不同結構褐藻膠寡糖的制備與功效研究進展

黃友濤，梁青平，高筱雅，李東鈺，牟海津

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003）

褐藻膠是一種廣泛存在于褐藻細胞壁中的多糖，占其干質量的22%～44%[1]，同時也存在于固氮菌（Azotobactersp.）和假單胞菌（Pseudomonassp.）的細菌生物膜中[2-3]。褐藻膠由β-D-甘露糖醛酸（mannuronic acid，M）及其C5差向異構體α-L-古羅糖醛酸（guluronic acid，G）兩種糖醛酸單體（圖1）通過1,4糖苷鍵隨機聚合形成。根據糖醛酸單體聚合的差異，分為均聚甘露糖醛酸（poly mannuronic acid，PM）、均聚古羅糖醛酸（poly guluronic acid，PG）以及由甘露糖醛酸和古羅糖醛酸隨機聚合的片段（poly mannuronic acid and guluronic acid，PMG）[4]。褐藻膠具有良好的凝膠性能，在食品行業中通常用作穩定劑和增稠劑[5]，此外褐藻膠還是一種膳食纖維，可以緩解不健康飲食習慣引起的代謝紊亂[6]。

圖1 褐藻膠單體結構Fig.1 Structures of alginate monomers

褐藻膠的降解產物褐藻膠寡糖（alginateoligosaccharides，AOS）是一種聚合度（degree of polymerization，DP）為2～25的直鏈寡糖[7-8]。如圖2所示，根據糖醛酸組成的不同，AOS分為甘露糖醛酸寡糖（mannuronic acid oligosaccharides，MAOS）、古羅糖醛酸寡糖（guluronic acid oligosaccharides，GAOS）和雜合糖醛酸寡糖（heterozygous acid oligosaccharides，HAOS）[9]。MAOS和GAOS都是由單一糖醛酸組成的寡糖，而HAOS根據β-D-甘露糖醛酸與α-L-古羅糖醛酸比例（M/G）的不同結構有所差異。常見的AOS制備方法有化學法、物理法和生物法，不同方法所制備的AOS結構有所差異，AOS結構的多樣性和復雜性賦予了其多種生物活性[8]，包括抗氧化[10]、免疫調節[11]、抗菌[12]、抗炎活性[13]等，因此AOS在食品、醫藥和綠色農業等領域具有廣泛的應用。由于褐藻膠的分子質量高、黏度大、生物利用率低等特性限制了其更深入的應用和開發，將褐藻膠降解為功能性寡糖能提高其應用價值[7]，同時近年來對AOS的研究熱度呈現上升趨勢[14]，所以通過合適的方法制備AOS對于相關研究至關重要。本文主要從AOS的制備方法和構效關系兩個方面，系統闡述不同制備方法降解褐藻膠的機理以及所獲得AOS的結構特征，并進一步深入解析AOS結構差異與所發揮功效之間的潛在關系，以期為AOS的研發與精準應用提供重要的理論支撐。

圖2 AOS分類Fig.2 Classification of AOS

1 AOS制備方法

AOS的活性受其糖醛酸組成和DP的影響，不同制備方法所獲得的AOS結構差異較大，所以探究不同制備方法的機理和所得產物的結構對AOS的后續活性研究極為重要。AOS的制備方法主要有有機合成法和降解褐藻膠法。如圖3所示，有機合成法是以L-抗壞血酸為前體，通過化學反應使其分別變成L-古羅吡喃糖基三氯乙酰亞胺酯和1,6-內醚-2,3-二-O-芐基-β-L-古羅吡喃糖。然后，以L-古羅吡喃糖基三氯乙酰亞胺酯作為起始物，1,6-內醚-2,3-二-O-芐基-β-L-古羅吡喃糖作為延伸物，按照非還原端到還原端的順序制備得到AOS[15]。降解褐藻膠法是采用化學法、物理法和生物法，將褐藻膠的糖苷鍵斷裂，從而得到小分子的AOS。與有機合成法相比，降解褐藻膠法更易操作、成本較低，是目前最常用的制備AOS方法。本節將重點總結降解褐藻膠法的作用機理和特點。

圖3 有機合成法制備AOS的過程Fig.3 Preparation of AOS by organic synthesis method

1.1 化學法

化學法是一種傳統制備AOS的方法，主要包括酸解法、堿解法以及氧化降解法，其原理是通過化學試劑將褐藻膠降解為低分子質量的AOS片段（圖4），該方法操作簡單、成本較低，但是反應過程不易控制、產物分子質量分布較廣，且副產物較多，使AOS分離純化困難。

圖4 化學法制備AOS的過程Fig.4 Preparation of AOS by chemical degradation methods

酸解法的主要特征是對多糖鏈的隨機降解，并產生己糖醛酸殘基未被修飾的AOS片段（圖4A）。通常采用的酸有鹽酸、甲酸等，其中鹽酸是較早用來降解褐藻膠的酸。張洪榮等[16]用鹽酸酸解褐藻膠溶液，制備得到DP為2～6的GAOS和MAOS。Chandia等[17]在100 ℃條件下用甲酸對褐藻膠進行兩步法酸解，通過調整反應時間，制備得到不同M/G值（0.28～0.47）的AOS。酸解法簡單易操作，能穩定獲得固有結構特征的AOS，缺點是需要用堿中和剩余的酸，酸堿中和產生大量的鹽給后續AOS的分離純化造成困難，此外，酸解法需要在較高的溫度下進行，反應劇烈不易控制并且產物外觀顏色較差[18]。

堿解法的原理是在堿性環境中，通過β-消除反應使褐藻膠的糖苷鍵斷裂，C-5上的質子被奪走，同時羧基誘導電子從C-4位上向C-5位轉移，如圖4B所示，產物的C-4和C-5位形成與羧基共軛的雙鍵[19]。Niemel等[20]分別在95 ℃和135 ℃利用濃度為5 mol/L和2 mol/L的氫氧化鈉溶液降解褐藻膠，發現在高濃度的堿液下褐藻膠會降解產生脫水異糖精酸、糖化異糖精酸等物質，而在低濃度堿液中褐藻膠降解為2,3-二脫氧戊糖酸。這表明堿解法會導致褐藻膠結構發生復雜改變，且容易生成甲酸、乙酸等副產物，所以一般不采用該方法制備AOS[21]。

與酸解法和堿解法相比，過氧化氫（H2O2）氧化法是一種更環保的制備方法，副產物主要是H2O[22]。關于H2O2降解褐藻膠的確切機制尚不明晰，目前較為公認的是H2O2在反應過程中產生的羥自由基通過攻擊糖殘基上的C-1位的氫誘導糖苷鍵的降解（圖4C）。氧化法制備的AOS在氧化降解過程中容易在還原端開環形成羧基，稱為AOS-氧化降解產物（AOS-oxidative degradation，AOSOD）[8]。楊釗等[23]利用體積分數5%的H2O2溶液在90 ℃條件下和PM溶液反應2 h，制備得到了MAOS，與酸解法相比，氧化降解法制備的寡糖具有更潔白的色澤。Li Xiaoxia等[24]發現H2O2氧化制備AOS的效率和反應時間、溫度、H2O2濃度有關，通過控制反應時間可以獲得不同DP的AOS。氧化降解法同堿解法一樣會得到具有特殊結構的AOS，但氧化降解法所得特殊結構單一且反應過程更穩定。

1.2 物理法

γ射線、紫外射線、微波輻射、水熱法和超聲法是主要的物理降解方法。如圖5所示，物理法制備所得的AOS不會發生結構改變。物理法對褐藻膠的降解作用明顯，但制備過程中需要消耗大量能源，成本較高。

圖5 物理法制備AOS的過程Fig.5 Preparation of AOS by physical degradation methods

γ射線、紫外射線和微波輻射統稱為輻射法，原理是通過不同射線對褐藻膠進行照射使其糖苷鍵斷裂，從而得到AOS。研究發現20～100 kGy的γ射線對褐藻膠進行輻射所產生的AOS化學結構沒有顯著影響[25]。Mollah等[26]研究發現當輻射劑量從12.5 kGy升至50 kGy時，產物的DP從50降到5。Lee等[27]發現隨著γ射線輻射劑量的增加，雖然產物中M和G的含量均增加，但是M/G值降低，由此可見，通過改變γ射線照射褐藻膠的條件，可以制備出不同DP和M/G值的AOS，證明γ射線在定向制備AOS方面潛力極大。二氧化鈦存在的條件下，將褐藻膠溶液紫外照射3 h后可得到低分子質量的MAOS、GAOS和HAOS[28]。紫外照射法操作簡單、產率高（90%），同時二氧化鈦容易去除，這為食品行業制備AOS提供了新思路。用微波輻射褐藻膠可以制備DP為1～10的GAOS，與傳統的酸水解方法相比，微波降解方法不僅操作方便、耗時短、環境友好、減少了脫鹽過程，而且制備所得的GAOS產率高（71%）[29]。

水熱降解法也是一種常用的物理法。將水加熱到超臨界狀態，超臨界水可以溶解大量的氧氣，具有黏度低、擴散系數高、表面張力低等性質。以超臨界水為介質，能迅速將褐藻膠降解為AOS。Aida等[30]在180～250 ℃條件下，采用水熱降解法將褐藻膠溶液中M-M、M-G和G-G之間的糖苷鍵斷裂并產生AOS，降解過程反應迅速并表現出一定選擇性，M-M糖苷鍵優先斷裂，其次是M-G和G-G糖苷鍵。根據不同溫度下水解過程的動力學差異，通過改變溫度選擇性生產MAOS、GAOS和HAOS的方法有待進一步研究。水熱降解法具有快速、高效且無污染等優點，但對反應條件要求較高，反應機理也有待深入探究。

超聲降解的原理是物質的質點在超聲波的作用下會產生極高的運動加速度，發生激烈的碰撞，從而導致大分子物質內部共價鍵的斷裂[31]。袁麗等[32]利用超聲波降解褐藻膠并用其降解產物浸泡南美白對蝦，對蝦的最終質量增加率為14.11%。Feng Liping等[33]通過不同頻率的超聲波降解褐藻膠，發現超聲波不僅可以使褐藻膠降解還可以制備不同M/G值的產物。通過改變超聲波的頻率，可以制備不同分子質量和M/G值的AOS，所以超聲降解具有定向制備AOS的潛力。

1.3 生物法

生物法是直接通過微生物發酵或者利用褐藻膠裂解酶對褐藻膠進行酶解制備AOS的方法，此方法綠色環保、能定向制備AOS，但制備效率受褐藻膠裂解酶活力的影響。

目前，多糖利用位點（polysaccharide utilization locus，PUL）體系是研究較為透徹的微生物利用褐藻膠的代謝途徑[34]。PUL體系中PULs是褐藻膠降解的相關基因座，PULs編碼相關褐藻膠裂解酶、SusC蛋白、SusD蛋白、MFS轉運蛋白，細胞外膜的褐藻膠裂解酶先將大分子褐藻膠降解為AOS，SusC/SusD蛋白復合物將AOS轉運到細胞外膜和內膜間隙，在間隙處被酶解成不飽和單糖，隨后不飽和單糖被MFS轉運蛋白轉移至細胞質，不飽和單糖在細胞質中經過一系列反應最終生成三磷酸甘油醛（glyceraldehyde triphosphate，G-3-P）和丙酮酸，G-3-P和丙酮酸最終進入微生物的三羧酸循環[35]，通過上述路徑，褐藻膠可以為微生物的正常代謝提供原料，同時該途徑中AOS和不飽和單糖生成的位點不一樣，可以開發一些方法在不同位點獲得所需產物。Li Miaomiao等[36]從人體糞便中篩選得到的卵形擬桿菌（Bacteroides ovatus）G19具有降解褐藻膠的功能。Wang Mingpeng等[37]從腐爛的海帶中分離并鑒定了一株梨形芽孢桿菌（Bacillus litoralis），使用該菌株發酵制備所得AOS的DP在2～6之間，其中DP為2的寡糖含量最高，占總產物含量的73.9%。Guo Wenbin等[38]以葡萄糖為碳源發酵門多薩假單胞菌（Pseudomonas mendocina）NK-01，發現該菌株能將葡萄糖同時轉化為聚羥基烷酸酯和AOS，當葡萄糖被消耗完后，該菌株能繼續將聚羥基烷酸酯轉化為AOS，制備所得AOS最終產量為0.57 g/L、分子質量小于2000 Da。在微生物發酵法制備AOS的過程中，微生物分泌表達褐藻膠裂解酶將褐藻膠降解為AOS[37-38]，該方法受限于菌株所產褐藻膠裂解酶的活力，另外，微生物菌體和其他代謝產物等會有所殘留，影響AOS的純度。

褐藻膠裂解酶主要來源于海藻[39]、海洋軟脊椎動物[40]、海洋真菌[41]、海洋細菌[42]和陸地細菌[43]。褐藻膠裂解酶通過β-消除反應催化褐藻膠的1,4-糖苷鍵的斷裂以產生AOS，其中有些褐藻膠裂解酶催化反應過程中需要金屬離子的參與，如圖6所示，具體降解機制分為以下幾步：1）帶正電荷氨基酸或者金屬離子中和底物C5的羧基負電荷并降低H-5質子的解離常數；2）催化堿吸走C-5上的質子，并形成羧酸根二價陰離子的中間體；3）催化酸提供質子，在C-4和C-5之間形成雙鍵，導致4-O-糖苷鍵斷裂并在非還原端生成4-脫氧-α-L-4-烯吡喃糖醛酸，最終生成不飽和褐藻膠寡糖（unsaturated alginate oligosaccharides，UAOS）[44]，需要金屬離子參與的反應中，金屬離子起到穩定底物帶負電羧基的作用。基于一級結構的差異，碳水化合物活性酶數據庫將褐藻膠裂解酶分類為不同的多糖裂解酶（polysaccharide lyase，PL）家族，分別為PL5、PL6、PL7、PL8、PL14、PL15、PL17、PL18、PL31、PL32、PL34、PL36、PL39和PL41家族[10]。根據褐藻膠裂解酶的底物偏好性，可以將其分為PM特異性裂解酶、PG特異性裂解酶和雙功能裂解酶[45]。褐藻膠裂解酶作用模式分為內切和外切型，內切型褐藻膠裂解酶作用位點在褐藻膠內部的糖苷鍵并產生具有不同DP的AOS，而外切型褐藻膠裂解酶通過從褐藻膠末端逐步催化糖苷鍵斷裂產生單糖，有些褐藻膠裂解酶同時具有內/外切功能，可以同時產生單糖和寡糖[46-47]。表1展示了不同來源的褐藻膠裂解酶的降解特征，這些酶均具有專一性強、反應條件溫和且能定向制備不同結構AOS的特點，證實了褐藻膠裂解酶在定向制備AOS上具有良好應用前景。

表1 不同來源褐藻膠裂解酶的降解特征Table 1 Degradation characteristics of alginate lyases from different sources

圖6 褐藻膠裂解酶作用機制Fig.6 Action mechanism of alginate lyase

產業化生產AOS能更好地推廣其在食品領域的應用，目前，生物法是產業化制備AOS的主要手段，程躍謨等[61]以海帶為原料，將其浸泡于酶解罐中，用纖維素酶酶解和碳酸鈉消化后獲得海藻酸鈉膠狀物質，隨后添加褐藻膠裂解酶酶液并攪拌，對反應液進行乙醇脫水后可以批量制備AOS。曹文禹等[62]將馬尾藻洗凈烘干并進行破碎，將藻粉浸潤在含有軟化劑的水中，隨后向溶液中加入蛋白酶、纖維素酶、果膠酶和褐藻膠裂解酶，過濾烘干后得到AOS。在大型反應容器中，將原料進行預處理，再用褐藻膠裂解酶降解加工后的原料，可以大規模地生產AOS。

1.4 AOS分離純化

通過不同方法制備所得的AOS多為混合物，為了獲得組成單一、結構確定的AOS，需要借助分離純化技術的幫助。

尺寸排阻層析是一種常用的分離純化AOS的方法，SEC的填料由高分子交聯而成，同時內部具有多孔網狀結構，不同尺寸的物質通過填料的速度不一樣，尺寸大的組分流出速度更快，可以通過不同組分流出時間的差異實現對AOS混合物的分離[63]。Zhang Keke等[4]利用Superdex Peptide 10/300 GL預裝柱和?KTA純化系統分離純化褐藻膠裂解酶的酶解產物，獲得了不同DP的AOS。尺寸排阻層析法分離率高，但是純化過程中需要嚴格控制系統的流速，以達到最佳分離效果。

離子交換色譜中的固定相為一些帶電荷的基團，流動相為待分離樣品，根據固定相和樣品之間發生離子交換能力的差異，可以將不同組分分離[64]。Ballance等[65]利用酸解法制備得到AOS粗品，用半制備離子型IonPac AS4A柱對其進行純化，可以獲得純度為96%的AOS。離子交換色譜法靈敏度高，但是分離樣品量較少。

膠束電動毛細管色譜以表面活性劑形成的膠束作為準固定相，由于溶質在膠束相和水溶液相間的分配存在差異，從而分離不同組分[66]。Volpi[67]用膠束電動毛細管色譜法分離了褐藻膠裂解酶的酶解產物，最終獲得了不同DP的AOS，分離過程中膠束電動毛細管色譜法顯示出較好的分辨率，此方法分離能力強、分離速度快，但是也存在分離樣品量較少的問題。

超高效液相色譜與傳統高效液相色譜相比，其使用的是填充顆粒較小的小色譜柱，實現了更高的理論塔板數和更快的分離速度[68]。Jonathan等[69]將超高效液相色譜和Acquity UPLC BEH Amide柱聯用，將UAOS和AOS分離，同時觀察到相同DP的UAOS和AOS中，UAOS先洗脫出來。超高效液相色譜可以高效地將樣品分離，但是其需要較高泵壓的工作泵，增加了使用成本。

膜分離法的原理是不同分子質量的組分體積有差異，大于濾膜孔徑的物質會被截留而小于濾膜孔徑的物質可以流出，利用濾膜兩側濃度差、壓力差等推動力，使不同體積的組分選擇性通過濾膜[70]。歐昌榮等[71]通過發酵法制備得到AOS和菌體的混合液，離心除去菌體后通過超濾-納濾兩級膜純化分離AOS，最終獲得不同DP的AOS。膜分離法能處理大批量的混合液，但是分離效率易受到混合液濃度的影響，同時分離膜需要定期更換或清洗，成本較高。

沉降分離法根據物質在有機溶劑中的溶解度不同實現不同組分的分離。Yang Min等[42]將褐藻膠裂解酶酶解產物通過1、3、5 倍的醇沉，分別純化得到M/G值為2.44、0.85、0.37的AOS。沉降分離法操作簡單，但是可能會有雜質的殘存。

在分離純化AOS的過程中，可以根據所需目標產物，選擇合適地純化方法，并通過不同純化方法的聯用，達到最佳純化效果。

2 AOS結構對功效的影響

AOS因其具有抑菌、抗炎、免疫調節、抗凋亡等多種生物活性受到廣泛關注，這些生物活性與其結構多樣性和復雜性密切相關，包括AOS糖醛酸組成、DP和特殊結構等。因此，通過對AOS結構與構效之間潛在關系的深入研究，為AOS在食品行業中的選擇性制備和精準應用提供重要參考。

2.1 不同糖醛酸組成的AOS的功效

AOS是由G和M兩種組分隨機組合而成的寡糖，根據糖醛酸組成的不同可以將AOS分為GAOS、MAOS和HAOS，不同糖醛酸組成的AOS功效有所差異。

2.1.1 GAOS的功效

GAOS是由G單體通過β-1,4糖苷鍵連接而成的、糖醛酸組成單一的寡糖，G單體之間垂直排列（圖2B）。GAOS展示出良好的調節凝膠特性、抑菌、益生元功效以及可作為微生物誘導劑等多種特殊功效。

GAOS可以通過影響凝膠動力學、凝膠強度、黏度、彈性和溶液體系的平衡特性調節大分子褐藻膠溶液的流變特性。如圖7所示，二價陽離子特別是Ca2+可以在特定的配位相互作用下和一對相反的GAOS結合，這就是著名的蛋盒二聚體模型，可以作為黏合劑促進大分子褐藻膠溶液凝膠的形成[72]。Liao Hua等[73]發現較高Ca2+濃度更容易與GAOS形成蛋盒二聚體，此外，GAOS的Ca2+結合能力使其具有改善Ca2+依賴性凝膠特性的作用[74]。Cao Lianqi等[75]發現GAOS的添加降低了大豆分離蛋白凝膠的機械強度、彈性、硬度，且含有30 mmol/L GAOS的大豆分離蛋白顯示出最緊密的網絡結構，持水量達到77.5%。雖然GAOS顯示出與Ca2+的結合特性，但是并非所有陽離子都能和GAOS有效結合，鎂離子與GAOS結合能力較弱[76]。GAOS這種調節溶液凝膠特性的功能，在改善酸奶、果凍等食品凝膠特性方面具有一定潛力，但在實際應用中需要考慮與GAOS結合的陽離子種類，在達到凝膠效果的同時確保食品安全。

圖7 蛋盒二聚體形成過程Fig.7 Formation process of egg-box dimer

抗生素的濫用導致了耐藥性病原體的肆虐，對世界醫療保健系統產生了重大的影響，而GAOS能削弱病原體對抗生素的抗性，提高抗生素的效果。Khan等[77]測試了GAOS對耐藥性細菌的作用，發現GAOS能夠通過調節細菌生物膜的形成和持久性，降低細菌對抗生素治療的抵抗力，使用GAOS后，細菌生物膜生長明顯減弱，細菌細胞的細胞膜明顯受損并變得扭曲和不均勻，從而使抗生素在人體更好地發揮作用。

短鏈脂肪酸對于維持人體大腸的正常功能具有重要作用，Li Miaomiao等[36]發現AOS、MAOS和GAOS能促進人體合成短鏈脂肪酸，其中GAOS的效果最好。GAOS比MAOS、HAOS更難被人體降解，可能是因為G-G之間的連接是垂直軸向的，而M-M之間的連接是水平方向的，這導致GAOS的凝膠結構較硬，而MAOS傾向形成較軟的凝膠。與MAOS和GAOS相比，GAOS更具有作為益生元并調節腸道健康的潛力。

Kawada等[78]發現DP為1～3的GAOS具有增強人臍靜脈內皮細胞增殖和遷移的能力，由于此細胞的增殖受內皮細胞生長因子的介導，因此推測GAOS可以作為輔助因子促進內皮細胞生長因子的合成。

GAOS還可以促進一些微生物功能蛋白的表達，比如地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）產生的桿菌肽對革蘭氏陽性菌具有殺菌活性，添加GAOS之后發現菌體中控制桿菌肽表達的基因顯著上調，同時桿菌肽產量分別增加了68%和29%[79]。GAOS的添加也可以使產黃青霉（Penicillium chrysogenum）的青霉素產量增加50%[80]。上述研究表明GAOS可以作為誘導劑促進微生物代謝，提高功效成分的產量，這在食品、醫藥行業中具有很大潛力。

古糖酯（polyguluronate sulfate，PGS）是以GAOS為原料，經酯化試劑修飾得到的一種海洋硫酸多糖類化合物[81]。Zhao Xia等[82]探究了PGS的體外抗凝血活性和體內抗炎活性，發現PGS可以延長大鼠全血凝血時間并且能抑制大鼠棉球肉芽腫的形成。Wu Lijuan等[83]證明PGS可以干擾HepG 2.2.15細胞中乙型肝炎病毒的轉錄，在治療乙型肝炎病毒方面極具潛力。PGS還對免疫性肝損傷具有保護作用，PGS可以降低H2O2誘導的HepG2肝細胞氧化應激，抑制HepG2細胞中丙二醛、乳酸脫氫酶、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白介素（interleukin，IL）-6的產生，同時上調超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性[84]。

2.1.2 MAOS的功效

MAOS是由M單體通過β-1,4糖苷鍵連接而成的、糖醛酸組成單一的寡糖，M 單體直接呈水平結構（圖2A）。大量研究發現，MAOS具有保護神經系統的功能，以MAOS及其衍生物作為主要成分的保護神經系統藥物也已研發成功，此外，MAOS衍生物還表現出了降血脂和降血糖等功效。

微管系統是神經細胞骨架成分，由微管蛋白和微管相關蛋白組成，其中Tau蛋白是人體含量最的微管相關蛋白，Tau蛋白的異常磷酸化會使神經元微觀結構受到破壞，從而引發阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）等腦神經退行性疾病[85-86]。Bi Decheng等[87]通過細胞實驗，發現MAOS能抑制肝素誘導的Tau蛋白聚集，減弱Tau蛋白的磷酸化，證明MAOS有預防和治療神經退行性疾病的潛力。β-淀粉樣蛋白由人體細胞產生，循環于血液、腦間質液中，其聚集會引起腦內神經元病變[88]。Bi Decheng等[89]發現DP為2～11的MAOS可以抑制β-淀粉樣蛋白的表達和聚集，具有潛在治療AD的能力。此外，研究發現，MAOS還能夠通過調節5-羥色胺、5-羥基吲哚乙酸和γ-氨基丁酸的含量改善帕金森病，并通過抑制腸道和大腦炎癥調控帕金森病的發病機制[90]。由此可見，MAOS具有保護神經系統作用，在食品、保健品和醫藥行業具有重要應用價值。

MAOS可以通過硫酸化修飾、硒化修飾和金屬絡合等化學反應形成多種衍生物，這些衍生物同樣具有多種生物學活性，包括抗病毒、神經保護、降血糖和降血脂、免疫調節等。MAOS在C-2和C-3位置一定程度硫酸化后，可以形成硫酸化甘露糖醛酸（sulfated polymannuroguluronate，SPMG）（圖8A）。SPMG顯示出與肝素類似的人體免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）殼膜蛋白結合效果，能夠通過與HIV殼膜蛋白的高親和力結合對抗HIV感染人體，由于肝素也是高度硫酸化的，這證實了硫酸基團在與HIV殼膜蛋白結合中發揮關鍵作用[91]。甘露特鈉膠囊（GV-971）是DP為2～11的MAOS衍生物（圖8B），口服GV-971能夠通過降低腸道神經炎癥患病風險抑制AD的發展[92]，需要注意的是，GV-971的多種C-5差向異構體并未顯示出抑制AD的作用[93]，說明M結構對GV-971發揮作用至關重要，所以在應用AOS時要關注其結構，使AOS更充分發揮功效。Hao Cui等[94]發現MAOS-鉻（III）復合物能改善C2C12骨骼肌細胞的胰島素敏感性，并作為一種新型葡萄糖攝取刺激劑用于2型糖尿病的治療，同時，MAOS-鉻（III）復合物可以激活3T3-L1脂肪細胞中AMPK-PGC1-α信號通路，增強脂肪酸β-氧化作用，從而促進線粒體的生物反應，減少細胞中脂質的積累。MAOS硒化衍生物甘露聚糖可以減少一氧化氮（NO）、地諾前列酮、TNF-α、IL-β和IL-6的產生，可作為功能性食品調節神經免疫[95-96]。甘糖酯是在MAOS的基礎上制備得到的類肝素類酸性多糖[97]，王汝霞等[98]用甘糖酯喂養已有糖尿病腎臟病變的大鼠，發現大鼠的尿蛋白排泄率、腎質量/體質量比值均有不同程度下降，表明甘糖酯可以改善腎臟高濾過、腎臟肥大和蛋白尿等情況。

2.1.3 HAOS的功效

HAOS是由M和G單體隨機聚合而成的寡糖，由于糖醛酸組成的不同，HAOS的結構具有多樣性（圖2C）。HAOS顯示出多種生物活性，包括抑菌、免疫調節、抗炎、抗氧化、降血脂等。

2.1.3.1 HAOS抑菌活性

細菌生物膜提高了細菌對宿主的免疫防御和抗生素的耐受力，保護細菌在宿主體內生存和繁衍。HAOS能抑制和破壞銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）生物膜的形成，從而預防和減弱P.aeruginosa對人體呼吸道的感染[12]。Powell等[99]進一步研究發現HAOS與P.aeruginosa菌體表面結合，通過調節菌體表面電荷誘導細菌集合并抑制細菌運動。以上所研究HAOS結構的共同點是G組分的含量遠大于M組分的含量，且有研究表明G含量占總體的85%以上時，HAOS的抑菌效果更強[100]。GAOS也顯示出抑菌活性，進一步證實G組分對AOS的抑菌活性至關重要[77]。M/G值影響HAOS的抑菌作用，可能是因為G組分與細菌的相互作用更強，但是具體機制還有待進一步論證。

2.1.3.2 HAOS免疫調節活性

大量研究發現AOS具有調節免疫反應的潛力，其關鍵功能之一是誘導細胞因子（TNF-α、IL-1β和IL-6等）的活性。Ueno等[101]研究發現不同M/G值的HAOS對小鼠巨噬細胞RAW 264.7中TNF-α的誘導效果不同，當M/G為2.24時顯示出最有效的TNF-α誘導活性。Kurachi等[102]發現較高M/G值的HAOS顯示出更強的TNF-α誘導活性，相較于G組分，M組分在誘導TNF-α分泌中發揮更多作用。Suzuki等[103]發現HAOS中M組分的含量對小鼠腸道免疫活性起決定性作用，M組分在69%～86%之間時顯示出免疫活性，但M組分低于31%時沒有顯示免疫活性，M組分高的HAOS可以通過派爾集合淋巴結刺激腸道產生免疫活性。由此可見，M/G值比較高的HAOS可能具有更強的促細胞因子分泌作用，從而增強宿主免疫系統的功能。

2.1.3.3 HAOS抗炎活性

腸道屏障結構受損會導致腸道的通透性增加，腸道中的細菌和內毒素等能夠穿過腸道屏障進入血液中，從而誘發一系列的炎癥反應。Wan Jin等[104]發現HAOS（M/G＝1.5）可以改善由大腸桿菌（Escherichia coli）誘發的腸上皮細胞損傷，阻止內毒素與腸上皮細胞的結合，從而減少促炎細胞因子的產生。Xiong Bohui等[105]研究發現HAOS能顯著改善豬空腸上皮細胞的完整性，提高腸道細胞的遷移能力，維護腸道正常的屏障功能，從而預防腸道炎癥。HAOS能作為抗炎劑應用在哺乳動物腸道疾病治療中。

2.1.3.4 HAOS抗氧化活性

活性氧是機體各類生化反應的中間代謝產物，包括超氧化物、H2O2、羥自由基等。活性氧過度生成和累積會導致有害的氧化應激，誘導分子損傷和細胞凋亡等，可能會導致各種疾病的發生。Jiang Zedong等[45]證明HAOS在人臍靜脈內皮細胞中顯示出對H2O2誘導的氧化應激的有效抗氧化作用。張明杰[106]發現HAOS可以有效地清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和羥自由基，其中分子質量為0.84 kDa的組分抗氧化活性最為顯著，清除羥自由基的能力和VC相近，同時還發現分子質量較小的HAOS具有更強的抗氧化活性。同時，HAOS的抗氧化活性也受M/G值的影響，M/G值比較高的AOS具有更強的自由基清除活性[107]。

2.1.3.5 HAOS降血脂活性

低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）是一種運載膽固醇進入外周組織細胞的脂蛋白顆粒，體內LDL-C的濃度過高會導致心血管疾病。低密度脂蛋白（low-density lipoprotein，LDL）和低密度脂蛋白受體（low-density lipoprotein receptor，LDL-R）能夠降低LDL-C的含量，在膽固醇代謝中起著至關重要的作用。LDL-R基因表達受固醇調節元件結合蛋白的調控，而前蛋白轉化酶枯草溶菌素/Kexin 9型能降解LDL-R，HAOS的添加在增強人體細胞固醇調節元件結合蛋白表達的同時抑制前蛋白轉化酶枯草溶菌素/Kexin 9型的合成，從而增加LDL-R的表達，使體內LDL-C趨于正常[108]。Wang Yuting等[109]用HAOS（DP 1～4）喂食小鼠，發現HAOS可以降低小鼠體內LDL-C的濃度并抑制脂肪生成相關基因的表達，從而起到降血脂的作用。目前，還沒有研究明確表明HAOS的結構對其降血脂活性的影響，需要進行更多研究找出降血脂效果較強的HAOS結構。

2.2 DP對AOS功效的影響

由于褐藻膠在降解過程中β-1,4糖苷鍵斷裂位置不同，所產生的AOS DP不同，AOS發揮的功效也有所差異，特定DP的AOS具有更顯著的抗炎、抗氧化、免疫調節、抗感染等功效。

在DP為2～5的AOS中，DP為5的AOS可以更有效地增加血清中SOD、谷胱甘肽、高密度脂蛋白膽固醇含量，提高人體抗氧化能力并抑制炎癥細胞因子IL-1β和IL-6的產生[110]。胡婷等[111]制備得到了M1～M7，發現MAOS清除DPPH自由基、超氧陰離子自由基及絡合亞鐵離子的能力隨著MAOS的DP增加而降低，而MAOS清除羥自由基能力隨著DP增加而升高。

相比于DP為3～6的GAOS，DP為3～6的MAOS誘導TNF-α的能力更強，其中DP為3的MAOS誘導活性最強[112]，說明AOS的糖醛酸組成和DP都對其誘導細胞因子功效有影響。Iwamoto等[113]制備了G3～G9和M3～M9兩組寡糖，并檢測了它們誘導小鼠巨噬細胞RAW 264.7分泌細胞因子的活性，發現G8和M7分別在不同組內表現出較強的誘導活性，推測G8和M7兩種寡糖具有合適的分子大小和構象，能更好地刺激細胞因子分泌，從而調節機體免疫力。

Hu Xiaoke等[114]制備了M1～M5和G1～G5，并評估了它們對不同細菌的體外抑菌效果，結果發現M組顯示出比G組更多的抑菌種類和更有效的抑制作用，其中被M3抑制的細菌種類最多。SPMG抗HIV-1感染的能力和其DP有關，SPMG（DP 15～16）抗HIV-1感染的能力僅為SPMG（DP 19～20）的50%[91]。

不同DP的AOS功效有所差異，篩選出特定DP的AOS，能更好地滿足實際需求并提高AOS的應用效果。

2.3 特殊結構AOS的功效

一些制備方法可以將褐藻膠降解并生成特殊結構的AOS，氧化降解法可以生成開環含羧基結構的AOSOD，褐藻膠裂解酶酶解法可以制備得到含不飽和端的UAOS，特殊的結構賦予了AOS更多的功效。

2.3.1 AOS-OD的功效

如圖4C所示，AOS-OD是通過氧化法降解褐藻膠制備得到的含羧基開環結構化合物，羧基結構使AOS-OD具有特殊生物活性[8]。Zhou Rui等[115]發現相較于酸解法制備得到的AOS，氧化法制備而得的AOS-OD顯著減少了脂多糖脅迫下RAW 264.7細胞中NO的過量產生，從而發揮抗炎作用。Bouhadir等[116]利用AOS-OD水凝膠將軟骨細胞包埋并注射到小鼠背側區域，發現小鼠體內有新的軟骨組織生成，說明AOS-OD可以用于體內注射細胞遞送系統。目前對AOS-OD的功效研究還較少，對其功效的深入研究能更好地將AOS-OD應用于食品行業。

2.3.2 UAOS的功效

UAOS是褐藻膠裂解酶降解褐藻膠過程中產生的具有不飽和端的特殊結構（圖6）。Jonathan等[69]分別用酸解法制備的AOS和酶解制備的UAOS喂食豬后，發現豬腸道微生物能更有效地利用酶解制備的UAOS。Li Shangyong等[117]發現相較于酸水解制備的AOS，UAOS顯著降低了高脂型小鼠血清中甘油三酯、總膽固醇和游離脂肪酸含量，且這種降血脂功效與M/G值無關，只和不飽和結構有關。進一步研究發現，UAOS可以增加小鼠腸道中乳桿菌（Lactobacillus）、阿克曼菌（Akkermansia）等有益菌的相對豐度并減少了擬桿菌（Bacteroides）、副桿菌（Parabacteroides）等致炎細菌的相對豐度，通過調節腸道微生物群減輕高脂飲食引起的肥胖[118]。這些結果表明，UAOS可以有效地被機體吸收并作為治療肥胖和相關代謝疾病的益生元。

UAOS還可以調節免疫，He Ningning等[119]研究了酶解制備的UAOS對右旋糖酐硫酸鈉誘導的小鼠潰瘍性結腸炎的改善作用，發現UAOS可以通過調節腸道微生物菌群的群落結構維持黏膜屏障功能和抑制免疫損傷。Xu Xu等[120]證明相較于酸解制備的AOS，UAOS對小鼠巨噬細胞RAW 264.7具有更強的TNF-α誘導能力，可以作為一種有效的免疫調節劑應用于食品、醫藥行業。如表2所示，AOS和UAOS都具有降血脂、免疫調節的活性，但是具有不飽和結構的UAOS展示出比AOS更強的功效[117,120]，所以UAOS極具開發應用價值。

表2 不同結構AOS的功效Table 2 Functions of AOS with different structures

3 結語

AOS展現出非常優秀的生物活性，具有廣闊的應用前景。不同制備方法所得到的AOS具有不同的糖醛酸組成、DP和特殊結構。AOS的活性與其結構組成密切相關，因此，闡明AOS的結構與活性之間的關系有助于選取合適的方法靶向制備特定結構的AOS。制備特定結構的AOS的意義在于提升AOS的應用價值，比如GV-971的多種C-5差向異構體并沒有治療AD的活性[93]，G占總體含量85%以上的AOS具有更強的抑菌效果[100]，特定結構的AOS能更好地滿足相關行業的需求。目前，對于AOS的研究大多基于結構不明確的AOS，且與功效之間的關系尚不明晰，大多數研究集中在混合AOS的生物活性上，這制約著AOS的開發與應用，所以需要通過合適的方法獲得結構明確的AOS。目前制備AOS的難點在于如何定向獲得所需結構的AOS并且具有較高的純度，可以通過不同制備手段聯用并借助合適的純化方法獲得目標AOS，并對特定結構AOS的功效進行深入挖掘，對于AOS在食品、醫藥等領域的精準應用具有重要的實際意義。