纖維素酶輔助超聲提取丁香葉黃酮工藝優化及抗氧化性分析

黃磊磊，劉佳怡，王天怡，張慶芬，楊逢建,*

（1.東北林業大學，森林植物生態學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150040；2.東北林業大學化學化工與資源利用學院，黑龍江哈爾濱 150040；3.東北林業大學林業生物制劑教育部工程中心，黑龍江哈爾濱 150040；4.黑龍江省林源活性物質生態利用重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150040；5.東北林業大學生物資源生態利用國家地方聯合工程實驗室，黑龍江哈爾濱 150040）

丁香葉（Syringa oblataleaves）是木犀科（Oleaceae）丁香屬（Syringa）植物的干燥葉。木犀科丁香屬植物全屬有40 多種，中國有20 余種，廣泛分布于我國的東北、華北、西南及西北地區，資源豐富，是街道及庭院綠化的重要樹種。現代研究表明，丁香葉具有抗菌消炎[1]、保肝利膽[2-3]、抗氧化[4]、抗病毒[1]等功效，民間常用丁香葉的水煎液用于止瀉，預防菌痢。現丁香葉已載入黑龍江省藥品標準[4]，以丁香葉為原料生產的藥對于治療痢疾、急性黃疽性肝炎都有很好的效果。目前為止，已經從丁香葉中分離出近100 種有效成分，這些成分多以總黃酮類、有機酸類、苷類、揮發油類等形式存在[5]。研究顯示，總黃酮具有抗氧化[6]、抗疲勞[7]、抗衰老[8]、抗癌[9]、抗菌[10]、抗病毒[11]等多種藥理活性，受到廣大學者的關注，開發應用前景較廣，因此對丁香葉中總黃酮的提取具有重要意義。

近年來，從綠色植物中提取分離總黃酮類物質的研究受到廣大學者的關注，常用的總黃酮提取方法有索式提取法（Soxhlet Extraction，SE）、酶解法（Enzymatic hydrolysis，EH）和超聲提取法（Ultrasonic Extraction，UE）等。索式提取法有用時長、有機溶劑消耗大等缺點[12]。酶解法的優點是反應條件溫和，對設備要求簡單，但具有反應速度慢，酶成本高的缺點。超聲提取法是利用超聲波的空化效應，使植物細胞壁受到強大壓力而瞬間破裂，有利于細胞內物質的快速溶出[13]。酶輔助超聲提取法（Enzyme-assisted ultrasonic extraction，EAUE）結合了超聲提取和酶解法的優點，具有耗時短、效率高、能保持提取物活性等優勢，該方法已被廣泛使用于活性物質的提取[13]。何靜等[14]研究表明酶輔助超聲提取技術對駝皮源膠原蛋白的降解較傳統酶解法和超聲提取法其降解程度更高，且能獲得一種抑制ACE（一種含鋅離子的二肽羧基酶）的生物活性多肽。李棟等[15]運用酶輔助超聲提取技術對紅棗中的多糖進行提取且進行遺傳算法優化，結果顯示紅棗多糖的得率為7.68%±0.01%，該研究為紅棗多糖的提取提供了一種綠色高效的方法。

本研究通過單因素和響應面法對小葉丁香葉中總黃酮的最優提取工藝進行研究，并在最佳提取工藝條件下對紫丁香、白丁香、暴馬丁香、小葉丁香四個品種中總黃酮的提取得率進行比較，同時分別對其總黃酮的粗提物進行抗氧化性研究，為進一步探索丁香葉總黃酮提取工藝、研究不同品種丁香葉的藥理功能提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

丁香葉 采自東北林業大學校園，由東北林業大學楊逢建教授鑒定為木犀科丁香屬植物，新鮮葉片自然風干，粉碎過篩備用；蘆丁標準品（HPLC 級，純度≥98%）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）上海源葉科技有限公司；無水乙醇 天津市致遠化學試劑有限公司；纖維素酶（10000 U/g）上海麥克林生化科技有限公司；純凈水 杭州娃哈哈集團有限公司；抗壞血酸 天津市瑞金特化學品有限公司。

LG-04 型微型中藥粉碎機 瑞安市百信制藥機械有限公司；Neo15 型離心機 上海力申科學儀器有限公司；UH620H 型分析天平 日本島津公司；KQ-500DM-22.5 型超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；UV-2600 型紫外可見分光光度計 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗材料的篩選 精確稱量小葉丁香、暴馬丁香、紫丁香、白丁香粗粉各0.50 g 于50 mL 離心管中，按照所需液料比加入一定體積分數的乙醇溶液，用磷酸緩沖溶液調節溶液pH，加入纖維素酶。搖勻后，按照超聲頻率40 kHz，功率300 W，超聲溫度50 ℃，提取40 min，離心后取上清液，測定不同種丁香葉的總黃酮含量，篩選出總黃酮含量較高的丁香葉種類。

1.2.2 丁香葉黃酮提取工藝比較

1.2.2.1 超聲提取法 參考李菁等[16]實驗方法稍作修改，準確稱定小葉丁香葉粗粉0.50 g，提取劑為65%乙醇，液料比30:1（mL/g），在超聲溫度50 ℃，超聲功率400 W 的條件下，提取40 min，離心后取上清液。即得超聲提取法下樣品溶液。

1.2.2.2 酶解法 參考張小梅等[17]方法稍作修改，準確稱定小葉丁香葉粗粉0.50 g，水為提取劑，液料比30:1（mL/g），調節pH 為5，加入質量分數為2%的纖維素酶，溫度50 ℃下提取40 min，離心后取上清液。即得酶解法下樣品溶液。

1.2.2.3 酶輔助超聲提取法 精確稱量0.50 g 小葉丁香粗粉于50 mL 離心管中，按照液料比30:1 加入質量分數為65%的乙醇溶液，用磷酸緩沖溶液調節溶液pH 為5，加入纖維素酶。搖勻后，按照超聲頻率40 kHz，功率300 W，超聲溫度50 ℃，提取40 min，離心后取上清液，即得總黃酮粗提液。

1.2.3 丁香葉中總黃酮得率的測定 精密稱定5.70 mg 蘆丁，置于燒杯中，加入乙醇，超聲溶解并定容至10 mL，搖勻即得0.57 mg/mL 蘆丁標準品溶液。

參考楊觀蘭等[18]的方法稍作修改，精密吸取上述對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，置于10 mL 容量瓶中，加入水至2 mL，加入0.6 mL 5%亞硝酸鈉，搖勻靜置6 min 再加入0.6 mL 10%硝酸鋁，搖勻靜置6 min，最后加入3 mL 4%氫氧化鈉，加水至刻度，搖勻后放置15 min。以相應試劑為空白對照，在最大吸收波長510 nm 處測吸光值。以蘆丁的質量濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：y=22.5x-0.004，R2=0.997。

取2 mL 小葉丁香總黃酮提取液于10 mL 容量瓶中按上述方法測定吸光值。總黃酮提取得率按式（1）計算：

式中，C 為丁香葉總黃酮的濃度，mg/g；V 為提取液體積，mL；m 為丁香葉的質量，g；N 為稀釋倍數。

1.2.4 單因素實驗 準確稱定小葉丁香葉粗粉0.50 g，置于50 mL 離心管中，以65%乙醇為提取劑，按30:1 mL/g 液料比，調節pH 為5 后，加入質量分數為1%纖維素酶，在50 ℃和超聲功率300 W 的條件下提取40 min。離心后取上清液，測定上清液中總黃酮提取得率。分別考察纖維素酶用量為0%、1%、1.5%、2%和2.5%；液料比為10:1、20:1、30:1、40:1 和50:1（mL/g）；乙醇體積分數為45%、55%、65%、75%和85%；超聲功率為100、200、300、400和500 W；超聲時間為20、30、40、50 和60 min；pH為4、4.5、5、5.5 和6；溫度為20、30、40、50、60 和70 ℃時對小葉丁香葉總黃酮提取得率的影響。

1.2.5 響應面法優化提取工藝 根據單因素實驗的結果，超聲功率、溫度及乙醇體積分數對小葉丁香葉總黃酮提取得率影響較大，故超聲功率（A）、溫度（B）和乙醇體積分數（C）為自變量以丁香葉總黃酮提取得率為響應值，設計三因素三水平的Box-Beheken Design 試驗，試驗因素與水平如表1 所示。

表1 響應面試驗因素水平設計Table 1 Box-Beheken design

1.2.6 丁香葉總黃酮體外抗氧化活性的研究 在最佳提取工藝條件下提取丁香葉總黃酮，旋轉蒸發提取液至無醇味，即得丁香葉總黃酮粗提液，以DPPH 自由基和OH 自由基清除率為指標測定粗提液的體外抗氧化實驗。并通過IC50值對自由基清除率進行判斷。

1.2.6.1 丁香葉黃酮對DPPH 自由基的清除率 參考傅賢明等[19]的方法稍作修改，將小葉丁香葉總黃酮粗提液配成濃度為1、0.75、0.5、0.25 和0.125 mg/mL 的提取液。A 組：各取1 mL 提取液，再分別加入0.04 mg/mL 的DPPH 自由基溶液2 mL，B 組：各取1 mL 提取液，再分別加入無水乙醇溶液2 mL，A0：取1 mL 蒸餾水，再加入0.04 mg/mL 的DPPH 自由基溶液2 mL。A 組、B 組、A0均避光反應30 min后，在517 nm 處測定吸光值Ax、Bx、A0，平行3 次，計算清除率。DPPH 自由基溶液現配現用。以VC為陽性對照。DPPH 自由基清除率計算如下：

1.2.6.2 丁香葉黃酮對OH 自由基的清除 參考付依依等[20]的方法稍作修改，將小葉丁香葉總黃酮粗提液配成濃度為1、0.75、0.5、0.25、0.125 mg/mL 的提取液。A 組：各取1 mL 提取液，再分別加入1.5 mmol/L 的FeSO4·7H2O 溶液2 mL 和3 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液1 mL，再加入0.1% H2O2溶液1 mL 啟動反應。B 組：各取1 mL 提取液，再分別加入1.5 mmol/L 的FeSO4·7H2O 溶液2 mL 和3 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液1 mL，再加入蒸餾水1 mL 啟動反應。A0：取1 mL 蒸餾水，加入1.5 mmol/L 的FeSO4·7H2O 溶液2 mL 和3 mmol/L 的水楊酸-乙醇溶液1 mL，再加入1 ml 0.1% H2O2mL 反應。A 組、B 組、A0均在37 ℃恒溫水浴30 min 后，在510 nm處測定吸光值Ax、Bx、A0，平行3 次，計算清除率，以VC為陽性對照。OH 自由基清除率計算如下：

1.3 數據處理

所有實驗均重復平行3 次，數據的表現形式均為算術平均值±標準差。實驗數據的處理與統計軟件為Origin 2023 和Design Expert 13 Trial。用軟件SPSS Statistics 26 進行方差分析，P＜0.01 表示差異性極顯著，P＜0.05 表示差異性顯著。

2 結果與分析

2.1 原料樣品的篩選

為篩選出總黃酮提取得率最高的丁香葉原材料，測定了小葉丁香、暴馬丁香、紫丁香和白丁香4 種丁香葉總黃酮的提取得率，結果見圖1。4 種丁香葉總黃酮提取得率存在顯著差異（P＜0.05）。小葉丁香葉總黃酮提取得率顯著高于其他三種（P＜0.05），白丁香葉的總黃酮提取得率最少。總黃酮提取得率由高到低依次為小葉丁香＞暴馬丁香＞紫丁香＞白丁香。故后續試驗選擇小葉丁香葉為實驗材料。

圖1 四種丁香葉中總黃酮的提取得率Fig.1 Extraction rates of total flavonoids from four types of Syringa oblata leaves

2.2 不同提取工藝比較

為篩選出小葉丁香葉總黃酮最佳提取工藝，探究了超聲提取法、酶解法、酶輔助超聲提取法3 種工藝對小葉丁香葉總黃酮提取得率的影響，結果見表2。酶輔助超聲提取法提取的丁香葉總黃酮提取得率高于超聲提取和酶解法提取，具有高效、節省時間的優點。穆易君[21]運用酶輔助超聲提取法、酶解法和超聲提取法對菠菜葉的黃酮進行提取，結果顯示酶輔助超聲提取法的最佳提取率為15.56%，纖維素酶提法的最佳提取率為14.10%，超聲提取法的最佳提取率為13.05%，說明酶輔助超聲提取法較其它兩種方法有提取效率高的優點，該方法結合了酶的專一性、反應條件溫和及超聲提取的時間短、高效性等特點，具有較好的應用前景，為其他活性物質的提取提供參考。

表2 不同提取方法總黃酮提取得率比較Table 2 Comparison of flavonoids content in different extraction methods

2.3 單因素實驗結果

2.3.1 纖維素酶的添加量對小葉丁香葉總黃酮提取得率的影響 圖2 是纖維素酶的添加量對丁香葉總黃酮提取得率的影響。纖維素酶可以較好地作用于丁香葉的細胞壁并使其分解，使溶劑與丁香葉細胞內物質相互作用，有利于丁香葉總黃酮的提取[22]。當酶添加量為2%以下時，小葉丁香葉總黃酮的提取得率隨加酶量的增加而顯著提高（P＜0.05），當酶添加量超過2%時，總黃酮的提取得率下降，差異性不顯著（P＞0.05）。這是因為隨著酶的添加量的增加，酶對小葉丁香葉細胞壁的破壞能力增強，使小葉丁香葉總黃酮溶出增加，酶含量繼續增加使得細胞壁的多糖降解物和纖維素等物質大量存在，影響超聲的空化作用和小葉丁香葉總黃酮的溶出[23]，使小葉丁香葉總黃酮提取得率降低。當其添加量為2%時，丁香葉總黃酮的提取得率最高，故選擇纖維素酶的添加量為2%作為最優加酶量。

圖2 加酶量對總黃酮提取得率的影響Fig.2 Effect of enzyme dosage on total flavonoid extraction rate

2.3.2 液料比對小葉丁香葉總黃酮提取得率的影響圖3 是不同液料比對總黃酮提取得率的影響。當液料比30:1（mL/g）時小葉丁香葉總黃酮的提取得率最高，在液料比10:1～30:1（mL/g）之間，隨著液料比的增大，小葉丁香葉總黃酮提取得率顯著提高（P＜0.05），繼續增大液料比，總黃酮提取得率逐漸降低且差異性不顯著（P＞0.05）。因此在一定范圍內，增大液料比使得丁香葉粗粉與提取溶劑的接觸率增大，使小葉丁香葉總黃酮更易溶出[22]；當液料比高于30:1（mL/g）后，超聲波的空化作用受到一定阻礙，可能會伴隨著雜質的溶出[23]，降低丁香葉中總黃酮的提取得率，而且造成有機溶劑的浪費以及增加后續純化工業的成本[23]。故選擇液料比為30:1（mL/g）進行試驗。

圖3 液料比對總黃酮提取得率的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on total flavonoid extraction rate

2.3.3 乙醇體積分數對小葉丁香葉總黃酮提取得率的影響 圖4 是不同乙醇體積分數對總黃酮提取得率的影響。當乙醇體積分數小于65%時，小葉丁香葉總黃酮提取得率隨乙醇體積分數的增加而顯著提高（P＜0.05），繼續增大乙醇體積分數，小葉丁香葉總黃酮提取得率隨乙醇體積分數的增加而逐漸降低，且差異性不顯著（P＞0.05）。這說明體積分數較高的乙醇溶液不利于目標化合物的溶出，65%乙醇極性與小葉丁香葉總黃酮的極性接近，小葉丁香葉總黃酮最大程度地溶出[24]。當體積分數高于65%時，極性差異增大，引起小葉丁香葉中其他醇溶性物質的溶出，使總黃酮得率下降[17]。由于乙醇體積分數對總黃酮提取得率的影響較大，故選擇體積分數為55%～75%的乙醇進行后續試驗的優化。

圖4 乙醇體積分數對總黃酮提取得率的影響Fig.4 Effect of ethanol volume fraction on total flavonoid extraction rate

2.3.4 超聲功率對小葉丁香葉總黃酮提取得率的影響 圖5 是不同超聲功率對小葉丁香葉總黃酮提取得率的影響。小葉丁香葉總黃酮的提取得率隨超聲功率的增大而提高，當超聲功率達400 W 時，提取得率最大，繼續增加超聲功率，小葉丁香葉總黃酮提取得率開始下降，均表現出顯著差異性（P＜0.05）。說明超聲作用促進植物細胞壁的破裂，促進了小葉丁香葉總黃酮的溶出，超聲功率過高可能使小葉丁香葉總黃酮結構遭到破壞，其他活性物質進一步溶出，進而使小葉丁香葉總黃酮提取得率降低[25]。故后續選擇300～500 W 的超聲功率進行優化試驗。

圖5 超聲功率對總黃酮提取得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on total flavonoid extraction rate

2.3.5 超聲時間對小葉丁香葉總黃酮提取得率的影響 圖6 是不同超聲時間對小葉丁香葉總黃酮提取得率的影響。小葉丁香葉總黃酮的提取得率隨時間的增加而提高。隨著超聲時間的增加，細胞壁破碎程度逐漸增加，使小葉丁香葉總黃酮溶出增加。當超聲時間小于40 min 時，總黃酮提取得率隨超聲功率的增大顯著增大（P＜0.05），超聲時間超過40 min 后隨著時間延長提取得率下降，且差異性不顯著（P＞0.05）。這是由于提取時間延長，超聲效應增強，可能伴隨著其他雜質的溶出，且隨著超聲時間的增加，溶液溫度可能會上升，影響到黃酮的穩定性，使總黃酮提取得率下降[26]。故選擇超聲時間為40 min 進行后續的試驗。

圖6 超聲時間對總黃酮提取得率的影響Fig.6 Effect of ultrasound time on total flavonoid extraction rate

2.3.6 pH 對小葉丁香葉總黃酮提取得率的影響圖7 是不同pH 對小葉丁香葉總黃酮提取得率的影響。pH 在4.0～5.0 范圍內時，小葉丁香葉總黃酮的提取得率的差異性不顯著（P＞0.05），pH 達到5.5 時，提取得率達到最大。纖維素酶的活性隨著pH 的增大而增強，進而對細胞壁的破壞程度增加，使總黃酮類物質更快地溶出，總黃酮提取得率增加[26]。當pH 大于5.5 時，纖維素酶的結構可能會發生變化進而影響酶的穩定性，降低了酶的活性，使酶對植物細胞壁的破壞能力降低，細胞內的總黃酮不能充分溶出，使得小葉丁香葉總黃酮提取得率下降。故選擇5.5 為最適pH。

圖7 pH 對總黃酮提取得率的影響Fig.7 Effect of pH on total flavonoid extraction rate

2.3.7 溫度對小葉丁香葉總黃酮提取得率的影響圖8 是不同溫度對總黃酮提取得率的影響。溫度在30～60 ℃范圍內時，丁香葉總黃酮的提取得率隨溫度的升高而顯著增大（P＜0.05），當溫度達到60 ℃時，提取得率達到最大，溫度超過60 ℃提取得率逐漸下降。隨著溫度升高，分子的熱運動加速，使總黃酮更容易浸出。但溫度繼續升高導致纖維素酶活性降低，酶對細胞壁的破壞程度減小，使總黃酮類化合物溶出速度減慢，且溫度升高可能使黃酮結構遭到破壞，提取得率降低[26]。選擇50～70 ℃的溫度范圍進行后續的優化試驗。

圖8 溫度對總黃酮提取得率的影響Fig.8 Effect of temperature on total flavonoid extraction rate

2.4 響應面優化試驗結果

2.4.1 響應面模型的建立與顯著性檢驗 響應面優化結果顯示見表3～表4，模型的預測系數R2為0.8623，調整決定系數R2為0.9672，說明本模型有較高的擬合度。變異系數（CV）小于2%，說明實驗具有一定的穩定性，不是偶然發生的[27]。后續的實驗結果可用本模型和方程進行分析與預測，可用于優化丁香葉總黃酮類化合物的提取工藝。

表3 中心組合優化方案及結果Table 3 Scheme and results of central combinatorial optimization

表4 響應面擬合回歸方程方差分析結果Table 4 Response surface fitted regression equation analysis of variance results

運用 Design Expert 13 Trial 軟件對響應面試驗結果進行擬合，得到總黃酮提取得率（Y）對超聲功率（A）、溫度（B）和乙醇體積分數（C）的回歸方程為：

由表4 可知，P＜0.01，表明模型差異極顯著，該模型具有統計學意義。失擬項的P值為0.3093＞0.05，表明差異性不顯著，說明該模型能科學的對丁香葉總黃酮提取得率進行預測，可對實驗結果進一步分析。

模型AB 的P值＜0.01，表明A（超聲功率）和B（溫度）對總黃酮提取得率的影響極顯著；模型BC 的P值＞0.01 且＜0.05，表明B（溫度）和C（乙醇體積分數）對總黃酮提取得率的影響顯著；模型AC 的P值＞0.05，表明A（超聲功率）和C（乙醇體積分數）對總黃酮提取得率的影響不顯著[28]。F值是評價各種影響因素重要性的參考指標，即F值越大表明該因素對實驗結果影響越大。由F值大小可知B＞C＞A，說明B（溫度）對總黃酮的提取得率的影響最大。二次項B2的P值＞0.01 且＜0.05，說明溫度對總黃酮提取得率的影響顯著，二次項A2和C2的P值均＜0.01，說明對總黃酮提取得率的影響極顯著。

2.4.2 響應曲面分析各因素的交互作用 兩個變量之間的交互作用由響應面3D 圖的陡峭程度和等高線的形狀反映[29]。響應面3D 圖的坡面越陡峭表明兩因素交互作用越顯著，反之，響應面3D 圖坡面越平緩表明兩因素交互作用越小；等高線形狀呈橢圓形表明兩因素交互作用顯著，等高線形狀呈圓形表明兩因素交互作用很小甚至可忽略[30]。由圖9～圖11 可知，響應面的3D 圖和等高線圖都存在頂點，即在所選范圍內存在極值[31]。AB、BC 的等高線形狀呈橢圓形，說明超聲功率與溫度、溫度與乙醇體積分數兩因素的交互作用顯著，AC 的等高線呈圓形，說明超聲功率和乙醇體積分數的交互作用對響應值的影響不顯著，與表4分析結果一致。

圖9 超聲功率和乙醇體積分數交互作用的響應面3D 圖和等高線圖Fig.9 Response surface 3D and contour plots of ultrasound power and ethanol volume fraction

由圖9（a）和圖9（b）可知，3D 圖的坡面較平緩，等高線趨于圓形，說明超聲功率與乙醇體積分數的交互作用對響應值的影響不顯著。當超聲功率一定時，總黃酮提取得率隨乙醇體積分數的增加呈現先上升后下降的趨勢；當乙醇體積分數一定時，總黃酮提取得率隨超聲功率的增加，先上升后下降；與單因素實驗結果一致。

由圖10（a）和圖10（b）可知，3D 圖的坡面較陡，等高線呈橢圓形，說明溫度和乙醇體積分數的交互作用對響應值的影響顯著。當溫度一定時，總黃酮提取得率隨乙醇體積分數呈現先上升后下降的趨勢；當乙醇體積分數一定時，總黃酮提取得率隨溫度的增加呈現上升的趨勢。

圖10 溫度和乙醇體積分數交互作用的響應面3D 圖和等高線圖Fig.10 Response surface 3D plots and contour plots of temperature and ethanol volume fraction

由圖11（a）和圖11（b）可知，3D 圖的坡面較陡，等高線呈橢圓形，說明超聲功率與溫度的交互作用對響應值的影響較顯著。當超聲功率一定時，總黃酮的提取得率隨溫度的增加呈現上升趨勢；當溫度一定時，總黃酮提取得率隨超聲功率的增加呈現先上升后下降的趨勢。

圖11 超聲功率和溫度交互作用的響應面3D 圖和等高線圖Fig.11 Response surface 3D and contour plots of ultrasound power and temperature interaction

2.4.3 驗證試驗 基于上述模型，優化得到的小葉丁香葉總黃酮的最優工藝條件為：pH5.5，加酶量為2%，液料比30:1 mL/g，超聲功率404.75 W，超聲時間40 min，乙醇體積分數63.4%，溫度55.86 ℃。最優預測提取得率為32.57 mg/g。考慮到實際操作的需要，調整參數為加酶量2%，pH5.5，超聲時間40 min，超聲功率400 W，乙醇體積分數63%，溫度56 ℃，液料比30:1（mL/g）。為驗證實驗的可靠性，在調整后的條件下重復實驗，實驗結果表明丁香葉總黃酮的提取得率為32.21±0.16 mg/g，與預測值接近，說明該優化條件可信。

2.5 丁香葉總黃酮體外抗氧化活性

2.5.1 丁香葉總黃酮對DPPH 自由基的清除能力由圖12 可見，丁香葉總黃酮提取物對DPPH 自由基的清除率隨丁香葉總黃酮濃度的增大而提高，呈持續升高的趨勢。VC作為陽性對照組其IC50值為0.167 mg/mL，自由基清除能力越強IC50值越小，小葉丁香葉、暴馬丁香、白丁香和紫丁香葉總黃酮的IC50值依次為0.184、0.221、0.243 和0.374 mg/mL。相同質量濃度下，小葉丁香葉總黃酮清除自由基的能力弱于VC但強于其他三種丁香葉總黃酮，有較高的清除自由基的能力。在質量濃度為0.75～1.0 mg/mL 時，暴馬丁香葉總黃酮與小葉丁香葉總黃酮對DPPH 自由基的清除率相接近，但仍小于小葉丁香葉。當質量濃度達到0.75 mg/mL 時，VC對DPPH 自由基的清除率高于90%，4 種丁香葉總黃酮對DPPH 自由基的清除率均高于80%，四種丁香葉總黃酮對DPPH自由基的清除能力為小葉丁香＞暴馬丁香＞白丁香＞紫丁香。雖然丁香葉總黃酮對DPPH自由基的清除能力弱于VC，但其也達到了對DPPH自由基的較好的清除效果。

圖12 四種丁香葉總黃酮對DPPH 的清除能力Fig.12 Scavenging capacity of four Syringa oblata leaves flavonoids to DPPH

2.5.2 丁香葉總黃酮對OH 自由基的清除能力 由圖13 可知丁香葉總黃酮提取物對OH 自由基的清除率與丁香葉總黃酮濃度呈正相關。VC作為陽性對照組其IC50值為0.059 mg/mL，自由基清除能力越強IC50值越小，小葉丁香葉、暴馬丁香、紫丁香和白丁香葉總黃酮的IC50值依次為0.078、0.106、0.225和0.354 mg/mL。小葉丁香葉總黃酮的IC50值都低于其他種丁香葉，表明小葉丁香葉總黃酮對OH 自由基的清除效果最好；當質量濃度達0.75 mg/mL時，小葉丁香葉和暴馬丁香葉總黃酮與VC的清除能力相差較小，且清除率均達80%以上，表明在此濃度下兩種丁香葉黃酮的清除能力較強。當丁香葉總黃酮質量濃度為1 mg/mL 時，四種丁香葉總黃酮對OH 自由基的清除率均大于80%，雖然丁香葉總黃酮提取物對OH 自由基的清除能力均低于同等質量濃度下的VC，但也表現出較強的OH 自由基清除效果。四種丁香葉對OH 自由基的清除能力依次為小葉丁香＞暴馬丁香＞紫丁香＞白丁香。

圖13 四種丁香葉總黃酮對OH 的清除能力Fig.13 Scavenging capacity of four Syringa oblata leaves flavonoids to OH radical

3 結論

本文對纖維素酶輔助超聲提取小葉丁香葉中總黃酮的提取工藝及4 種丁香葉總黃酮粗提物的抗氧化性進行了較全面的研究。以單因素實驗為基礎，運用響應面實驗進行優化，考慮到實際操作的需要，最佳工藝優化為：pH5.5，加酶量為2%，液料比30:1（mL/g），超聲功率400 W，超聲時間40 min，乙醇體積分數63%，溫度56 ℃。在該條件下，小葉丁香葉總黃酮提取得率為32.21±0.16 mg/g。通過對4 種丁香葉中的總黃酮對DPPH 自由基、OH 自由基清除能力的研究，表明4 種丁香葉總黃酮提取物都具有良好的抗氧化能力。本研究表明纖維素酶輔助超聲提取法在小葉丁香葉總黃酮的提取中有一定優勢，為小葉丁香葉的進一步開發和利用提供參考。本研究僅對小葉丁香葉總黃酮的提取工藝進行了研究，小葉丁香葉總黃酮的純化及藥用活性還需深入研究。