10 種特級醬油香氣差異分析

史伊格，蒲丹丹，勇倩倩，黃實寬，陳洪衛，張玉玉,*

（1.中原食品實驗室，北京工商大學，北京 100048；2.中國商業聯合會味科學重點實驗室，北京工商大學，北京 100048；3.煙臺欣和企業食品有限公司，山東煙臺 264006）

醬油是以大豆和/或脫脂大豆、小麥和/或小麥粉和/或麥麩等為主要原材料，經過微生物發酵制成的液體調味品[1]，在我國已有3000 多年的歷史。醬油的香氣已經被研究了100 多年，檢測出1000 多種芳香化合物，包括醇類、醛類、酯類、酸類、吡嗪類、呋喃類、酮類、酚類、烷烴類等化合物，為醬油貢獻醇香、麥芽、焦糖、煙熏、花和水果等香氣[2]。氨基酸態氮是醬油發酵過程中的主要產物，是醬油鮮味的主要來源，也是衡量醬油品質的重要標準。國標規定，特級醬油可溶性無鹽固形物≥15 g/100 mL，全氮≥1.5 g/100 mL，氨基酸態氮含量≥0.8 g/100 mL[3]。作為調味品，醬油香氣的好壞是衡量其質量的重要指標，同樣也是影響消費者是否購買的關鍵要素。特級醬油具有濃郁的醬香，鮮美醇厚，深受消費者喜愛。但各地消費者的生活習慣和對食品的口味要求不同，醬油也相應具有一定的地域性。明確特級醬油的風味組成、特級醬油之間的風味差異以及特級醬油與其他醬油的風味差異，有利于特級醬油風味品質的控制以及從香氣感知角度建立品質區分模型。然而對于特級醬油間的風味差異分析還較少，所以明確特級醬油間的香氣特征差異是當前急需解決的行業問題。

目前，氣相色譜-串聯質譜（Gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）是檢測醬油中的芳香化合物的常用檢測方法。液液萃取結合溶劑輔助風味成分蒸發（Solvent assistant flavor evaporation，SAFE）萃取是常用的揮發性成分分離富集方法，該方法制備的芳香提取物具有更為自然的香氣特征，Wang等[4]采用SAFE 萃取法在醬油中共檢測出55 種FD 因子＞8 的關鍵氣味活性化合物。然而，SAFE 耗時費力，并且使用大量有毒有機溶劑[5]。還可以采用其他提取方法，如攪拌棒吸附萃取（Stir bar sorptive extraction，SBSE）[6]、同時蒸餾萃取（Simultaneous distillation extraction，SDE）[7]、固相微萃取（Solidphase microextraction，SPME）和固相萃取（Solidphase extraction，SPE）等。在醬油中，SBSE 捕獲了更多較難揮發的化合物，包括乙酸苯乙酯和肉桂酸乙酯等[6]。Feng 等[7]采用SDE 方法檢測到醬油中26 種香氣活性化合物。SPME 是近年來提出的所有技術中最流行的。該方法不需要有機溶劑，速度快，操作簡單，成本低。SPE 可以將樣品提取、濃縮和純化集成在一個SPE 筒中，具有操作簡單、溶劑消耗少、易于標準化和重復性良好等優點，可以分離鑒定出更多的酯、醇和高沸點化合物[7]，對酸的干擾也更少[8]。

當前市場醬油種類豐富多樣，不同品牌間感官品質差異明顯，通過研究不同醬油間的風味差異有利于從分子角度闡明其關鍵呈香物質及其對香氣特征的貢獻，為醬油品質控制和品質提升提供科學依據。因此，本文選取10 種不同品牌的高鹽稀態發酵特級醬油作為樣品，結合SPME 和SPE 兩種萃取方法提取醬油中香氣化合物，并通過GC-MS 對特級醬油香氣化合物進行鑒定。通過對揮發性香氣物質定量分析和香氣化合物的香氣活性值（Odor activity values，OAV）計算，對比不同香氣化合物對醬油香氣的貢獻，隨后進一步對香氣活性化合物進行偏最小二乘回歸分析（Partial least squares regression，PLSR），確定特級醬油香氣化合物與香氣屬性的相關性，明確不同醬油之間的差異組分及其貢獻，旨在為特級醬油生產過程中香氣的調控及產品工藝改進提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

特級醬油 北方市場銷售量較高的10 種，均購買于網上商城。10 種醬油的簡稱、品牌信息以及主要原料和配料如表1 所示；二氯甲烷（99.9%）、甲醇（99.9%）色譜級，默克化學公司（中國上海）；2-甲基-3-庚酮（99%）、5-乙基-4-羥基-2-甲基-3（2H）呋喃酮（≥98%）分析級，麥克林生化公司（中國上海）；2,5-二甲基-4-羥基-3（2H）-呋喃酮（≥98%）分析級，Sigma-Aldrich（德國斯坦海姆）；乙酸乙酯（分析級）、4-乙基-2-甲氧基苯酚、C6～C28 正鏈烷烴混合物標準（≥97%）色譜級，Sigma（中國，上海）；無水硫酸鈉（99.9%）分析級，國藥集團化學試劑有限公司（中國北京）；54 種香氣輪廓 法國Le Nez duVin?；高純氦氣（99.999%）北京雙泉天緣工業氣體有限公司。

表1 10 種特級醬油品牌信息及其原理和配料Table 1 Information on 10 brands of extra soy sauce and their principles and ingredients

8890 GC-5977B GC/MSD 氣相色譜-質譜聯用儀配置三合一自動進樣器、固相微萃取萃取頭（85 μm CRA/PDMS）、LiChrolut EN 固相萃取小柱 安捷倫科技有限公司；T-403 電子分析天平 北京天林恒泰科技有限公司；EYELAN-1100 旋轉蒸發儀 東京理化器械株式會社；BF2000 氮吹儀 北京八方世紀科技有限公司；CYLDZ-6 分液漏斗立式搖床 北京國環高科自動化技術研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 頂空固相微萃取（HS-SPME）香氣成分萃取將4 mL 醬油樣品移入20 mL SPME 專用樣品瓶，加入0.70 g NaCl。樣品在45 ℃水浴中加熱平衡20 min。隨后在相同溫度下采用萃取頭進行頂空萃取40 min。萃取頭使用前250 ℃ 解析10 min，采用脈沖不分流模 式[9]。添加10 μL 2-甲基-3-庚酮（0.10 mg/mL，溶劑為甲醇）。所有樣品重復三次。

1.2.2 固相萃取（SPE）香氣成分萃取 取30 mL 醬油以1:1.5 比例用45 mL 二氯甲烷進行液液萃取。加入30 μL 混合內標（2-辛醇，5.00 mg/mL；1,2-二氯苯，5.40 mg/mL；2-甲基-3-庚酮，4.60 mg/mL；2-十一烷酮，4.00 mg/mL）于分液漏斗內，以290 次/min 的速率萃取10 min。重復以上步驟2 次。加入無水硫酸鈉于-18℃冷凍過夜除水。25 ℃ 旋蒸濃縮至約3～5 mL，然后先將SPE 小柱分別用10 mL 甲醇和去離子水活化。將濃縮提取物以2 mL/min 的速度通過LiChrolut EN 小柱，3 mL 二氯甲烷洗脫樣品[10]。隨后，將洗脫下的液體過0.22 μm 有機濾膜到分析瓶中，氮吹濃縮至1 mL。最后，對濃縮提取物進行揮發性成分分析。所有樣品重復三次。

1.2.3 感官評價 從實驗室招募了8 名無鼻炎、嗅覺正常的感官評價小組成員，評價人員都有一定的感官評價經驗，且熟悉定量描述性感官評價方法（Quantitative discriptive analysis，QDA）。首先讓評價人員熟悉并識別54 種香氣輪廓（Le Nez duVin?），隨后通過對隨機呈遞的不同香氣特征樣品進行評價訓練，能夠正確識別隨機樣品香氣特征的評價人員進行醬油樣品評價環節[10]。通過感官描述詞的頻率統計結果和評價小組討論，確定醬油的7 種香氣特征：醬香、焦糖香、煙熏香、烤土豆香、麥芽香、醇香、酸香。在25 ℃條件下，將10 種特級醬油裝在無味的透明塑料瓶中（10 mL），并對塑料瓶隨機編碼3 位數字。要求評價人員將7 個給定香氣輪廓進行強度打分（1～3，微弱；4～6，中等；7～9，較強）。

1.2.4 GC-MS 分析條件

1.2.4.1 GC 條件 色譜柱：DB-WAX 石英毛細柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：起始溫度為35 ℃保持1 min，以4 ℃/min 速率上升到100 ℃后保持1 min；2 ℃/min 速率上升至170 ℃后保持1 min；5 ℃/min 速率上升至220 ℃后，保持1 min；載氣（He，99.999%）流速1.00 mL/min，壓力2.4 kPa，SPME 采取脈沖不分流，SPE 分流比為20:1，進樣量1 μL。

1.2.4.2 MS 條件 質譜條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度250 ℃；離子源溫度250 ℃；質量掃描范圍m/z 35～550；掃描模式為全掃描；調諧文件為標準調諧。

1.2.4.3 定性定量分析 定性定量方法：GC-MS 數據比對NIST 20 數據庫進行檢索。化合物的定性采用比較MS 數據庫、保留指數（Retention index，RI）、標準品。RI 計算公式如下，在相同的色譜條件下，以正構烷烴（C6～C28）的保留時間為標準，計算各化合物的RI 值。

式中：t（x）為化合物x 的保留時間；n 為化合物x 保留時間前出峰的正構烷烴碳原子個數；t（i）和t（i+1）分別為具有i 和i+1 個碳原子的正構烷烴的保留時間。

定量分析：SPME 分析的樣品以2-甲基-3-庚酮為內標，SPE 分析的樣品通過混合內標分析，通過色譜峰面積比較，計算出未知香氣活性化合物的含量[11]。

OAV 計算方法：揮發性香氣物質的含量與其水中閾值的比值[9,12-13]，其中OAV≥1 的物質被認為是能夠被人感知的香氣活性化合物，對樣品的香氣感知有重要貢獻，且OAV 值越高貢獻越大。

1.3 數據處理

采用 Microsoft Excel 2021 統計香氣化合物和香氣輪廓，采用Origin Pro 2021（OriginLab Corporation，美國）制圖得到 QDA 曲線。香氣物質與香氣輪廓的相關性分析采用XLstat 2018（Addinsoft，紐約，美國）進行偏最小二乘分析（PLSR），其中X 變量為香氣物質（OAV≥1），Y 變量為香氣輪廓的強度。顯著性分析（P＜ 0.05）采用SPSS 17.0 軟件分析（Duncan test）。

2 結果與分析

2.1 10 種特級醬油感官評價結果

招募的8 名感官評價人員能夠區分54 種香氣特征，并且對隨機取出的香氣成分能夠準確地描述其香氣特征和與之相關的食品。在預實驗中對隨機編號樣品打分的感官評價數據標準偏差在20%以內，符合感官評價人員的篩選標準[13]。QDA 分析結果如圖1 所示，在所有樣品中醬香的香氣強度最大，其次是煙熏香、酸香、醇香、焦糖香和麥芽香，烤香整體強度最弱。XH1 醬油的醬香和醇香的強度最強；XH2 醬油的麥芽香氣最強；WZ 醬油的焦甜香和煙熏香最強，且醇香強度與XH1 一致；LJJ1 醬油的酸香最強；QH 醬油的烤香最強，麥芽香和醇香最弱；CB 醬油的醬香和焦糖香最弱；LJJ2 醬油的煙熏香最弱；LH 的烤香最弱；XH2 和HT2 醬油的酸香最弱。

圖1 10 種特級醬油感官評價結果Fig.1 Sensory evaluation results of 10 brands of premium soy sauce

2.2 10 種特級醬油揮發性香氣物質分析

10 種醬油共檢測86 種揮發性香氣化合物，各物質含量測定結果如表2 所示。CB 醬油中吡嗪類物質含量最高，為182.796 μg/L，其中2,6-二甲基吡嗪為66.256 μg/L。該結果與感官評價結果一致，即CB 醬油的烤香最強。吡嗪類化合物在發酵過程中通過緩慢的美拉德反應和加熱滅菌過程中產生，其濃度受許多因素影響，如發酵溫度和滅菌條件等[14]。此外，吡嗪化合物是酵母提取物中的重要氣味成分[15-17]，10 種醬油配料中均添加了酵母抽提物，因此，醬油樣品中的吡嗪化合物也可能來源于原料中的酵母提取物。添加酵母抽提物可以改善醬油的風味[18-20]，在醬油發酵前期添加可增強醬油的麥芽、焦糖和花果香氣；中、后期添加酵母抽提物，酯類、醛類和醇類等物質濃度下降[21]；直接添加到成品醬油中，可在增強醬油增鮮的同時去除醬油中的豆腥味[22]。

XH1 醬油中乙酸（28657.455 μg/L）含量最高。醬油中的酸味主要由乙酸引起，來源于乳酸菌發酵[15]。其酚類物含量最高（47356.009 μg/L），其中4-乙基-2-甲氧基苯酚（18240.479 μg/L）含量為所有樣品中最高。酚類化合物是由曲（發酵劑）在發酵過程中產生的羥基肉桂酸和羥基苯甲酸形成[23]。WZ 醬油的酚類化合物種類最多，該結果與感官評價結果對應，即WZ 和XH1 醬油的煙熏香強度最高。酮類化合物主要來源于美拉德反應，其中LH 醬油的酮類化合物含量最高（19135.535 μg/L），與其具有最強的焦甜香一致。

除了酚類化合物，XH1 醬油中酯類化合物（13986.445 μg/L）含量也較高，乙酸乙酯含量為199.011 μg/L。酯類化合物通常由醇和酸的酯化反應產生。酯類與酵母代謝脂質同樣有關，主要在發酵的中間階段積累[24]。高分子量脂肪酸酯也存在于醬油中，由長鏈脂肪酸在真菌脂肪酶存在下經過長時間恒溫發酵后生成[25]。

XH1 醬油醇類化合物含量最高（146664.28 μg/L），顯著高于其他樣品，且與感官評價中醇香強度最強結果一致。CB 醬油中醇含量最少為33305.645 μg/L，該差異源于不同發酵方法及原料差異[26]。LH 醬油異丁醇（51.223 μg/L）和2,3-丁二醇（57921.798 μg/L）含量在所檢測樣品中均為最高。在好氧條件下的發酵階段，雜醇主要可以由糖和支鏈或芳香族氨基酸產生[27]。乙醇是醬油發酵過程中葡萄糖與氨基酸通過Ehrlich 途徑與α-酮酸脫羧等多種途徑生成[28]。2/3-甲基丁醛是貢獻麥芽香的關鍵成分[11-12]，其中XH2醬油中的3-甲基丁醛含量最高（4.012 μg/L），該結果與感官評價結果一致，即XH2 醬油的麥芽香氣最強。CB 醬油中香氣化合物種類最少共檢測到62種，XH1 醬油中的香氣化合物種類最多為75 種，該結果與感官評價結果一致，CB 醬油的整體香氣輪廓強度較弱。

2.3 PLSR 分析結果與感官評價結果

化學計量學可將食品的感官品質、物理化學性質、工藝參數與風味物成分和含量等參數進行關聯分析，為感官科學和風味分析的融合發展起到了重要的作用[29-30]。采用偏最小二乘分析（PLSR）不同特級醬油中的香氣物質與香氣輪廓之間的相關性，結果如圖2 所示。PLSR 分析的結果顯示第一主成分（Dim 1）的解釋變量為38.4%，預測變量為20.2%；第二主成分（Dim 2）的解釋變量為56.4%，預測變量為38.8%，說明了該 PLS 預測模型的可靠性。

圖2 10 種特級醬油香氣物質與香氣輪廓的偏最小二乘相關性模型分析Fig.2 Correlation matrix of the aroma compounds to the aroma attributes among 10 brands of premium soy sauces

由圖2 可知，PLSR 分析分將 10 種不同的特級醬油樣品分成了三組，CB 醬油為一組，LJJ1 醬油、QH 醬油、HT1 醬油、LH 醬油、XH2 醬油、LJJ2 醬油、WZ 醬油和HT2 醬油為一組；XH1 醬油為一組。PLSR 結果表明，CB 醬油與其他醬油有較大區分，這與GC-MS 結果相同。根據PLSR 結果顯示，共有15 個香氣物質的 VIP 值在三個主成分中均大于0.7，說明它們與特級醬油中醬香、醇香、酸香、煙熏香、焦糖香、烤香和麥芽香顯著相關（P＜0.05）。根據化合物與感官屬性的相關系數結果（圖3）可知，3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、壬醛、糠醇、苯甲醛、4-乙基-2-甲氧基苯酚、4-乙基苯酚等物質與醬香呈顯著（P＜0.05）正相關；壬醛、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪和2,3-丁二醇等與煙熏香呈顯著（P＜0.05）正相關；3-羥基-2-丁酮、甲基麥芽酚和4-甲氧基-2,5-二甲基-3（2H）-呋喃酮等與焦糖香呈顯著（P＜0.05）正相關；3-羥基-2-丁酮、乙酸乙酯和苯甲醛等化合物與麥芽香呈顯著（P＜0.05）正相關。

圖3 10 種特級醬油中15 種香氣活性化合物與香氣屬性的相關系數熱圖Fig.3 Heat map of correlation coefficients of 15 aroma-active compounds to the aroma attributes

2.4 10 種特級醬油香氣物質的香氣活性值分析

揮發性香氣化合物對醬油的貢獻可以通過OAV 進行評價。為了進一步評估揮發性香氣化合物對醬油整體香氣的貢獻，對其OAV 進行計算，結果見表3。從10 中特級醬油中共發現30 種OAV≥1的揮發性香氣化合物，包括乙酸乙酯、5-乙基-4-羥基-2-甲基-3（2H）-呋喃酮、二甲基三硫、愈創木酚等。吡嗪類化合物多具有烤香及可可香，其中3-乙基-2,5-甲基吡嗪OAV 最大（OAV=0～20），XH1 醬油最高。焦糖香是構成醬油整體風味的關鍵[2,6]。5-乙基-4-羥基-2-甲基-3（2H）-呋喃酮賦予醬油強烈的甜香、焦糖、面包香氣，其OAV 為373～4698。HT1 醬油中5-乙基-4-羥基-2-甲基-3（2H）-呋喃酮OAV 最高。除了呋喃類化合物，甲基麥芽酚（2～18）也會產生焦糖樣香氣，甲基麥芽酚由糖在加熱過程中通過2,3-烯醇化或直接由Amadori 重排形成，存在于蒸熟大豆中[31]。WZ 醬油中甲基麥芽酚OAV 最高，賦予其較強烈的焦糖香。3-甲基丁醛（0～4）具有麥芽香，XH2 中3-甲基丁醛OAV 最高，這與感官評價結果相同。愈創木酚（2～22）具有典型的煙熏香氣[7]，4-乙基愈創木酚（3～204）和4-乙基苯酚（0～2）同樣具有煙熏香，它們的OAV 均大于1。在其他實驗中，添加了酵母抽提物的醬油樣品4-乙基-2-甲氧基苯酚和4-乙基苯酚含量高于不添加酵母抽提物的樣品[27]。3-甲硫基丙醛（0～10）具有熟土豆香氣，盡管其以低濃度存在，但它正鼻氣味閾值很低，OAV 較大[32]，這與之前的實驗結果相同[4]。HT1 醬油中3-甲硫基丙醛OAV 最大。3-甲硫基丙醛在Strecker 降解和發酵過程中產生[33]，在熱滅菌或烹飪過程中也會大量產生，這會增加熟土豆類氣味的強度[34]，3-甲硫基丙醇同樣有助于醬油中熟土豆的香氣[12]。其他含硫化合物，包括二甲基三硫（0～226）具有熟洋蔥香氣，也具有較高OAV。酯類化合物通常具有果香，果香和花香使醬油香氣更加飽滿和諧[35-36]。其中乙酸乙酯（1～2）是醬油中典型的果香化合物[37-40]。1-辛烯-3-醇具有蘑菇的香氣，是米曲霉孢子的特征性揮發性成分。醬油的發酵過程中采用了米曲霉作為主要的發酵菌種，可以推測1-辛烯-3-醇可能主要來源于大曲發酵階段[39]。

表3 10 種特級醬油樣品中風味物質的香氣活性值Table 3 Aroma activity values of aroma-active compounds in 10 brands of premium soy sauces

結合PLSR 分析與OAV 分析發現，乙酸乙酯、3-羥基-2-丁酮、2,3-丁二醇、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、4-甲氧基-2,5-二甲基-3（2H）-呋喃酮、4-乙基愈創木酚和4-乙基苯酚是造成不同品牌特級醬油香氣輪廓差異的關鍵香氣成分。而3-甲基丁醛、3-甲硫基丙醛、二甲基三硫、5-乙基-4-羥基-2-甲基-3（2H）-呋喃酮和愈創木酚是對不同品牌特級醬油香氣輪廓均具有重要貢獻的共性成分。

3 結論

感官評價結果顯示，特級醬油具有較為強烈的醬香、煙熏香和酸香，其中WZ 和XH1 醬油的醬香、焦糖、煙熏、醇香最強，LJJ1 的酸香最強、XH2醬油的麥芽香最強，QH 和HT1 醬油的烤香最強，該結果與香氣化合物的種類和含量具有相關性。10 種特級醬油中共鑒定出86 種揮發性化合物，CB 醬油中吡嗪類物質含量最高，其中2,6-二甲基吡嗪為66.256 μg/L。XH1 醬油中酚類物含量最高，其中4-乙基-2-甲氧基苯酚為18240.479 μg/L。除了酚類化合物，XH1 醬油同樣含有較高濃度的酯類化合物，乙酸乙酯含量為199.011 μg/L。XH2 醬油具有最高的3-甲基丁醛（4.012 μg/L），呈現較強的麥芽香氣。LH 醬油中異丁醇（51.223 μg/L）和2,3-丁二醇（57921.798 μg/L）含量在所檢測樣品中均為最高。WZ 醬油的酚類化合物種類最多，與其煙熏香強度最高一致。XH1 乙醇含量最高，為147.257 μg/L。香氣活性值計算結果顯示，共30 種香氣活性成分（OAV≥1）對特級醬油的香氣貢獻較大，其中14 種為10 種醬油中共有成分，如乙酸乙酯、5-乙基-4-羥基-2-甲基-3（2H）-呋喃酮等。結合OAV 分析和PLSR 回歸分析，乙酸乙酯、3-羥基-2-丁酮、2,3-丁二醇、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、4-甲氧基-2,5-二甲基-3（2H）-呋喃酮、4-乙基愈創木酚和4-乙基苯酚是造成不同品牌特級醬油香氣輪廓差異的關鍵香氣成分。