茶葉酵素?zé)o機陶瓷膜過濾工藝優(yōu)化

李春燕，魏福曉，王 瑜，張朝舉，徐甜甜，王道平

（貴州省天然產(chǎn)物研究中心，貴州醫(yī)科大學(xué)，省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州貴陽 550014）

澄清對于保證酵素穩(wěn)定性、延長貯藏期和提高酵素感官品質(zhì)等方面具有重要作用。傳統(tǒng)的澄清方法有加酶[1-2]（果膠酶、復(fù)合酶）澄清法、加吸附劑[1-2]（膨潤土、硅藻土）澄清法、化學(xué)澄清法[3]（凍融法、醇沉法、殼聚糖絮凝法）等，但這些澄清法在一定程度上會發(fā)生物理化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致酵素中功效成分發(fā)生變化，直接影響酵素的色、香、味，破壞其生物活性物質(zhì)的含量。膜過濾技術(shù)[4-6]是天然或人工合成的高分子薄膜以壓力差、濃度差、電位差和溫度差等外界能量位差為推動力，對雙組分或多組分的溶質(zhì)和溶劑進行分離、分級、提純和富集的方法。目前，膜分離所使用的材料大致可以分為無機膜和有機膜兩大類，有機膜化學(xué)穩(wěn)定性與機械強度較弱，壽命較短，較易堵塞；而無機陶瓷膜[7-9]化學(xué)穩(wěn)定性好，耐酸、堿和有機溶劑的化學(xué)侵蝕；耐高溫，抗微生物能力強，不與微生物發(fā)生作用；機械強度高，耐高壓，有良好的耐磨、耐沖刷性能；孔徑分布窄，分離性能好、滲透量大；可反復(fù)清洗、再生，彌補了高溫濃縮法和有機膜分離法的不足，且采用膜分離技術(shù)可以濾除提取液中蛋白質(zhì)、淀粉、果膠、鞣質(zhì)等大分子物質(zhì)以及微生物[10-11]，對酸度、糖度無影響[12]，且功效成分基本無截留[13-14]，廣泛應(yīng)用于藥品、食品的工業(yè)除雜領(lǐng)域。

目前，一些研究者應(yīng)用陶瓷膜對烏龍茶水[15]、蔗汁[16]、紅茶茶湯[17]、山茱萸水提液[18]、粗制茶多糖[19]等進行了研究，結(jié)果證明，應(yīng)用陶瓷膜進行分離可達到澄清、除雜和功效成分富集的效果。但是目前以發(fā)酵的茶葉酵素為研究對象的還未有報道，且因發(fā)酵的原因，茶葉酵素的內(nèi)含物質(zhì)比茶水多，過膜時比茶水難，本課題組前期預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)無機陶瓷膜（20～400 nm）過濾后茶葉酵素感官品質(zhì)（色澤、香氣、滋味）基本無變化，透光率和保質(zhì)期能得到較大的提高，同時該方法較易實現(xiàn)工業(yè)化成產(chǎn)。因此本文采用不同孔徑的陶瓷膜對鳳岡鋅硒夏秋茶發(fā)酵后的茶葉酵素進行過濾澄清，對過濾后茶葉酵素的功能成分、透光率、膜通量、可溶性固形物含量進行測定，篩選出最佳的膜孔徑和過膜條件，最終將其應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，對貴州鳳岡鋅硒夏秋茶酵素工業(yè)化的可持續(xù)發(fā)展具有重要的推進意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

夏秋茶 2021 年9 月采摘于貴州省遵義市鳳岡縣田壩村，包括夏秋茶嫩葉、老葉及部分枝干；白砂糖 購買于德旺佳超市；紅茶菌菌種 實驗室自制引種；L-茶氨酸（DST211028-021）、茶多酚（DSTDC013 001）成都德思特生物技術(shù)有限公司；鋅、硒標(biāo)準溶液（1000 μg/mL）國家有色金屬及電子材料分析測試中心；硝酸、高氯酸 GR，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；甲醇 GR，默克化工技術(shù)（上海）有限公司；三氟乙酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、硫酸亞鐵、酒石酸鉀鈉 AR，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

Cary 60 紫外可見分光光度計 美國安捷倫公司；Prodigy XP 電感耦合等離子發(fā)射光譜儀 利曼科技有限公司；AFS-2100 雙道原子熒光光度計 北京海光儀器有限公司；BONA-GM-22 陶瓷膜過濾實驗機[CT-30-300 無機陶瓷膜20 nm（膜編號：12200125）、50 nm（膜編號：05112073）、100 nm（膜編號：01081062）、200 nm（膜編號：07282049）、400 nm（膜編號：05272176）] 長度30 cm，過濾面積0.07 m2，通道19 個，通道直徑4 nm，山東博納生物科技有限公司。

1.2 茶葉酵素發(fā)酵

紅茶菌懸液培養(yǎng)：按鳳岡鋅硒夏秋茶:蔗糖:水=10:100:1000（m:m:V）的比例，先將水煮沸，加入夏秋茶浸泡于85～90 ℃水中保持20 min，濾去茶葉渣得茶汁，按比例加入溶化的糖水，混勻后分裝到三角瓶中，每500 mL 裝入300 mL 糖茶水，用牛皮紙包扎，進行巴氏消毒，冷卻至室溫，加入15%紅茶菌菌種，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)15 d，即得。

茶葉酵素制備：按茶水比3%，稱取相應(yīng)質(zhì)量的夏秋茶，加入煮沸純水，浸泡20 min，過濾，濾液加白砂糖10%（m/V），攪拌均勻并溶化，冷卻至室溫，裝瓶40 L/50 L，接種15%紅茶菌液，置于恒溫發(fā)酵室內(nèi)，發(fā)酵15 d，發(fā)酵溫度30±2 ℃。

1.3 茶葉酵素膜過濾工藝

1.3.1 單因素實驗 本文依次考察膜孔徑、過膜功率、過膜壓力、過膜溫度對茶葉酵素過膜通量，過膜后酵素液透光率、固形物、功能成分含量的影響。

1.3.1.1 無機陶瓷膜孔徑范圍的確定 固定功率40 Hz，溫度10～20 ℃，壓力0.35 MPa，以膜孔徑為單因素變量，分別考察膜孔徑20、50、100、200、400 nm對茶葉酵素過膜通量，過膜后酵素液透光率、固形物含量、功能成分含量的影響。

1.3.1.2 過膜功率考察 固定膜孔徑400 nm，過膜壓力0.18 MPa，過膜溫度10～20 ℃，以過膜功率為單因素變量，分別考察過膜功率30、35、40、45、50 Hz對茶葉酵素過膜通量，過膜后酵素液透光率、固形物含量、功能成分含量的影響。

1.3.1.3 過膜壓力考察 固定膜孔徑400 nm，過膜功率40 Hz，過膜溫度10～20 ℃，以過膜壓力為單因素變量，分別考察過膜壓力0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 MPa 對茶葉酵素過膜通量，過膜后酵素液透光率、固形物含量、功能成分含量的影響。

1.3.1.4 過膜溫度考察 固定膜孔徑400 nm，過膜功率40 Hz，過膜壓力0.25 MPa，以過膜溫度為單因素變量，分別考察過膜溫度10～20 ℃、20～30 ℃、30～40 ℃、40～50 ℃、50～60 ℃對茶葉酵素過膜通量，過膜后酵素液透光率、固形物含量、功能成分含量的影響。

1.3.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計 通過對單因素的系統(tǒng)考察，固定400 nm 孔徑的陶瓷膜，以過膜功率（A）、過膜壓力（B）、過膜溫度（C）為自變量，因過膜的主要目的是在獲得功能成分較高保留量的基礎(chǔ)上獲得最佳透光率。通過單因素實驗的篩選，已經(jīng)能夠確保茶葉酵素中功能成分得到最大的保留，所以響應(yīng)面試驗設(shè)計以過膜后酵素液透光率為響應(yīng)值，運用Design Expert V8.0.6 軟件進行三因素三水平[20-21]試驗設(shè)計，茶葉酵素膜過濾工藝因素水平見表1。

表1 茶葉酵素膜過濾工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗因素水平設(shè)計Table 1 Level design of experimental factors for optimal response surface of tea enzyme membrane filtration process

1.4 理化指標(biāo)測定方法

1.4.1 茶多酚、茶氨酸含量測定方法 用UV-VIS法測定，茶多酚含量測定參照GB/T 8313-2018 茶葉中的茶多酚和兒茶素類含量的檢測；茶氨酸含量測定參照GB/T 8314-2013 茶 游離氨基酸總量的測定。

1.4.2 鋅、硒含量測定方法 鋅、硒含量測定方法：鋅測定參照GB 5009.14-2017《食品安全國家標(biāo)準食品中鋅的測定》第二法；硒測定參照GB 5009.93-2017《食品安全國家標(biāo)準 食品中硒的測定》第一法。

1.4.3 膜通量測定方法 膜通量是指單位時間、單位膜面積透過組分的通過量，以J 表示，本試驗記錄膜通量為發(fā)酵液過濾的平均膜通量[22]。

式中：J 為膜滲透通量，m3/（m2·h）；V 為透過組分的體積，m3；A 為膜有效面積，m2；t 為操作時間，h。

1.4.4 透光率、可溶性固形物含量測定方法 透光率測定方法[23]：用紫外可見分光光度計在 625 nm 處測量。

可溶性固形物含量測定方法[24]：取一定體積的茶葉酵素于蒸發(fā)皿中，放于烘箱中（105 ℃，5 h）進行烘干，烘干后固體物的重量即為可溶性固形物的含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

所有試驗數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)試驗結(jié)果的平均值，采用SPSS Statistic 17 進行單因素顯著性分析，Design Expert V8.0.6 軟件進行響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 無機陶瓷膜孔徑對過濾效果的影響 不同孔徑無機陶瓷膜對茶葉酵素膜通量、透光率、固形物含量、功能成分含量的影響見圖1 和表2。

圖1 不同孔徑陶瓷膜過濾后茶葉酵素功能成分含量（n=3）Fig.1 Contents of functional components of tea enzymes filtered by ceramic membrane with different pore sizes (n=3)

表2 不同孔徑陶瓷膜過濾后茶葉酵素的膜通量、透光率、可溶性固形物（n=3）Table 2 Membrane flux,light transmittance and soluble solids of tea enzymes filtered by ceramic membranes with different pore sizes (n=3)

由圖1 可知，原液組中4 種功能性成分的含量最高，其他組隨著陶瓷膜孔徑的增大，功能成分含量也隨之增大。對于茶多酚含量，原液組與400 nm 組含量最高，20 nm 組含量最低，顯著（P＜0.05）低于原液組與400 nm 組；對于茶氨酸含量，原液組、400 nm組、200 nm 組含量最高，20 nm 組、50 nm 組、100 nm組含量最低，顯著（P＜0.05）低于原液組、400 nm 組、200 nm 組；對于鋅含量，原液組、400 nm 組、200 nm組含量最高，20 nm 組、50 nm 組含量最低，顯著（P＜0.05）低于原液組、400 nm 組、200 nm 組；對于硒含量，原液組含量最高，20 nm 組含量最低，顯著（P＜0.05）低于原液組。因此，選擇400 nm 能盡可能多的保留功能成分的含量。由表2 可知，隨著陶瓷膜孔徑的增大，膜通量逐漸增大、可溶性固形物含量也有增加趨勢，酵素液的透光率呈降低趨勢，各個陶瓷膜孔徑過濾后酵素液透光率在79%以上，均為透亮澄清溶液，考慮到實際工業(yè)生產(chǎn)中生產(chǎn)量大，選擇400 nm 孔徑過濾不僅膜通量大且不易堵塞。推測膜孔徑增大，孔隙度也越大，孔徑越均勻，允許通過的分子量也增多，因此功能成分含量、可溶性固形物含量增大；此外，增大的膜孔徑會減小過膜阻力，功能成分的通行更順暢，通過的物質(zhì)增多，膜通量增大，透光率減小[25]。

2.1.2 過膜功率對過濾效果的影響 過膜功率對茶葉酵素膜通量、透光率、固形物含量、功能成分含量的影響見圖2 和表3。

圖2 不同功率過濾后茶葉酵素功能成分含量（n=3）Fig.2 Contents of functional components of tea enzymes after filtration with different powers (n=3)

表3 不同功率過濾后茶葉酵素膜通量、透光率、可溶性固形物含量（n=3）Table 3 Tea enzyme membrane flux,light transmittance and soluble solids content after filtration with different powers (n=3)

由圖2 可知，原液中4 種功能成分的含量最高，隨著過膜功率的變化，功能成分的含量也發(fā)生著變化。對于茶多酚含量，原液組含量最高，40 Hz 組含量次高，45 Hz 組含量最低，顯著（P＜0.05）低于其余各組；對于茶氨酸含量，原液組含量最高，45 Hz 組含量次高，30 Hz 組含量最低，顯著（P＜0.05）低于其余各組；對于鋅含量，原液組含量最高，50 Hz 組、45 Hz組含量次高，40 Hz 組含量最低，顯著（P＜0.05）低于原液組、50 Hz 組、45 Hz 組；對于硒含量，各組均差異不顯著，說明過膜功率對其影響不大。因此，40 Hz時茶多酚含量保留率最高，45 Hz 時茶氨酸含量保留率最高，45 和50 Hz 時鋅含量保留率最高，從過膜后功能成分最大保留的條件出發(fā)，40、45、50 Hz 對茶葉中功能成分有不同程度的保留作用。由表3 可知，隨著過膜功率的增大，膜通量逐漸增大，酵素液的透光率和可溶性固形物也呈增大趨勢，40、45、50 Hz組酵素液透光率超80%，較為透亮澄清。因此，選用40、45、50 Hz 作為過膜功率均可。綜上，適當(dāng)增大過膜功率有助于保留酵素液中的功能成分。推測設(shè)備功率增大，單位時間內(nèi)工作效率變高，茶葉酵素中通過的功能成分增多，單位時間內(nèi)的過膜速率增大，膜通量增大；此外，膜上的擠壓力增大，膜孔徑之間的縫隙變小，大分子物質(zhì)不易透過，因此透光率增大。

2.1.3 過膜壓力對過濾效果的影響 過膜壓力對茶葉酵素膜通量、透光率、固形物含量、功能成分含量的影響見圖3 和表4。

圖3 不同壓力過濾后茶葉酵素功能成分含量（n=3）Fig.3 Contents of functional components of tea enzymes after filtration under different pressures (n=3)

表4 不同壓力過濾后茶葉酵素膜通量、透光率、可溶性固形物含量（n=3）Table 4 Membrane flux,light transmittance and soluble solids content of tea fermentation under different pressure filtration (n=3)

由圖3 可知，原液中4 種功能成分的含量最高，隨著過膜壓力的變化，功能成分的含量也發(fā)生著變化。對于茶多酚含量，原液組含量最高，0.35 MPa 組含量次高，0.25 MPa 組含量最低，顯著（P＜0.05）低于其余各組；對于茶氨酸含量，各組均差異不顯著，說明過膜壓力對其影響不大；對于鋅含量，原液組與0.30 MPa組含量最高，其余各組含量差異不顯著；對于硒含量，原液組與0.30 MPa 組含量最高，0.25 MPa組含量最低，顯著（P＜0.05）低于原液組與0.30 MPa組。因此，0.35 MPa 時茶多酚含量保留率最高，0.30 MPa時鋅和硒含量保留率最高。由表4 可知，隨著過膜壓力的增大，酵素液的透光率、可溶性固形物含量、膜通量呈增大趨勢，0.25、0.30、0.35 MPa 組酵素液透光率值較大且差異不顯著，因此，選用0.25、0.30、0.35 MPa 作為過膜壓力均可。分析原因，在臨界壓力范圍內(nèi)[26]，設(shè)備壓力增大，過膜推動力增大，單位時間內(nèi)的過膜速率增大，工作效率增高，膜上擠壓力增大，膜孔徑之間的縫隙變小，因此，增大設(shè)備壓力，膜通量、透光率、可溶性固形物含量有增大趨勢。該結(jié)果與Loizzo 等[27]研究結(jié)果部分一致，Loizzo MR 使用膜分離對意大利Femminello comune果汁進行了分離，結(jié)果表明：在膜上施加越來越大的壓力導(dǎo)致可溶性固形物含量略有減少，但不會導(dǎo)致總酚類活性化合物的損失。

2.1.4 過膜溫度對過濾效果的影響 過膜溫度對茶葉酵素膜通量、透光率、固形物含量、功能成分含量的影響見圖4 和表5。

圖4 不同溫度過濾后茶葉酵素功能成分含量（n=3）Fig.4 Contents of functional components of tea enzymes after filtration at different temperatures (n=3)

表5 不同溫度過濾后茶葉酵素膜通量、透光率、可溶性固形物含量（n=3）Table 5 Membrane flux,light transmittance and soluble solids content of tea enzymes filtered at different temperatures (n=3)

由圖4 可知，原液中4 種功能成分的含量最高，隨著過膜溫度的升高，功能成分的含量也呈增加趨勢。對于茶多酚含量，原液組含量最高，30～40 ℃組含量次高，50～60 ℃組含量最低，顯著（P＜0.05）低于原液組和30～40 ℃組；對于茶氨酸含量，原液組、50～60 ℃組含量最高，10～20 ℃組含量最低，顯著（P＜0.05）低于原液組和50～60 ℃組；對于鋅含量，原液組、50～60 ℃組含量最高，顯著（P＜0.05）高于其余各組；對于硒含量，原液組、50～60 ℃、40～50 ℃組含量最高，其余各組含量差別不大。因此，50～60 ℃對茶葉酵素功能成分的保留效果最佳。由表5 可知，隨著過膜溫度的增大，酵素液的膜通量、可溶性固形物呈增大趨勢，但透光率呈降低趨勢，10～20 ℃、20～30 ℃組酵素液透光率超80%，較為透亮澄清。因此，選用10～30 ℃作為最佳過膜溫度。推測過膜溫度升高，膜的滲透性升高，茶葉酵素的溶解度增加，粘度降低，濃差極化層變薄，從而降低了流阻，相應(yīng)地提高了滲透率，過膜速率增快，過膜物質(zhì)增多，因此酵素液功能成分含量增高，膜通量增大，可溶性固形物含量增大，透光率減小[28]。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

根據(jù)孔徑考察結(jié)果可知，孔徑為400 nm 時，茶葉酵素透光率超80%，且功能成分含量相對原液組最高；根據(jù)過膜功率考察結(jié)果可知，過膜功率為40、45、50 Hz 時，茶葉酵素透光率超80%；根據(jù)過膜壓力考察結(jié)果可知，過膜壓力為0.25、0.30、0.35 MPa時，茶葉酵素透光率在80%左右；根據(jù)溫度考察結(jié)果可知，溫度為10～30 ℃時，茶葉酵素透光率超80%。因此，過膜功率、過膜壓力、過膜溫度對茶葉酵素透光率和功效成分有一定的影響，本文旨在提高茶葉酵素透光率的情況下盡可能多的保留酵素中的功效成分，因此在保證茶葉酵素透光率超80%的條件下，以合適的過膜功率（40～50 Hz）、過膜壓力（0.25～0.35 MPa）、過膜溫度（10～30 ℃）為自變量，過膜后酵素液透光率為響應(yīng)值，應(yīng)用響應(yīng)面-星點設(shè)計法優(yōu)化茶葉酵素膜過濾工藝的試驗結(jié)果見表6 和表7，其中表6 為星點設(shè)計試驗和結(jié)果；表7為茶葉酵素膜過濾工藝所建立的回歸方程的方差分析。

表6 響應(yīng)面設(shè)計試驗與結(jié)果（n=3）Table 6 Test and results of response surface design (n=3)

表7 回歸方程方差分析Table 7 Variance analysis of regression equation

通過多元線性回歸二項式擬合，在三重復(fù)的條件下以過濾液透光率（Y）為響應(yīng)值，得回歸方程為：Y=-21.9298+3.7202A+147.3350B-0.3474C-1.5400AB+0.0179AC+0.6150BC-0.0377A2-148.6000B2-0.0222C2，R2=0.9148，說明該模型與試驗擬合良好，可用此模型進行分析和預(yù)測。由表7 可知，方差模型P＜0.0317，顯著，說明建立的模型是有意義的；失擬項P（0.5483）＞0.05，不顯著，表明該模型能很好地預(yù)測過膜后酵素液的透光率；P值反映各因素對透光率的重要性，一次項C 顯著（P＜0.05），二次項C2顯著（P＜0.05），說明對茶葉酵素過膜工藝的影響順序為：過膜溫度＞過膜功率＞過膜壓力，過濾溫度對茶葉酵素的影響較大。軟件預(yù)測最佳過膜條件為：過膜功率47.17 Hz，過膜壓力0.28 MPa，過膜溫度14.99 ℃，在此過膜條件下，預(yù)測透過液的透光率為84.01%。

2.3 驗證試驗

基于響應(yīng)面法優(yōu)化的茶葉酵素最佳的過膜條件，結(jié)合實施的便利，將優(yōu)化條件修正為過膜功率47 Hz，過膜壓力0.28±0.02 MPa，過膜溫度15±2 ℃，試驗重復(fù)3 組，得到過膜后茶葉酵素透光率平均值為85.10%±0.12%，接近于預(yù)測值；由表8 可知，最佳過膜條件過濾后，茶多酚含量保留率為95.28%，茶氨酸含量保留率為82.91%，鋅含量保留率為90.48%，硒含量保留率為91.67%，可溶性固形物含量保留率為84.46%，透光率與過膜前相比提高了2.5 倍，膜通量為123.25 m3/（m2·h）。

表8 原液組與驗證組功能成分、膜通量、透光率，可溶性固形物含量變化（n=3）Table 8 Changes of functional components,membrane flux,light transmittance and soluble solid content between the original solution group and the verification group (n=3)

3 結(jié)論

本文應(yīng)用無機陶瓷膜過濾技術(shù)對茶葉酵素進行過濾澄清，結(jié)果最佳的過膜條件為：膜孔徑400 nm、過膜功率47 Hz、過膜壓力0.28±0.02 MPa，過膜溫度15±2 ℃，在此條件下，茶葉酵素功能成分含量保留率、可溶性固形物含量保留率＞80%，透光率平均值為85.10%±0.12%。表明將無機陶瓷膜應(yīng)用于茶葉酵素過濾澄清是可行的，其優(yōu)點是在不改變茶葉酵素的色、香、味的前提下，能使茶葉酵素中功能成分損失少，過濾后濾液澄清度高，穩(wěn)定性好，且工業(yè)生產(chǎn)中極易實現(xiàn)的操作，易于連續(xù)化、自動化、標(biāo)準化成產(chǎn)，但工業(yè)生產(chǎn)中由于生產(chǎn)量大，易造成陶瓷膜的堵塞，因此陶瓷膜的定期清洗和保養(yǎng)是后期需要重點研究的方向。