超聲協同低共熔溶劑提取紫丁香花多酚工藝優化及抗氧化活性分析

劉佳怡，黃磊磊，王天怡，張慶芬，楊逢建,*

（1.東北林業大學森林植物生態學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150040；2.東北林業大學化學化工與資源利用學院，黑龍江哈爾濱 150040；3.東北林業大學林業生物制劑教育部工程中心，黑龍江哈爾濱 150040；4.黑龍江省林源活性物質生態利用重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150040；5.東北林業大學生物資源生態利用國家地方聯合工程實驗室，黑龍江哈爾濱 150040）

紫丁香（Syringa oblataLindl.）為木樨科（Oleaceae）丁香屬（Syringa）落葉灌木或小喬木植物[1]，主要分布于我國東北至西南地區[2]。丁香屬植物是一類常見的觀賞類樹木，其根、莖、葉、花、果具有一定的藥用價值[3]。有研究表明，紫丁香中最為重要的次生代謝產物是多酚類物質，多酚類化合物含有苯環結構，廣泛存在于植物中，植物多酚具有凝血活性[4]、抗氧化[5]、降血糖[6]、清熱解毒[7]、抗菌消炎[8]、抗病毒[9]，以及保護神經[10]、抗缺氧[11]等多種藥用活性。

目前對植物多酚的提取方法有溶劑浸提法[12]、索氏提取法[13]、酶輔助法[14]、微波輔助法[15]、超臨界法[16]以及超聲波提取法[17]。其中溶劑浸提法和索式提取法存在提取時間過長，效率低，有機溶劑的使用對環境不友好等劣勢。而超聲波被廣泛應用于植物多酚的提取，其利用高頻超聲波的空化作用，促使溶劑溫度升高，在閉合過程中，溶劑內產生大量空腔，內部溫度和壓力升高，加速目標化合物溶解、擴散至溶劑中，從而提高提取效率[18]。Abboot 等[19]于2003年首次提出低共熔溶劑（Deep Eutectic Solvent，DESs）的理論，低共熔溶劑是一種環境友好的新型綠色溶劑，通常由氫供體（Hydrogen Bond Donor，HBD）和氫受體（Hydrogen Bond Acceptor，HBA）按一定比例非共價結合而成，DESs 在常溫下具有揮發性低、無毒、對環境影響小、易于合成、可回收、可生物降解和低制備成本的特點[20]。呈弱酸性的DESs 有助于分解植物細胞壁[21]，且能通過氫鍵作用力更好地滲透到植物細胞中，不僅能快速溶解出多酚類化合物，且酚類物質的完整度高[22]，因此逐漸取代有機溶劑，用于植物中多酚類、黃酮類等天然化合物的提取。

本研究首次使用超聲-低共熔溶劑法提取紫丁香多酚（Ultrasound-Assisted Deep Eutectic Solvents，UADES），利用單因素以及Box-Behnken 響應面試驗，確定提取丁香多酚的最佳工藝，并與傳統水提法和有機溶劑提取法進行對比，證實該方式是一種相對綠色環保且高效的提取方法。其次通過DPPH、羥基自由基清除實驗來考查紫丁香多酚的體外抗氧化能力，為紫丁香多酚的開發及其活性成分的提取利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫丁香花 采摘于東北林業大學校園，經東北林業大學森林植物生態學教育部重點實驗室毛子軍教授鑒定為木犀科丁香屬植物紫丁香（Syringa oblataLindl.），采收時間為2022 年5 月，陰干后粉碎并過60 目篩，將樣品保存于密封袋，常溫避光備用；氯化膽堿、蘋果酸、乳酸、乙二醇、丙三醇、1,2-丙二醇、尿素、葡萄糖、草酸 分析純，阿拉丁試劑公司；福林酚、二苯基苦味?；诫禄杂苫―PPH）分析純，上海源葉生物科技有限公司；Na2CO3、無水乙醇、甲醇 分析純，天津市致遠化學試劑有限公司；抗壞血酸 分析純，天津市瑞金特化學有限公司。

KQ-500DM-22.5 超聲清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；UV-2600 紫外分光光度儀 日本島津公司；2500C 多功能粉碎機 永康市紅太陽機電有限公司；BSA124S 電子分析天平 德國 Sartorius；Neo15 高速冷凍離心機 上海力申科學儀器有限公司；SHJ-6AB 磁力攪拌水浴鍋 常州金壇良友儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取溶劑的制備 探究氫受體（氯化膽堿）和8 種不同氫鍵供體按一定摩爾比組成的低共熔溶劑體系（DES-1 至DES-8）以及傳統溶劑（水、甲醇、60%乙醇）對多酚提取量的影響。DESs 種類如表1，制備低共熔體系以氯化膽堿為氫受體，選用幾種糖、有機酸和多元醇為氫供體，以一定的摩爾比，在80 ℃磁力儀中攪拌，直到形成清澈透明液體，冷卻至恒溫，放置一周仍為均勻透明且不分層的穩定體系溶液，即為低共熔溶劑DESs，常溫保存備用[23]。

1.2.2 紫丁香總多酚的提取方法 稱取一定量干燥的60 目紫丁香花粉末，加入溶劑于離心管中混勻，置于超聲儀，設置超聲頻率40 Hz、提取溫度60 ℃，超聲時間60 min，料液比1:30 g/mL，超聲功率300 W，待提取液冷卻至室溫后，10000 r/min 離心10 min，取上清液即為紫丁香多酚粗提產物。

1.2.3 標準曲線的繪制及總多酚含量的測定 總多酚含量測定采用Folin-Ciocalteu（FC）法[24]測定：量取沒食子酸標準品，配制濃度為0.05 mg/mL 的標準溶液，分別取0、0.2、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL 于避光離心管中，加蒸餾水至1 mL，加入1 mL 10%福林酚試劑混勻，靜置3～4 min 后，加入10% Na2CO3，定容至刻度，混勻，40 ℃水浴1 h 后，在紫外波長765 nm處測量吸光值，繪制標準曲線回歸方程y=14.362x+0.0516（R2=0.9992），總多酚濃度（mg/mL）與吸光度呈現良好的線性關系。

根據1.2.3 的標準曲線計算以沒食子酸當量的紫丁香多酚的質量濃度，進而得出紫丁香花多酚的提取量（mg/g），按下列公式計算：

式中：W 為總多酚含量，mg/g；C 為回歸方程計算出提取物多酚濃度，mg/mL；V 為定容后提取液體積，mL；N 為提取物的稀釋倍數；m 為紫丁香粉末質量，g。

1.2.4 超聲-低共熔溶劑提取紫丁香花多酚的單因素實驗 依據1.2.2 的方法進行實驗。分別考察不同溶劑（水、60%乙醇、甲醇以及8 種低共熔溶劑）提取效果后，選用提取量最高的DES 為提取溶劑，初始固定參數為：摩爾比1:1.5，提取溫度60 ℃，超聲時間60 min，料液比1:30 g/mL,超聲功率300 W。探究在不同摩爾比（2:1、1:1、1:1.5、1:2 和1:3）；不同提取溫度（30、40、50、60 和70 ℃）；不同超聲時間（30、40、50、60 和70 min）；不同料液比（1:20、1:30、1:40、1:50 和1:60 g/mL）；不同超聲功率（150、200、250、300 和350 W）對紫丁香多酚的提取效果。

1.2.5 超聲-低共熔溶劑提取紫丁香總多酚的響應面優化試驗 在單因素實驗基礎上，以提取溫度（A）、超聲時間（B）、料液比（C）、超聲功率（D）四個單因素為變量，紫丁香總多酚提取量（Y）為響應量進行優化，試驗因素設計與水平設計采用中心組合Box-Behnken 法設置三級別（-1、0、+1）四因素，在Design expert 13.0 軟件上對紫丁香多酚提取進行響應面試驗，共計29 個實驗，各因素及水平見表2。

表2 Box-Behnken 試驗設計因素與水平Table 2 Box-Behnken experimental design factors and levels

1.2.6 體外抗氧化活性測定 將紫丁香總多酚粗提液過AB-8 型大孔樹脂吸附，去離子水洗去雜質，再經70%乙醇洗脫，收集洗脫液，旋蒸除乙醇后，凍干，得到多酚提取物，進行DPPH 和羥基自由基的體外抗氧化實驗。

1.2.6.1 DPPH 自由基清除活性測定 參考王雨[25]的方法，在比色管中加入2 mL 各濃度多酚提取物溶液（0.0125、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/mL）和3 mL DPPH-乙醇工作液（2 mmol/L），搖勻后在避光條件下充分反應30 min，隨后于紫外分光光度計的517 nm 處測定吸光值，記為測定組A1。用無水乙醇代替DPPH 工作液，按上述方法測定吸光值，記為對照組A2；用無水乙醇代替多酚提取液，按上述方法測定吸光值，記為空白組A0。多酚對DPPH 自由基的清除率按下列公式計算：

式中：A0表示空白組吸光值；A1表示測定組吸光值；A2表示對照組吸光值。

1.2.6.2 羥基自由基清除作用 參考Sun 等[26]的方法稍作修改，在比色管中加入2 mL 各濃度多酚提取物溶液（0.0625、0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/mL），2 mL 1.5 mmol/L FeSO4，1 mL 3 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液、2 mL0.1% H2O2，混勻，37 ℃下反應30 min，冷卻至室溫后，隨后于512 nm 處測定吸光值，記作測定組A1，用蒸餾水代替H2O2溶液，按上述方法測定吸光值，記作對照組A2；用蒸餾水代替多酚提取液，按上述方法測定吸光值，記作空白組A0。多酚對羥基自由基的清除率按下列公式計算：

式中：A0表示空白組吸光值；A1表示測定組吸光值；A2表示對照組吸光值。

1.3 數據處理

本實驗均重復實驗三次，數據結果以平均值±標準誤差（Mean±SD）表示，利用軟件SPSS Statistics 26.0 進行方差分析，P＜0.01 表示差異性極顯著，P＜0.05 表示差異性顯著，利用Design expert 13.0 軟件對實驗數據進行統計分析，利用Origin 2023 進行繪制數據圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 不同DESs 組分篩選 由圖1 可知，DES 種類對提取量影響較大，與傳統溶劑相比，大部分DESs（除DES-3 和DES-5）均能顯著提高多酚提取量（P＜0.05）。DES-6（氯化膽堿-蘋果酸）所提取的紫丁香多酚提取量（53.78±0.46 mg/g）最高，顯著高于傳統溶劑水、60%乙醇和甲醇（30.73±0.68、37.49±0.33和35.50±0.12 mg/g）的提?。≒＜0.05）。氫供體為多元羧酸的體系（DES-6、DES-7、DES-8），含有一定的游離氫離子，與多酚中的酚羥基結構結合，能形成較強的氫鍵，促進多酚溶出到溶劑介質中[27]。

圖1 不同DESs 溶劑對紫丁香多酚提取量的影響Fig.1 Effects of different DESs on the yield of polyphenols from Syringa oblata Lindl.

然而DES-1 和DES-2 體系的氫供體為多元醇類，雖略低于羧酸體系的提取量，但因其體系粘度過大不利于操作[28]；以糖類為氫供體的體系（DES-3、DES-4、DES-5）提取量顯著低于多元羧酸和多元醇為氫供體的體系，故不作選擇。這與尚憲超[29]的研究結果一致。

2.1.2 低共熔體系的摩爾比對紫丁香多酚的提取影響 如圖2 所示，隨著氫供體在體系中比例增加，紫丁香多酚的提取量呈現先增加再減少的趨勢。在摩爾比為1:1.5 時多酚提取量達到峰值，之后逐漸下降。氫鍵供體和氫鍵受體的摩爾比是溶劑理化性質的關鍵因素，多酚的提取量很大程度會受到溶劑體系摩爾比的影響。由于多酚中含有酚羥基結構，弱酸性的環境更適合多酚的溶出，當氫鍵供體在體系中占比增大時，溶劑體系酸性增強，則過強的酸性環境會影響多酚的溶出，導致提取量降低。同時提高氫供體在體系中的比例，會導致DES 過于粘稠，使多酚在體系中的溶解空間不足，因此提取量減少[30]。

圖2 不同摩爾比DESs 溶劑對紫丁香多酚提取量的影響Fig.2 Effect of DESs with different molar ratios on the yield of polyphenol from Syringa oblata Lindl.

2.1.3 提取溫度對紫丁香多酚提取量的影響 如圖3所示，提取溫度對紫丁香多酚的提取量的影響較為顯著，多酚的提取量隨溫度升高，呈先上升后下降的趨勢，在60 ℃時紫丁香多酚提取量達到峰值。首先，提高溫度可以使溶劑體系的黏度減小，加速分子運動使多酚可擴散空間變大，多酚更容易從細胞內部擴散到溶劑中，進而提高多酚的提取效果；其次由于多酚的化學結構不穩定，當溫度高于60 ℃，多酚物質易降解，且含有雜質如多糖、蛋白、果膠等活性物質溶出增加，導致目標化合物與介質之間相對濃度差減小，不利于多酚從基質中溶出[31]。因此，超聲溫度選用60 ℃進行后續試驗。

圖3 不同提取溫度對紫丁香多酚提取量的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of polyphenol from Syringa oblata Lindl.

2.1.4 超聲時間對紫丁香多酚提取量的影響 圖4所示，隨超聲時間增加，紫丁香總多酚的提取量整體呈先增大后減小的趨勢。在60 min 時達到峰值，與張波等[32]利用超聲輔助提取法優化提取西柚皮多酚工藝提取時間為60 min 一致。超聲時間是影響多酚提取量的重要參數之一，提取時間較短時，多酚與其他活性物質不易分離，隨超聲時間的增加，使細胞壁破碎的更加充分，從而便于多酚從中釋放和溶出，使得提取出的多酚量增加。但當時間超過60 min 后，由于受到光、熱等因素的影響，導致提取出的多酚受到氧化甚至分解等情況，從而降低了多酚的提取量[32]。且超聲時間過長會增加耗能，導致提取成本的增加[33]。因此，選擇超聲時間為60 min 進行后續試驗。

圖4 不同超聲時間對紫丁香多酚提取量的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of total polyphenol from Syringa oblata Lindl.

2.1.5 料液比對紫丁香多酚提取量的影響 由圖5可知，紫丁香多酚的提取量呈現先顯著增加后顯著降低的趨勢（P＜0.05），料液比為1:30 g/mL 時，紫丁香多酚提取提取量最高，可能由于目標化合物和溶劑的濃度梯度差變大，使紫丁香粉末顆粒的可擴散空間增加，增加與溶劑之間的接觸面積，從而傳質推動力增大，加快物質運輸的進程，有利于增加多酚的提取量；然而隨溶劑體積繼續增大，使DESs 體系會過粘稠，導致作用于原料的輻射能量減小，因此多酚溶出量會減少[34]，且可能促進一些脂溶性和醇溶性雜質的溶出[35]，不僅使得目標化合物提取量下降，還會造成溶劑的浪費。因此，選擇料液比為1:30 g/mL 用于后續試驗。

圖5 料液比對紫丁香多酚提取量的影響Fig.5 Effect of with solid-liquid ratio on the yield of polyphenol from Syringa oblata Lindl.

2.1.6 超聲功率對紫丁香多酚提取量的影響 由圖6可知，超聲功率在150～300 W 之間時，多酚提取量隨功率變大而逐漸增加，當功率達到300 W 時，紫丁香多酚提取量達到最大值，隨后下降。可能由于在提取初始階段，超聲波使原料質點在溶劑空間中進行振動狀態從而出現“空化現象”[36]，使植物細胞部分被破壞，從而增加目標物質的擴散。當超聲功率超過300 W 時，可能由于功率過高，其熱效應與機械效應導致多酚類物質的破壞，導致部分多酚分解，含量降低[37]。

圖6 不同超聲功率對紫丁香多酚提取量的影響Fig.6 Effect of ultrasonic power on the yield of polyphenol from Syringa oblata Lindl.

2.2 響應面試驗優化工藝

2.2.1 響應面試驗設計建立與顯著性分析檢驗 中心組合優化試驗設計及結果如表3。以紫丁香多酚提取量（Y）為響應值，自變量為提取溫度（A）、超聲時間（B）、料液比（C）、超聲功率（D）四個因素，在Design Expert 13.0 軟件中，用多元線性回歸擬合得二次多項回歸方程模型如下：

表3 響應面中心組合試驗設計及試驗結果Table 3 Response surface center combination experimental design and results

F表示模型擬合方程的顯著程度，即F值越大，對響應值的影響越大，擬合程度越好。從表4 可知，實驗模型的F=145.28，P＜0.01，達到極顯著水平，具有統計學意義；F失擬項=2.43，P＞0.05，說明該模型不存在顯著誤差，模型擬合度較為良好，可用于紫丁香花多酚提取量分析；其中，模型Y中A、B、D、A2、B2、C2、D2、AB、BC、CD 對紫丁香多酚提取量有極顯著差異（P＜0.01），AC、AD 對多酚提取量顯著差異（P＜0.05），說明兩者的組合因素對多酚提取量影響顯著，其他因素不顯著（P＞0.05）。模型決定系數R2=0.9932，RAdj2=0.9863，均大于0.9，因此，該模型相關度較好，擬合度較高，實驗穩定性較好，可以較好反映出各因素之間的關系，利用回歸方程進行預測各因素對后續實驗的影響規律。

表4 響應面擬合二次回歸方程方差分析結果Table 4 Results of response surface fitting regression equation ANOVA

根據顯著性檢驗F大小可知，各因素對多酚提取量的影響從大到小分別為：提取溫度（A）＞超聲時間（B）＞超聲功率（D）＞料液比（C）。

2.2.2 各因素交互作用的3D 響應曲面圖 在Design-expert 13.0 對表4 的數據進行多元回歸擬合，得3D 響應曲面圖后可直觀評價各因素對紫丁香多酚提取量影響交互作用的強弱，從而得到各變量的最佳條件。3D 響應曲面坡度越陡峭、等高線性狀越扁平，則說明各因素交互效應越顯著，圖內藍色到紅色的變化，則為提取量從少到多的變化[38]。若等高線為圓形，則表示兩因素交互作用對響應值的影響不顯著，若等高線呈橢圓形或馬鞍形則表示兩因素交互效應對響應值的影響顯著[39]。

圖7 直觀地反映了各因素對多酚提取量的影響程度。如圖7（a），響應面的曲線坡度較陡峭，等高線為橢圓形，說明AB 間交互作用對響應值的影響顯著，隨兩因素的增大，紫丁香多酚的提取量也逐漸升高。提取溫度的升高，可促進植物多酚與基質間的物理吸附和化學相互作用[40]。在提取溫度60 ℃，超聲時間60 min 時，多酚提取量較高。超過此參數條件后，多酚的提取量開始下降，與單因素結果一致。由圖7b～圖7d、圖7f 可知，等高線密集且呈橢圓，說明AC、AD、BC、CD 的相互作用對響應值的影響均為顯著。如圖7e 所示，3D 曲面圖坡度較為平緩，說明BD 交互作用對響應值的影響不顯著。

圖7 不同因素間的交互作用對紫丁香多酚提取量影響Fig.7 Interactions of different experimental factors on the effects of extraction yield of polyphenols from Syringa oblata Lindl.

2.3 驗證試驗

根據以上模型分析，紫丁香中提取多酚的最佳條件：提取溫度61.48 ℃，超聲時間57.67 min，超聲功率304.32 W，料液比1:30.08 g/mL，并進行了3 次平行試驗。根據實際情況調整參數為：提取溫度60 ℃，超聲時間60 min，超聲功率300 W，料液比1:30 g/mL，紫丁香總多酚提取量為52.19±0.13 mg/g，與預測值53.57±0.57 mg/g 吻合度較高，說明該模型條件可靠具有一定的實用價值。

2.4 紫丁香多酚提取物的抗氧化活性

2.4.1 DPPH 自由基清除能力 DPPH 基于自身三個苯環的共振穩定作用和空間障礙，是一種較為穩定的氮中心的自由基，作為一種穩定的自由基，DPPH可以捕獲其他的自由基。因此，常用于考察目標化合物的體外抗氧化效果[41]。如圖8 可知，在0.03125～0.5 mg/mL 內各濃度紫丁香多酚提取液對DPPH 自由基的清除率與測樣濃度呈現正相關關系。在濃度為0.5 mg/mL后，清除能力緩慢增強。但同濃度下的VC清除自由基能力始終高于紫丁香多酚提取液，且在0～0.125 mg/mL 之間無顯著差異（P＞0.05）。當濃度大于1 mg/mL，兩者的抗氧化能力相接近。紫丁香多酚在濃度為2 mg/mL 時，DPPH 清除能力達93.28%，說明其較強抑制DPPH 自由基的能力。與黃瓊等[42]對鐵皮石斛葉多酚對DPPH 清理能力的研究結果相近。

圖8 VC 和多酚提取物對DPPH 自由基清除率Fig.8 Scavenging rate of DPPH free radical by VC and polyphenol extract

2.4.2 羥基自由基清除能力 羥基自由基氧化活性很強，如自由基的大量產生和累積會導致氧化應激反應，與活細胞中分子相互作用，且對DNA 等生物分子造成損傷，進而產生組織病變、心血管和神經退行性等疾病的發生[43]。紫丁香多酚和VC對羥基自由基的清除作用如圖9 所示，在0.0625～2 mg/mL 內不同濃度的多酚提取液對羥基自由基均有一定的清除能力，且隨濃度的升高而增大，與濃度呈現正相關。在濃度2.0 mg/mL 時，對羥基自由基的清除能力可達52.57%。然而，在相同濃度下的VC對照組清除能力始終高于紫丁香多酚提取液。

圖9 VC 和多酚提取物對羥基自由基的清除率Fig.9 Scavenging rate of hydroxyl free radical by VC and polyphenol extract

3 結論

本文利用超聲協同低共熔溶劑法對紫丁香多酚的工藝進行優化。首先，在8 種不同DES 體系中，篩選出提取量最高的DES 體系：氯化膽堿-蘋果酸（摩爾比為1:1.5），且提取量高于傳統溶劑水、60%乙醇和甲醇（30.73±0.68、37.49±0.33、35.50±0.12 mg/g）。在單因素的基礎上，利用響應面試驗進行優化，最佳提取工藝參數為提取溫度60 ℃，超聲時間60 min，料液比1:30 g/mL，超聲功率300 W，紫丁香多酚可達紫丁香總多酚提取量為52.22±0.12 mg/g。此方法遠高于趙青等[44]利用有機溶劑浸提法提取紫丁香多酚的得率1.73±0.05 mg/g。綜上表明，超聲協同低共熔溶劑法在提取紫丁香多酚工藝中具有可行性以及相較于傳統提取方法，效率顯著提升，方法更加綠色環保且提取成本更為廉價。在濃度為0～2 mg/mL 時，紫丁香多酚對DPPH 和羥基自由基均具有一定的清除能力，為紫丁香花多酚高效綠色的提取工藝及其資源開發利用提供思路。