基于HPLC 結合化學計量學研究黃芪莖葉的最適采收期

李小蘭，高欣緣，孫 杰，魏赫男，郭麗麗

（山西中醫藥大學中藥與食品工程學院，山西晉中 030619）

黃芪莖葉是豆科多年生草本植物蒙古黃芪Astragalus memeranaceus（Fisch.）Bge.Var.mongholicus（Bge.）Hsiao 或膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的地上部分。每年伴隨黃芪入藥根部的采挖，大量的地上莖葉被廢棄，如何加強對黃芪莖葉的資源挖掘和精深開發利用逐漸成為研究者關注的重要現實問題[1]。現代科學研究表明，黃芪莖葉具有與其入藥根部類似的多糖類、黃酮類、皂苷類等化學成分[2]，其中黃酮類具有抗炎、抗氧化等活性[3]，而皂苷類具有抗心力衰竭、抗心肌缺血等作用[4]。黃芪甲苷是黃芪皂苷類成分的代表，毛蕊異黃酮葡萄糖苷是黃芪黃酮類成分的代表，這兩種成分也是藥典中所規定的黃芪質量控制的指標成分[5]，說明黃酮類和皂苷類是植物黃芪的重要功效成分。

功效成分含量的高低會影響到黃芪莖葉資源的生理活性。分光光度法、高效液相色譜法、高效液相色譜-質譜聯用法等可用于黃芪莖葉黃酮類和皂苷類功效成分的定量檢測，其中高效液相色譜法仍然是多種單一成分精確定量分析的主流方法[6-7]。通過應用多波長、一測多評等方法，采用HPLC 可實現僅單次色譜分離即可高通量同步測定多成分含量的目的，在植物資源質量控制、品質評價、代謝產物研究等方面有著廣泛應用[8-11]。此外，功效成分含量的高低還會受到采收期的影響。相關研究表明膜莢黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、芒柄花素和黃芪甲苷的含量隨采收期呈動態變化趨勢，其中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷和黃芪甲苷含量在10 月份達到最高，而芒柄花素含量在該月達到最低[12]；對蒙古黃芪的研究也表明黃酮和皂苷含量會受采收期的影響，8 月上旬采收的黃芪中黃酮和皂苷含量最高[13]。類似地，對其他食藥兩用植物的研究也表明采收期會影響活性成分的含量，相關研究還證實了采收期會進一步影響植物資源的功效，如秋季采收的牛藤葉提取物抗炎活性最強[14]，8 月下旬采收的五味子果α-葡萄糖苷酶抑制活性最強[15]。

由此可見，采收期會影響黃芪莖葉功效成分的含量，從而影響到黃芪莖葉的活性，明確其活性成分隨采收期的動態變化規律對于黃芪莖葉原料資源的質量控制具有重要意義。目前，黃芪莖葉的研究主要集中于活性成分解析和藥效作用探索方面，其活性成分隨采收期的動態變化規律尚不明確。基于此，本研究采用高效液相色譜法對黃芪莖葉中毛蕊異黃酮葡萄糖苷等7 種黃酮類成分和黃芪甲苷等3 種皂苷類成分進行同步含量測定，并結合化學計量學方法分析活性成分隨采收期的動態變化規律，以期明確黃芪莖葉的最適采收期，為黃芪莖葉的合理采集、按需采收和最大化利用提供一定科學依據，也為黃芪莖葉的質量控制和合理利用奠定理論基礎，對植物黃芪的產業化開發和產業鏈延伸具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黃芪莖葉 采收于山西省渾源縣黃花灘鄉，經山西中醫藥大學中藥資源與鑒定教研室劉計權教授鑒定為蒙古黃芪Astragalus membranaceusvar.mongholicus 的新鮮莖葉，樣品采收后將莖、葉分離，自然陰干，干燥至恒重，粉碎，過4 號篩后儲存。樣品信息見表1；蘆丁、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、黃芪皂苷Ⅱ HPLC≥98%，上海融合醫藥科技有限公司；金絲桃苷、槲皮苷、山奈酚、大豆皂苷Bb、黃芪甲苷 HPLC≥98%，上海麥克林生化科技有限公司；乙腈、甲醇 色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；甲醇 分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；娃哈哈純凈水 杭州娃哈哈集團有限公司。

表1 樣品信息Table 1 Information of samples

HH-4 數顯恒溫水浴鍋 金壇市杰瑞爾電器有限公司；AR223CN 電子天平 奧豪斯儀器（常州）有限公司；GZX-9030MBE 電熱鼓風干燥箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；SB25-120 超聲波清洗機 寧波新芝生物科技有限公司；RIGOL L-3000 系列高效液相色譜儀 北京普源精電科技有限公司；Agilent ZORBAX Extend C18色譜柱（4.5×250 mm，5 μm）安捷倫科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 供試品溶液的制備 精密稱取5 g 干燥黃芪莖葉粉末，置于250 mL 圓底燒瓶中，加入100 mL甲醇，50 ℃下超聲提取1 h，室溫下靜置冷卻，過濾。濾液旋蒸至含有少量流動液體后倒出，放入60 ℃烘箱中烘干。隨即用色譜級甲醇溶解并定容至5 mL，稀釋適當倍數后，搖勻得到供試品溶液。

1.2.2 混合對照品溶液的制備 取各待測成分對照品適量，精密稱定，加色譜級甲醇制成蘆丁、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、金絲桃苷、槲皮苷、大豆皂苷Bb、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、黃芪甲苷、山奈酚和黃芪皂苷Ⅱ質量濃度分別為41.00、35.01、39.90、40.42、101.00、11.65、13.50、510.00、41.00、486.00 μg/mL的混合對照品溶液。

1.2.3 色譜條件 采用Agilent ZORBAX Extend-C18（4.6×250 mm，5 μm）色譜柱，流動相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～3 min，15%→19% A；3～6 min，19% A；6～13 min，19%→21% A；13～14 min，21%→32% A；14～16 min，32%→34% A；16～21 min，34%→37% A；21～23 min，37%→35% A；23～25 min，35%A；25～27 min，35%→40% A；27～30 min，40% A；30～35 min，40%→15% A）；流速0.8 mL/min；檢測波長203 nm（3 種皂苷）和254 nm（7 種黃酮）；柱溫25 ℃；進樣量10 μL。

1.2.4 HPLC 方法學考察

1.2.4.1 系統適應性考察 取“1.2.1”和“1.2.2”項下供試品溶液、混合對照品溶液適量，按“1.2.3”項下色譜條件進樣測定。

(6)采用斜板組模塊間歇式高頻微振，能定期自動清洗斜板組模塊，使斜板上的物料有序下滑，保證斜板板面上不堆積物料，板間不堵塞，從而保證設備長期穩定的工作效能。

1.2.4.2 線性關系考察 精密吸取“1.2.2”項下混合對照品溶液4、8、12、16、20、24 μL[16-17]，按“1.2.3”項下的色譜條件分別進樣測定，記錄10 種成分吸收峰的峰面積，以各化合物的進樣量（μg）為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線。

1.2.4.3 精密度考察 精密吸取混合對照品溶液10 μL，按“1.2.3”項下的色譜條件連續進樣檢測6 次，記錄10 種成分吸收峰的峰面積。

1.2.4.4 穩定性考察 取同一批黃芪莖葉樣品，按“1.2.1”項下方法制備供試品溶液，室溫下于0、4、8、12、18、24 h，按照“1.2.3”項下的色譜條件分別進樣檢測，并記錄10 種成分吸收峰的峰面積。

1.2.4.5 重復性考察 取同批次黃芪莖葉樣品6 份，按“1.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“1.2.3”項下色譜條件進樣檢測，并記錄10 種成分吸收峰的峰面積。

1.2.4.6 加樣回收率考察 精密稱取已知含量的同批次黃芪莖葉樣品粉末適量，按已知樣品含量的50%、100%和150%分別加入混合對照品溶液[18]，按“1.2.1”項下方法制備供試品溶液，然后再按照“1.2.3”項下的色譜條件進行測定，記錄10 種成分吸收峰的峰面積。

1.2.5 不同采收期樣品的含量測定 分別取不同采收期的黃芪莖、葉樣品粉末，按“1.2.1”項下方法制備供試品溶液，每個樣品平行制備三份，然后按“1.2.3”項色譜條件下進樣測定，將各成分峰面積代入相應回歸方程求得成分檢出量a（μg），然后按下式計算該成分的含量（mg/g）。

式中，n 為樣品溶液稀釋倍數；V 為樣品溶液體積，mL；0.01 為檢測時進樣體積，mL；m 為黃芪莖葉樣品取樣量，mg。

1.3 數據處理

各試驗結果均重復3 次取平均值并計算誤差值，采用SPSS 26.0 軟件進行顯著性差異分析和聚類分析，SIMCA 14.0 軟件進行主成分分析，SPSSPRO在線數據分析平臺進行熵權TOPSIS 法分析，采用Origin 2022 軟件繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 HPLC 方法學考察

圖1 混合對照品（A：203 nm；B：254 nm）及黃芪莖葉樣品（C：203 nm；D：254 nm）色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A: 203 nm,B: 254 nm)and sample stems and leaves(C: 203 nm,D: 254 nm)of Astragalus membranaceus

2.1.2 線性關系考察結果 計算出10 種待測成分的回歸方程和線性范圍，結果見表2。10 種成分相關系數均大于0.9990，線性關系良好。

表2 10 種成分的線性回歸方程及其線性范圍Table 2 Linear regression equation and linear range of 10 components

2.1.3 精密度考察結果 分別計算各成分峰面積的RSD 值，結果顯示蘆丁、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、金絲桃苷、槲皮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、山奈酚、大豆皂苷Bb、黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅱ的RSD 值分別為1.19%、0.40%、1.54%、0.86%、0.30%、0.20%、1.30%、1.37%、0.41%、1.64%，均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.1.4 穩定性考察結果 分別計算各成分峰面積的RSD 值，結果顯示蘆丁、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、金絲桃苷、槲皮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、山奈酚、大豆皂苷Bb、黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅱ的RSD 值分別為0.39%、1.28%、0.41%、0.68%、0.23%、0.40%、1.21%、1.08%、0.84%、1.33%，均小于2%，表明供試品在24 h 內穩定性良好。

2.1.5 重復性考察結果 分別計算各成分峰面積的RSD 值，結果顯示蘆丁、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、金絲桃苷、槲皮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、山奈酚、大豆皂苷Bb、黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅱ的RSD 值分別為0.56%、1.63%、0.91%、0.82%、0.83%、1.33%、1.87%、1.95%、0.82%、1.03%，均小于2%，表明實驗重復性良好。

2.1.6 加樣回收率考察結果 計算其加樣回收率和回收率的RSD 值，結果見表3。平均加樣回收率均在98%～101%之間；RSD 值均小于2%，表明所建立的分析方法準確性良好。

表3 加樣回收率試驗結果Table 3 Results of sample recovery rate test

2.2 不同采收期黃芪莖葉樣品活性成分的含量測定

2.2.1 不同采收期黃芪莖樣品活性成分的含量測定不同采收期黃芪莖中10 種成分的含量結果見表4。由表4 可以看出，10 種成分的含量隨不同采收期均有顯著變化（P＜0.05），且大部分成分含量呈先上升后下降的趨勢，其中，蘆丁和山奈酚的含量分別在9 月25 日和8 月25 日達到峰值；毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪皂苷Ⅱ的含量在9 月10 日達到峰值；金絲桃苷、大豆皂苷Bb 和黃芪甲苷的含量在8 月10 日達到峰值。其中山奈酚、金絲桃苷和槲皮苷是黃芪莖中含量較豐富的3 種黃酮類成分，其次為蘆丁和毛蕊異黃酮葡萄糖苷，黃芪甲苷是含量最豐富的皂苷類成分其峰值為11.491±0.140 mg/g。

表4 不同采收期黃芪莖中10 種成分的含量（mg/g）Table 4 Relative contents of 10 components in stems of Astragalus membranaceus at different harvest time (mg/g)

為了更直觀的分析討論上述成分的含量差異，將10 種成分含量歸納為黃酮醇類（蘆丁、金絲桃苷、槲皮苷、山奈酚）、異黃酮類（毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮）、黃酮總量（7 種黃酮）和皂苷總量（3 種皂苷）4 大類，并分別作圖，結果如圖2 所示。由圖2 可知，黃芪莖中皂苷總量在8 月上旬達到最高，之后開始下降；黃酮醇類和黃酮總量在8 月下旬達到最高，9 月之后含量有所下降，黃酮醇類含量變化趨勢和黃酮總量基本保持一致；異黃酮類含量變化波動不明顯。此外，黃芪莖中皂苷總量始終高于黃酮總量，說明莖中含有較豐富的皂苷類成分。

圖2 不同采收期黃芪莖10 種成分含量差異Fig.2 Differences in the contents of 10 components in stems of Astragalus membranaceus at different harvest times

2.2.2 不同采收期黃芪葉樣品活性成分的含量 不同采收期黃芪葉中10 種成分的含量結果見表5。黃芪葉中10 種成分的含量隨不同采收期也均呈顯著變化（P＜0.05），且大部分成分含量整體也呈先上升后下降的趨勢，但達峰期明顯不同于黃芪莖。其中，黃芪甲苷、山奈酚和芒柄花苷的含量分別在9 月25 日、9 月10 日和6 月25 日達到峰值；蘆丁和黃芪皂苷Ⅱ的含量在8 月10 日達到峰值。蘆丁、芒柄花苷和山奈酚是黃芪葉中的優勢黃酮類成分，含量峰值分別為14.679±0.309、4.313±0.680 和3.265±0.016 mg/g；黃芪皂苷Ⅱ是黃芪葉中的優勢皂苷類成分，含量峰值分別為6.435±0.195 mg/g。

表5 不同采收期黃芪葉中10 種成分的含量（mg/g）Table 5 Relative content of 10 components in Astragalus membranaceus leaves at different harvest time (mg/g)

由圖3 可知，黃芪葉中的皂苷總量在6 月下旬之后基本趨于平穩，而黃酮總量在7 月之后保持增加的趨勢，8 月～9 月上旬含量較高；黃酮醇類含量變化趨勢和黃酮總量基本保持一致，而7 月之后異黃酮類含量與黃酮醇類變化趨勢正好相反，這說明黃芪葉中這兩類黃酮類化合物的生物合成代謝過程中可能存在競爭作用。有文獻表明苯丙烷代謝是黃酮類物質生物合成的主要途徑，經柚皮素這一重要中間產物，再分別經黃酮醇支路和異黃酮支路合成異黃酮類和黃酮醇類化合物，其中異黃酮合酶（IFS）是合成異黃酮類的關鍵酶，黃酮醇合酶（FLS）是合成黃酮醇類的關鍵酶[19]。HU 等[20]研究表明黃芪中IFS 基因表達隨著開花期的到來（6～7 月）有所下降，而FLS 的表達有所上升，這說明受關鍵酶活性變化的影響，開花期后黃酮醇支路的合成代謝將活躍于異黃酮支路，本研究所觀察到的7 月之后黃芪莖葉異黃酮類與黃酮醇類含量的相反變化趨勢與其相一致。

圖3 不同采收期黃芪莖10 種成分含量差異Fig.3 Differences in the contents of 10 components in stems of Astragalus membranaceus at different harvest times

2.2.3 黃芪莖和葉樣品活性成分的含量比較 為了進一步比較黃芪不同部位活性成分的含量差異，將黃芪莖和黃芪葉的黃酮總量和皂苷總量作對比圖，如圖4 所示。因10 月黃芪葉枯萎凋落，未采集到10 月的黃芪葉，故而主要對6 月～9 月的兩個部位含量進行了對比。每個采收期黃芪葉中的黃酮總量均高于莖中，兩個部位的黃酮總量均在8 月～9 月上旬同步達到較高水平；對于皂苷總量來說，7 月下旬之前黃芪葉中的含量高于莖中，而進入8 月之后莖中皂苷快速增加并顯著高于葉中。這說明處于生長旺盛期的黃芪葉中黃酮類成分的積累更多，而黃芪莖中更利于積累皂苷類成分，提示兩個部位的合用可同時兼顧這兩類活性成分。

圖4 黃芪莖和葉中黃酮總量（A）和皂苷總量（B）的差異Fig.4 Difference of total flavonoids (A)and saponins (B)in stems and leaves of Astragalus membranaceus

2.3 黃芪莖、葉的系統聚類分析（HCA）

為考察黃芪莖、葉中黃酮和皂苷類成分與采收期之間的相互關系，以10 批不同采收時間的黃芪莖中10 種成分含量和8 批不同采收期的黃芪葉中10 種成分含量為基準，采用系統聚類分析方法，通過組間連接法，以平方歐氏距離作為樣品相似性的判定[14]，分析結果見圖5。以歐式距離10 為臨界點時，10 個采收時間的黃芪莖聚集為2 類，其中6～7 月為一類、8～10 月為第二類，說明6～7 月黃芪莖中的成分與8 月之后的明顯不同。8 個采收時間的黃芪葉聚集為3 類，6 月上旬為一類，6 月下旬和7 月為第二類，8、9 月為第三類，說明8 月前后黃芪葉中的成分有明顯差異。

圖5 黃芪莖（A）、葉（B）樣品聚類分析結果Fig.5 Cluster analysis results of Astragalus stems (A)and leaves (B)samples

2.4 主成分分析（PCA）

為了更直觀的比較不同采收期黃芪莖、葉成分的差異，將不同采收期黃芪莖、葉中10 種成分的三次平行測定含量數據導入SIMCA 14.0 進行主成分分析[21-23]，結果表明黃芪莖前3 個主成分的累積解釋能力參數值R2X 和預測能力參數值Q2分別為0.858 和0.516，即可以用3 個潛在綜合指標來解釋85.80%的總方差，基本能反映出不同采收期黃芪莖的主要特征；黃芪葉前3 個主成分的累積解釋能力參數值R2X 和預測能力參數值Q2分別為0.843 和0.525，即可以用3 個潛在綜合指標來解釋84.30%的總方差，基本能反映出不同采收期黃芪葉的主要特征。從圖6A 所示的PCA 得分圖中可以看出，6、7 月黃芪莖分布在縱軸左側，8、9、10 月分布在縱軸右側，表明8 月前后黃芪莖中成分含量差異較大。同時，因8 月下旬和9 月樣本組間距離較近，表明采自于此階段的黃芪莖中的活性成分含量差異較小。從圖6B 中可以看出，6、7 月黃芪葉分布在縱軸左側，8、9 月分布在縱軸右側，且6 月下旬和7 月樣本分布較為集中，表明6 月下旬和7 月黃芪葉成分含量接近，8 月和9 月黃芪葉樣本組間距離也較小，表明8～9 月黃芪葉的成分組成接近。PCA 分析結果與聚類分析基本一致。分析原因可能與7 月是渾源的最熱月（平均氣溫～22 ℃），而8 月渾源平均氣溫（～20 ℃）開始下降有關，適宜的溫度更利于黃芪這種喜涼植物的生長，使成分積累速度加快[24]。溫度和水分是影響植物生長及其品質形成的兩個重要因素，黃芪的最適生長季溫度為15 ℃[25]，而8 月份渾源的平均氣溫為20 ℃，同時8 月份也是降水高峰期，能有效促進化學成分的合成和積累。

圖6 不同采收期黃芪莖（A）、葉（B）PCA 得分圖Fig.6 PCA scores of stems (A)and leaves (B)of Astragalus membranaceus at different harvest times

2.5 熵權TOPSIS 法分析

為進一步考察黃芪莖葉不同采收期樣品的質量高低，采用SPSSPRO 在線分析軟件對不同采收期黃芪莖、葉進行TOPSIS 法分析。10 個成分指標均為極大型指標，進行正向化處理后，計算正理想解距離（D+）、負理想解距離（D-）和相對貼近度（C），其中相對貼近度值越接近1，表示綜合評價越好[26]，結果見表6。不同采收期黃芪莖質量的綜合評價排序為J5＞J6＞J7＞J8＞J10＞J4＞J9＞J3＞J2＞J1。不同采收期黃芪葉質量的綜合評價排序為Y6＞Y5＞Y3＞Y4＞Y2＞Y1＞Y7＞Y8。可見，黃芪莖在8～9 月的質量較好，黃芪葉在整個8 月的質量最高，綜合考慮黃芪根的采挖時間（9～10 月左右）并結合HCA 和PCA 分析結果，同時兼顧黃芪莖葉的生長規律和產量，建議黃芪莖單獨部位的采收時間為9 月，黃芪葉單獨部位的采收時間為8 月；若作為地上部分的整體利用，建議8 月下旬采收黃芪莖葉較為合適，這樣既可滿足有效成分含量高峰期與產量高峰期一致的原則，同時也可盡量減少對黃芪根部生長的影響。

表6 不同采收期黃芪莖葉熵權TOPSIS 法分析結果Table 6 Analysis results of entropy weight TOPSIS method for stems and leaves of Astragalus membranaceus in different harvesting periods

3 結論

通過建立可用于黃芪莖葉中毛蕊異黃酮葡萄糖苷等7 種黃酮類和黃芪甲苷等3 種皂苷類化合物的HPLC 同步定量測定方法，揭示了這10 種活性成分隨采收期的動態變化規律，化學計量學和統計學方法分析結果表明黃芪莖在8～9 月質量較高，葉在8 月質量較高，因此結合黃芪根部的采挖時間（9～10 月），對黃芪莖、葉單獨部位以及莖葉合用部位的采收時間進行了合理建議。建議黃芪莖單獨部位的采收時間為9 月，黃芪葉單獨部位的采收時間為8 月；若作為地上部分的整體利用，建議8 月下旬采收黃芪莖葉較為合適。后續研究可進一步探討采收期對黃芪莖葉功效的影響，從而為黃芪莖葉的精準利用和有效開發提供理論基礎和科學依據。