield

2.1.3 酶解溫度的確定 由圖3 可知，酶解溫度在45～65 ℃范圍內(nèi)，多糖得率隨酶解溫度增加顯著（P＜0.05）增加。當(dāng)酶解溫度在65 ℃時，多糖得率達(dá)到最大；當(dāng)酶解溫度大于65 ℃時，多糖得率不再因為酶解溫度增多繼續(xù)升高，可能是因為溫度太高，部分多糖出現(xiàn)降解。所以，酶解溫度在65 ℃時為最佳。

圖3 酶解溫度對多糖得率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on polysaccharide yield

2.1.4 提取時間的確定 由圖4 可知，提取時間在70～90 min 范圍內(nèi)，多糖得率隨提取時間增加顯著（P＜0.05）上升。當(dāng)提取時間在90 min 時，多糖得率達(dá)到最大；當(dāng)提取時間大于90 min 時，多糖得率不再因為提取時間增加繼續(xù)升高，還出現(xiàn)下降趨勢，可能是在90 min 內(nèi)多糖溶解率達(dá)到最優(yōu)。所以，提取時間在90 min 時為最佳。

圖4 提取時間對多糖得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on polysaccharide yield

2.2 響應(yīng)面試驗

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析 根據(jù)Design expert 軟件，設(shè)計出四因素三水平響應(yīng)面試驗，共29 個試驗點，詳細(xì)方案如下表2，方差分析見表3，根據(jù)擬合結(jié)果，得到多糖得率Y 的回歸方程：

表2 各因素響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Response surface design and results for each factor

表3 各因素回歸方程的方差分析Table 3 Variance analysis of regression equations of various factors

由表3 可知：本數(shù)據(jù)模型P＜0.0001，失擬項P（0.1489）＞0.05，說明該試驗?zāi)Ｐ统闪ⅰ（料液比）、B（酶添加量）、C（酶解溫度）、D（酶解時間）四個因素P值均小于0.001，說明本文選定的四個因素對蟬花蟲草多糖得率有顯著的影響；其中R2=0.9936，R2adj=0.9873，CV=0.96%，說明該實驗擬合效果較好，誤差小，準(zhǔn)確度高，外界因素對多糖得率影響較小，可以用此模型對提取目標(biāo)多糖工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。通過F值，可以看出每個單因素對多糖得率的影響為：C＞B＞A＞D，即酶解溫度＞酶添加量＞料液比＞提取時間。

2.2.2 交互作用分析 通過響應(yīng)面軟件得到的響應(yīng)面曲面圖見圖5，可以看到兩因素交互結(jié)果對人工培育蟬花多糖的影響。由文獻(xiàn)[22-23]得知，響應(yīng)曲面圖和等高線圖均可顯示不同因素對結(jié)果的影響，響應(yīng)曲面圖中曲線越陡，說明該因素對結(jié)果影響越大；等高線接近橢圓說明兩因素的交互作用顯著。由圖5可知，A（料液比）與C（酶解溫度）、B（酶添加量）與C（酶解溫度）這兩組響應(yīng)圖曲線陡峭，且等高線成橢圓，表明這兩組因素交互作用對目標(biāo)多糖得率影響顯著，與表3 方差結(jié)果一致，更加證實了該數(shù)學(xué)模型的準(zhǔn)確性。

圖5 兩因素交互作用對多糖得率的影響Fig.5 Effect of interaction of two factors on polysaccharide yield

2.2.3 響應(yīng)面試驗的優(yōu)化及驗證 通過本次研究可知，人工培育蟬花多糖得率是文獻(xiàn)[24]報道的天然蟬花得率1.18 倍。根據(jù)響應(yīng)面試驗?zāi)Ｐ停玫蕉嗵翘崛∽罴压に囶A(yù)測值：料液比為1:30 g/mL、酶添加量為1.596%、酶解溫度為66.92 ℃、提取時間為91.03 min，人工培育蟬花預(yù)測提取得率為7.99%。結(jié)合實際生產(chǎn)情況，將試驗條件改成料液比1:30 g/mL、酶添加量為1.6%、酶解溫度為67 ℃、提取時間為90 min，進(jìn)行3 次以上平行試驗，得到多糖得率平均值為7.91%，與理論值相差較小，再次說明本次響應(yīng)面模型對優(yōu)化人工培育蟬花多糖的提取工藝具有一定的可行性。

2.3 人工培育蟬花提取多糖的動力學(xué)分析

2.3.1 速率常數(shù)求解 研究了不同酶添加量下，多糖得率隨時間的變化。根據(jù)表4 可知，多糖得率隨著時間的增加而增加，100 min 時得率已經(jīng)達(dá)到平衡，將100 min 時的得率設(shè)為平衡得率C∞。取ln[C∞/（C∞-C）]和時間t 作圖（圖6），隨著酶添加量增加，得率也在不斷提高，說明ln[C∞/（C∞-C）]和t 呈線性依賴關(guān)系。由此可知，人工培育蟬花多糖的提取過程符合Fick 第二定律。通過圖6 的回歸方程可得到表5，根據(jù)表5 的擬合系數(shù)（R2＞0.9），說明該模型擬合較好。同時得到了在不同酶添加量下速率常數(shù)K 值，并隨著酶添加量增多而變大，這是因為木瓜蛋白酶的添加有效分解人工培育蟬花菌絲壁上的蛋白以及游離蛋白，更好地使目標(biāo)多糖溶解[25]。

圖6 不同酶添加量下ln[C∞/（C∞-C）]與時間的關(guān)系圖Fig.6 Relationship between ln[C∞/（C∞-C）] and time at different enzyme addition

表4 不同酶添加量對多糖提取效果的影響Table 4 Polysaccharide extraction rate under different enzyme addition

表5 不同酶添加量下ln[C∞/（C∞-C）]與t 的回歸方程Table 5 Regression equation between ln[C∞/(C∞-C)] and t at different enzyme addition

2.3.2 相對萃余率的求解 相對萃余率是多糖在某一條件下的殘留值比上平衡時的得率，其數(shù)值越小，說明得率越大。基于表4 數(shù)據(jù)，利用（C∞-C）/C∞與時間t 作圖得到如下圖7，從圖中擬合曲線顯示，擬合方程精度良好（R2≥0.9），說明整個提取過程符合指數(shù)方程模型。進(jìn)一步得知，相對萃余率常數(shù)與表5中速率常數(shù)的趨勢一致，說明在不同酶添加量的條件下，多糖的得率隨著時間增加而提高，該萃取過程與建立的動力學(xué)模型吻合。

圖7 不同酶添加量下相對萃余率與時間的關(guān)系Fig.7 Relationship between the relative rate and time at different enzyme addition

2.3.3 半衰期 半衰期是指提取一半多糖所需要的時間。由t1/2=ln2/k 對酶添加量作圖。根據(jù)圖8 可知，半衰期與酶添加量成反比，通過酶的催化和能量的消耗，酶添加量越大，半衰期越小，越有利于人工培育蟬花中的蛋白分解，使多糖的溶出越快，從而t1/2值越低[26]。

圖8 不同酶添加量與t1/2 的關(guān)系Fig.8 Relationship between different enzyme additions and t1/2

2.4 熱力學(xué)相關(guān)性質(zhì)

根據(jù)單因素實驗可知，酶添加量在1.5%的條件下，提得率達(dá)到最佳，所以，選酶添加量在1.5%的情況下進(jìn)行熱力學(xué)分析。如表6，根據(jù)熱力學(xué)公式，求出活化能Ea=10.32 kJ/mol，ΔGm為-0.82～-13.49 kJ/mol，吉布斯能小于零，說明提取多糖的反應(yīng)是一個不可逆的自發(fā)反應(yīng)；ΔHm大于零，說明人工培育蟬花多糖的提取過程是一個吸熱的反應(yīng)[27]。研究表明，多糖得率與溫度升高呈正相關(guān)。

表6 人工培育蟬花多糖分布常數(shù)熱力學(xué)參數(shù)Table 6 Thermodynamic parameters of distribution constants of artificially-cultivated Cordyceps cicadae

2.5 人工培育蟬花體外抗氧化活性分析

2.5.1 DPPH 自由基清除率 DPPH 是較為常用的考察活性物質(zhì)的抗氧化能力的藥理模型[28-29]。由圖9 可知，在0.25～2.5 mg/mL 范圍內(nèi)，人工培育蟬花粗多糖溶液隨著濃度增大，對DPPH 自由基清除能力也逐漸升高；當(dāng)多糖溶液濃度為1.0 mg/mL，對DPPH 自由基清除率達(dá)到81.9%，通過計算得到其IC50數(shù)值：0.54 mg/mL，其抗氧化活性高于浙江金蟬花[30]。結(jié)果表明，人工培育蟬花具有良好的抗氧化性。但是相對于維生素C 對照液的抗氧化性還是較弱。

圖9 不同濃度粗多糖對DPPH 自由基的清除率Fig.9 DPPH scavenging capacity of crude polysaccharide with different concentration

2.5.2 羥自由基清除率 羥自由基和DPPH 自由基一樣，經(jīng)常被作為常用的考察物質(zhì)的抗氧化能力的模型[31]。由圖10 可知，在0.25～2.5 mg/mL 范圍內(nèi)，人工培育蟬花粗多糖溶液隨著濃度增大，對羥自由基清除能力也逐漸升高，當(dāng)多糖溶液濃度為1.0 mg/mL，對羥自由基清除率達(dá)到80.2%，得到其IC50為0.60 mg/mL，高于江蘇野生金蟬花[32]。結(jié)果表明，人工培育蟬花具有良好的抗氧化性。但是相對于維生素C 對照組的抗氧化性還是較弱。

圖10 不同濃度粗多糖對羥自由基的清除能力Fig.10 Hydroxyl radical scavenging capacity of crude polysaccharide with different concentration

2.5.3 氧化自由基的吸收能力 以維生素E（Trolox）濃度為橫坐標(biāo)，以當(dāng)量的形式代表藥物的抗氧化能力，NetAUC 為縱坐標(biāo)，為相對曲線面積，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線[33]。如圖11，該標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.8981x+2.8097，R2=0.9572，表明該標(biāo)準(zhǔn)曲線有良好的線性關(guān)系，將樣品的NetAUC 值大入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，得到對應(yīng)的Trolox濃度值，計算氧自由基數(shù)值。用Trolox（μmol/g）表示樣自由基吸收能力，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到人工培育蟬花粗多糖的ORAC 值為45.62 Trolox μmol/g，說明人工培育蟬花具有良好的抗氧化活性。

圖11 不同濃度粗多糖對氧化自由基的清除能力Fig.11 Oxygen free scavenging capacity of crude polysaccharide with different concentration

3 結(jié)論

本實驗以商業(yè)化的人工培育蟬花為原料，利用酶法輔助提取其活性多糖組分，從單因素實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各因素對多糖得率均有顯著影響；結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化法，建立了適合人工培育蟬花多糖的數(shù)學(xué)模型，該模型具有良好的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，其中對多糖得率影響最大的是酶解溫度，其次是酶添加量、料液比和提取時間。結(jié)合實際生產(chǎn)最終獲得最佳提取工藝：料液比1:30 g/mL、酶添加量1.6%、酶解溫度67 ℃、提取時間90 min，多糖的得率達(dá)到7.91%。基于Fick第二定律，本文對其進(jìn)行動力學(xué)研究，通過速率常數(shù)、相對萃余率等數(shù)據(jù)，說明在不同酶添加量的條件下，增加時間有助于多糖的溶出。根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)：Ea、ΔGm、ΔHm、ΔSm表示此過程是自發(fā)吸熱的反應(yīng)。通過體外抗氧化實驗，DPPH 自由基和羥自由基的IC50值分別是：0.54、0.60 mg/mL，說明人工培育蟬花具有良好的抗氧化性。本實驗首次利用酶法提取人工培育蟬花多糖，既解決低得率問題，又結(jié)合了酶提法的多效性，為進(jìn)一步工業(yè)化開發(fā)人工培育蟬花多糖提供理論依據(jù)。