谷氨酰胺、姜黃素組方對酒精性胃粘膜損傷的保護作用

陸海霞，徐 瑩，潘美辰，唐天培，趙建云，葛 磊

（杭州娃哈哈集團有限公司，浙江省食品生物工程重點實驗室，浙江杭州 310018）

慢性胃炎在胃病類型中占比排名第一，初期臨床表現上有腹痛、飽脹等，如果不加控制導致病情進一步發展，則會出現出血、穿孔、癌變等并發癥[1-2]。多數慢性胃炎患者都有不同程度的胃粘膜損傷。作為“酒文化”盛行國家，我國由乙醇引發胃粘膜損傷進而演變為慢性胃炎患者不在少數[3]。乙醇具有脂溶性特性，在其進入體內被代謝時，能促進中性粒免疫細胞釋放氧自由基的過程，導致胃黏膜出現組織損傷、微循環障礙、損傷愈合變慢等現象。接著通過呼吸爆發，使上述過程持續反復進行，最終導致胃粘膜損傷[4]。目前用于治療胃粘膜損傷藥物主要為質子泵抑制劑類、組胺H2 受體阻滯劑，作用通路較為單一，且長期使用會出現耐藥性情況。

通過檢索國家市場監督管理總局特殊食品信息查詢平臺注冊保健食品批件數據庫[5]，發現截至2022 年7 月，獲得具有輔助胃粘膜保護功能批件保健食品共計77 個。從使用原料來看，基本都為傳統中藥成分，其中砂仁、蜂膠、黨參、葛根使用率較高，頻率分別20%、17.6%、16.2%和16.2%；從主要功效成分來看，主要是粗多糖、總黃酮和總皂苷，占比分別為33.8%、31.1%和21.6%。整體來看，目前已有產品同質性較高，主要依據傳統中醫藥理論設計。

傳統中藥靶點復雜，作用機制不夠明確，且大多非藥食兩用；而西藥則作用通路較為單一，且長期使用會出現耐藥性情況。因此，從天然原料中尋找具有明確功效原料組方并將其應用于相關產品中，適用范圍更為廣泛。通過查詢文獻、咨詢專家等方式確定谷氨酰胺與姜黃素搭配組方，推測其對由乙醇引發胃粘膜損傷發生有極佳抑制作用。谷氨酰胺能夠增加防御因子粘液分泌，促進粘膜細胞連接緊密，加快上皮細胞修復和生長作用實現胃粘膜保護[6-8]；姜黃素能增加胃粘膜血流量[9-10]、減少胃粘膜氧化應激和炎性因子表達[11-12]，從而減輕胃粘膜損傷。根據國食藥檢保化[2012]107 號《關于印發抗氧化功能評價等9 個保健功能評價方法》中輔助胃粘膜保護功能動物實驗要求，本文驗證谷氨酰胺與姜黃素組方功效，并探索其作用機制，實現組方功效、靶點明確，為今后將其應用于功能食品或保健食品打好理論基石。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SD 大鼠 SPF 級，健康雄性，體質量180～220 g，共50 只，上海斯萊康實驗動物有限責任公司提供，實驗動物許可證號碼：SCK（滬）2017-0005；谷氨酰胺河北力維素科技有限公司提供；姜黃素 河南中大恒源生物科技股份有限公司提供；MDA、NO、GSH-Px、PGE2試劑盒 碧云天生物技術有限公司提供；PCR 引物、逆轉錄酶試劑盒 由蘇州金唯智生物技術有限公司提供。

HistoCore PEARL 自動組織脫水機、HistoCore Arcadia 全自動包埋機、Leica RM2125RTS 手動輪轉式切片機 美國徠卡公司；CX23 生物顯微鏡 日本Olympus 公司；7900HT Fast Real-Time PCR 儀美國ABI 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及給藥 SPF 級SD 大鼠50 只，每組10 只，隨機分配，共5 組，分別為空白組、模型對照組、西咪替丁組（陽性對照組）、高劑量給藥組和低劑量給藥組。給藥方式和劑量：空白組、模型對照組每天口服灌胃生理鹽水10 mL/kg；西咪替丁組灌胃給藥65 mg/kg/d；將谷氨酰胺與姜黃素復配混合灌胃給藥，其中高劑量組給藥谷氨酰胺15 g/kg/d、姜黃素360 mg/kg/d；低劑量組給藥谷氨酰胺2.5 g/kg/d、姜黃素60 mg/kg/d。杭州娃哈哈集團實驗動物中心審查并批準實驗程序（NO：2023010501）。

1.2.2 動物模型建立 根據國食藥檢保化[2012]107 號《關于印發抗氧化功能評價等9 個保健功能評價方法》中輔助胃粘膜保護功能動物實驗要求，大鼠在連續灌胃服藥30 d 后禁食禁水24 h，除正常組大鼠外，其余各組用1 mL/只無水乙醇灌胃，1 h 后用乙醚麻醉，主動脈取血并取胃部。

1.2.3 胃粘膜損傷評分標準 沿胃部大彎處切開，洗凈胃內容物，將胃黏膜展開，用游標卡尺將出血點或出血帶的長寬分別測定，并拍照記錄[13]。觀察等級分評定辦法，見表1。按下列公式計算各組胃黏膜損傷程度：

表1 急性酒精損傷肉眼觀察分標準Table 1 Gross visual scorings of acute alcohol injury

損傷發生率（%）=某組出現出血或潰瘍大鼠數/該組大鼠數×100

損傷積分指數=各組損傷總積分/組動物數量

損傷抑制率（%）=（A-B）/A×100

其中，A、B 分別為模型組與實驗組的損傷總積分。

1.2.4 病理組織學觀察 根據官方動物評價方法對胃粘膜損傷進行評分后，取損傷嚴重相同部位組織固定于10%甲醛溶液制備成切片，將所制切片脫臘之后，嚴格按照H&E 染色說明書進行染色操作，采用生物顯微鏡觀察各組胃粘膜組織情況。

1.2.5 大鼠血清MDA、GSH-Px、NO 水平 乙醚麻醉后，主動脈取血，將所取主動脈血液充分靜置，兩次離心后，取澄清上清液。按照試劑盒說明書操作流程測定各組大鼠血清MDA、NO 含量以及GSH-Px活力[14-15]。

1.2.6 大鼠胃粘膜組織中PGE2含量 取損傷嚴重部位大鼠胃粘膜經過組織研磨、充分靜置、離心后得組織上清液，按ELISA 試劑盒操作方法測定胃粘膜組織中PGE2含量[16]。

1.2.7 大鼠胃粘膜組織抗氧化相關基因表達水平分析 采用Trizol 法提取胃粘膜組織總RNA[17-18]，嚴格按照逆轉錄酶試劑盒（MultiScribe Reverse Transcriptase；Applied Biosystems）說明書進行操作。首先，使用One-drop 測定樣品在260 nm 和280 nm處RNA 的純度和濃度，樣品的純度即A260/A280的比值在1.8～2.0 之間表示為純的RNA。其次，將RNA 逆轉錄成cDNA。然后將cDNA、引物和SYBR Green Master Mix 充分混合至均勻，使用實時熒光定量PCR 擴增并檢測熒光強度，基因擴增程序如下：95 ℃，5 min 循環1 次；按照高溫變性95 ℃，20 s；低溫退火60 ℃，30 s，適溫延伸72 ℃，20 s，循環45次，72 ℃終末延伸2 min。最后以β-actin 作為參照基因，采用2-ΔΔCt方式計算四個基因相對表達水平[19]。實驗所用基因引物的引物序列見表2[20-21]。

表2 RT-PCR 引物序列Table 2 Primers used in Real-time PCR

1.3 數據處理

統計學處理結果采用平均值±標準差（mean±SE）表示。用SPSS 26.0 軟件進行統計學分析，P＜0.05 表明差異具有統計學意義。采用Origin 2019軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 胃粘膜損傷評價結果

參照官方輔助胃粘膜保護功能評價方法對胃粘膜表面損傷評價，更客觀展現胃粘膜損傷情況。各組胃粘膜組織損傷結果如表3 所示。可以看出，無水乙醇造模，模型組損傷發生率為100%，顯示造模成功。與模型組相比，西米替丁組和高劑量給藥組SD 大鼠損傷積分顯著降低（P＜0.01），低劑量給藥組無差異。從損傷抑制率來看，高劑量給藥組抑制作用最為明顯，達到75%。結果表明西米替丁組、高劑量給藥組都具有較好改善無水乙醇導致的胃粘膜損傷作用，且高劑量給藥組效果更好。

表3 胃粘膜損傷評價（n=10）Table 3 Evaluation of gastric mucosal injury (n=10)

2.2 胃粘膜組織病理學檢查結果

胃粘膜組織細胞是胃的天然保護屏障，即可以發揮胃保護作用又具有吸收功能[22]。通過H&E 染色法觀察大鼠胃黏膜情況（圖1）。空白組大鼠胃粘膜組織結構完整且邊界清晰（圖1A）；模型對照組大鼠胃黏膜組織細胞可見明顯壞死、排列松散、結構不完整現象（圖1B）。與模型對照組相較，西米替丁組與不同劑量的給藥組中胃粘膜形態結構較為完整，排列相對整齊有規則，胃黏膜受損癥狀皆有所減輕（圖1C），且給藥組中高劑量給藥組大鼠胃黏膜病理性損傷明顯較輕。因此，組方可以幫助胃粘膜組織抵御乙醇帶來的損傷，幫助胃粘膜組織細胞更好發揮屏障作用[23-24]（圖1D，圖1E）。

圖1 胃粘膜組織H&E 染色結果（40×）Fig.1 Results of H&E staining of gastric mucosal tissue (40×)

2.3 大鼠血清MDA、GSH-Px、NO 水平變化

GSH-Px、NO、MDA 是反映組織器官氧化應激損傷的重要指標，NO、MDA 升高顯示氧化應激損傷發生和加重，GSH-Px 活性降低意味著在受到氧化應激損傷后，胃粘膜組織細胞自我調節能力下降[13]。從表4 大鼠血清檢測結果可以發現模型對照組大鼠血清中GSH-PX活性較正常組有明顯下降，MDA 和NO 水平均有明顯上升（P＜0.01），表明乙醇對胃黏膜的損傷與氧自由基有關。各給藥組較模型對照組均能顯著改善GSH-PX活性，降低MDA，NO 水平（P＜0.05），且高劑量組作用更顯著（P＜0.01）。因此，可以看出，組方改善了由乙醇引起的胃粘膜組織氧化應激損傷，增強了組織細胞自我調節能力[25-26]。

表4 各組大鼠血清中MDA、GSH-Px 和NO 水平變化（n=10）Table 4 Changes of MDA,GSH-PX and NO levels in serum of rats in each group (n=10)

2.4 大鼠胃粘膜組織中PGE2 含量變化

PGE2是避免胃粘膜損傷無可替代的保護因子[27-28]。檢測結果表明，與空白組相比，通過無水乙醇造模后，模型對照組大鼠胃粘膜組織中PGE2水平極顯著降低（P＜0.01）。各給藥組與模型對照組相比，PGE2含量水平明顯提高，高劑量組作用更顯著（P＜0.01）（表5），表明組方對胃黏膜組織的保護作用可通過提高PGE2水平而發揮作用。

表5 各組大鼠胃粘膜組織PGE2 水平（n=10）Table 5 PGE2 levels in gastric mucosal tissue of rats in each group (n=10)

2.5 大鼠胃粘膜組織中抗氧化相關基因表達水平變化

KEAP1-Nrf2-ARE 是細胞內重要的抗氧化信號通路，機體的氧化應激激發NRF2/ARE 信號通路的活化，使Nrf2 與KEAP1 解偶聯，活化的Nrf2 與ARE結合，刺激下游抗氧化酶相關基因（HO-1 與NQO1）的表達。GSK-3β作為糖原合成激酶，通過推進Nrf2 磷酸化降解過程，對下游抗氧化酶的表達進行抑制[29-30]。實驗結果表明，各給藥組與模型對照組相比，均可提升Nrf2、HO-1 和NQO1 的基因表達水平（P＜0.05），抑制GSK-3β的表達（P＜0.05），其中高劑量組給藥效果極顯著（P＜0.01）（圖2）。由此推測，組方保護酒精性胃黏膜損傷的作用與KEAP1-Nrf2-ARE 信號通路有關。

圖2 胃抗氧化相關基因mRNA 表達水平Fig.2 mRNA expression levels of gastric antioxidant related genes

3 結論

本實驗通過建立SD 大鼠酒精性胃黏膜損傷模型，探究谷氨酰胺與姜黃素組方對胃粘膜損傷的保護作用。高劑量的谷氨酰胺和姜黃素組方灌胃SD 大鼠后，在一定程度上降低了大鼠胃粘膜損傷積分指數，改善了大鼠胃黏膜組織病理損傷現象。同時，高劑量的谷氨酰胺和姜黃素組方使大鼠血清中的MDA 含量得到了顯著降低（P＜0.01），GSH-Px 的酶活性、NO 含量和胃粘膜組織中PGE2水平均有顯著提高（P＜0.05），對酒精性胃粘膜損傷起到了保護作用。同時可以上調大鼠胃粘膜組織中抗氧化相關基因Nrf2、HO-1 及NQO1 的mRNA 相對表達水平（P＜0.05），下調了抑制抗氧化通路相關基因GSK-3β的mRNA 相對表達水平（P＜0.05），增強胃粘膜組織的抗氧化能力。

綜合以上結果，谷氨酰胺和姜黃素組方具有抑制乙醇所致胃粘膜損傷的作用，其作用機制推測與調節抗氧化通路關鍵因子的基因表達，進而減輕氧化應激反應有關。雖然目前已有部分文獻報道單一成分的谷氨酰胺或姜黃素具有修復胃粘膜損傷的功效，但是關于谷氨酰胺和姜黃素聯用的組方對修復胃粘膜的文獻少之又少，所以需要對其修復胃粘膜的機制進行深入研究。本研究闡明了谷氨酰胺和姜黃素組方對胃粘膜損傷的保護作用，為把其開發為安全有效的治療酒精性胃粘膜損傷疾病的功能食品和保健食品提供了理論支持。