淹水脅迫下鴨茅根系基因差異表達及相關通路分析

曾兵，尚盼盼，沈秉娜，王胤晨，屈明好，袁揚，畢磊，楊興云，李文文，周曉麗，鄭玉倩，郭文強，馮彥龍，曾兵，3*

（1.西南大學動物科學技術學院，重慶 402460；2.貴州省畜牧獸醫研究所，貴州 貴陽 550000；3.重慶高校草食動物工程研究中心，重慶 400715）

鴨茅（Dactylis glomerata）又被稱為果園草（orchard grass）、雞腳草等，為早熟禾亞科（Festucoideae）鴨茅屬（Dactylis）的唯一物種，也是世界廣泛種植的四大禾本科牧草之一［1］。我國鴨茅資源主要分布在西南地區及烏蒙山、新疆天山等地的森林邊緣、灌草叢和山坡草地。因其具有耐陰、耐瘠、耐寒、環境適應性強，根系發達等特性，在草山草坡改良、喀斯特地貌區的石漠化治理、人工草地以及林草復合植被建設等生態工程中被廣泛推廣利用［2-3］。鴨茅草質柔嫩、適口性好、營養價值高，在我國西南地區通過廣泛栽培鴨茅，制作干草、青飼或青貯用于養殖牛、羊、兔等家畜，或與紫花苜蓿（Medicago sativa）、白三葉（Trifolium repens）等豆科牧草混播放牧利用，顯示出了良好的生態、經濟和社會效益［4-5］。

據國家應急管理部發布的2022 年我國十大自然災害中，暴雨洪澇相關災害就包含5 個，6、7 月南方地區連續的強降水導致的洪澇，造成大面積的農作物受災，直接經濟損失達千億元［6］。強降水導致的淹水脅迫儼然成為作物生產中遭受的主要非生物脅迫之一，是影響作物正常生長發育、產量和品質下降的重要因素［7］。淹水環境下，植物氣生組織被水淹沒，與大氣環境氣體交換受阻，致使氧氣獲取不足，有氧呼吸受抑。長期或周期性處于淹水環境下，會造成植物生長減慢，嚴重時導致植株死亡［8］。植物根系是最先感受到土壤環境改變的組織，氧氣減少首先直接影響根細胞的新陳代謝，從而影響地上部分的生長。研究表明，植物在受到淹水脅迫，有氧呼吸被阻斷后，植物激活糖酵解和乙醇發酵途徑來維持根系腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）的產生以彌補能量供應，高水平的無氧呼吸也是植株在較長淹水環境下能夠存活的關鍵［9-10］。為長期適應淹水環境，植物根系不定根、通氣組織等形態結構會發生改變，促進氣體交換。如玉米（Zea mays）通過調控根中皮層細胞的程序性死亡而形成通氣組織，緩解淹水造成的傷害［11］。目前對于植物在淹水環境下響應的形態、生理代謝機理等已有較為清晰的認識，但主要集中于糧食作物或模式植物［12］。

植物響應逆境脅迫是一個復雜的反應過程，其通過主動調節自身生理代謝和結構變化以抵御逆境，而分子水平的調控起著關鍵作用。轉錄組測序作為解析植物響應逆境脅迫分子機制的重要工具，也被大量用于耐澇機制研究。Zhu 等［13］利用轉錄組測序技術對澇漬脅迫處理后的葡萄（Vitis vinifera）葉片進行分析，結果表明水淹脅迫處理后，編碼葉綠素代謝、氨基酸代謝、抗氧化系統、糖酵解相關的基因被激活。Thirunavukkarasu 等［14］對亞熱帶玉米水淹脅迫處理后進行轉錄組分析，結果表明與乙烯合成、細胞壁代謝、G 蛋白活化、通氣組織和不定根形成相關基因表達上調，轉錄因子ERFs、MYB、HSPs、MAPK 和LOB 結構域蛋白被誘導和富集。Qiao 等［15］利用高通量測序技術對水淹脅迫處理8 和24 h 后的鴨茅葉片進行分析，發現澇漬脅迫處理后分別有1454 和565 個差異表達基因響應淹水脅迫，并認為谷胱甘肽代謝、過氧化物酶、糖酵解和植物激素信號轉導通路在響應水淹脅迫過程中可能發揮著重要作用。植物在不同組織和不同生理階段響應逆境脅迫時具有不同的分子調控機理，表現出一定的時空特異性［16］。盡管對于鴨茅葉片在響應淹水脅迫相關機制方面有一定研究，但鴨茅根系作為直接與土壤接觸且最先感受淹水信號的組織，直接影響地上部分的生長，其響應淹水脅迫的分子機制鮮有報道。

因此，本研究以鴨茅根系為研究材料，制造淹水脅迫環境，以淹水0 h 為對照，了解不同淹水脅迫時間下鴨茅根系生理變化，借助轉錄組學分析不同時間脅迫下基因的表達水平，同時對差異表達基因的功能、代謝途徑和轉錄調控因子等進行分析，以期初步解析根系響應淹水脅迫機理，為后續的抗性育種提供基因來源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究以國審鴨茅品種“安巴”（AB）作為試驗材料，來源于四川農業大學草業科技學院，于2021 年4 月在西南大學動物科學技術學院飼草實驗室培養。挑選飽滿一致的鴨茅種子放于鋪有3 層濾紙的培養皿中，在22 ℃黑暗條件下萌發7 d，期間保持濾紙濕潤，再繼續培養7 d。篩選長勢相似幼苗移栽至花盆（口徑15.0 cm，高13.5 cm），花盆內營養土、蛭石和珍珠巖體積比例為3∶1∶1，每盆定植15 株。后置于培養箱中，濕度、溫度、光周期和光照強度參數分別為70%～85%、22 ℃/15 ℃（晝/夜）、14 h/10 h（晝/夜）、5000 lx。其間每2 d 進行一次澆水。

待植株長至3～4 個葉片時開始進行淹水脅迫處理，將整體生長良好且長勢相同的鴨茅分別放入水箱（長80 cm×寬57 cm×高50 cm），并注水至完全淹沒所有植株頂部。處理時間分別為0 h（對照）、8、24 h，每個時間點準時取樣，采取混樣法獲取鴨茅根系，并快速清洗，每個時間處理3 個生物學重復，并做好序號標記。取樣后樣品迅速放入液氮冷凍，再置于-80 ℃冰箱保存，用于轉錄組測序分析。

1.2 試驗方法

1.2.1 生理指標測定 采集0 h（未作處理）、淹水8 和24 h 的鴨茅根系組織樣本，用鋁箔包裹后貯存于-80 ℃超低溫冰箱中，用于生理指標測定。其中，根系可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛和相對電導率，分別采用蒽酮比色法、考馬斯亮藍G-250 染色法、2-硫代巴比妥酸法和電解質外滲量法進行測定［17］。

1.2.2 RNA 提取與轉錄測序 根據Trizol 試劑盒（Invitrogen 公司，美國）說明書，分別從淹水處理0、8 和24 h的鴨茅根系組織中提取總RNA，隨后利用Agilent 2100 bioanalyzer（安捷倫公司，美國）檢測樣品RNA 濃度、純度和完整性。對不同時間處理根系的總RNA 檢測合格的樣品為起始，構建cDNA 文庫，并在Illumina NovaSeq 6000 平臺進行測序。

1.2.3 數據質量控制 獲得鴨茅根系測序原始數據后，對數據進行過濾，去除原始數據中出現帶測序接頭或低質量的序列［12］。將質控后的數據與已發表的鴨茅參考基因組進行比對，下載地址：https：//ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/GCA/007/115/705/GCA_007115705.1_ASM711570v1/，并使用HISAT 2（v 2.0.5）將高質量的clean reads 比對到鴨茅參考基因組，得到基因的定位信息以及特有的序列特征信息，利用Stringtie（v 1.3.3b）對比得到的reads 進行組裝和相對定量分析。

1.2.4 差異表達基因篩選及功能富集分析 在獲得鴨茅根系0 h（對照）以及8 和24 h 處理樣本中基因的表達量后，將不同時間處理組間樣本進行兩兩比較，使用DESeq 2（v 1.16.1）軟件進行差異分析，篩選出差異顯著的基因，篩選標準為|log2FC|≥1.5 且padj<0.05，獲得淹水響應的關鍵候選基因。使用clusterProfiler（v 3.8.1）軟件將差異顯著表達基因在基因本體數據庫（gene ontology，GO）、京都基因和基因組途徑數據庫百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）進行富集分析，篩選標準為padj<0.05。

1.2.5 差異表達基因qRT-PCR 驗證 隨機選取6 個差異表達基因，對淹水脅迫0、8 和24 h 的鴨茅根系樣品進行qRT-PCR 分析。分別提取根系RNA 后，利用PrimeScript ? RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）試劑盒進行反轉錄，以鴨茅Actin為內參基因，引物設計如表1 所示，再進行qRT-PCR，每個基因3 個生物學重復，每個生物學重復包含3 個技術重復，使用2-??Ct計算基因相對表達量［12］。

表1 鴨茅根系差異基因引物序列Table 1 Sequence list of primers for differentially expressed genes in D. glomerata roots

1.3 數據統計與分析

差異基因分析以及GO 和KEGG 富集分析在諾禾致源公司云平臺進行，差異基因相對表達量統計分析使用Microsoft Office Excel 2019 進行，使用微生信在線網站（https：//www.bioinformatics.com.cn/）進行部分繪圖工作。

2 結果與分析

2.1 淹水脅迫對鴨茅根系不同生理指標的影響

如圖1 所示，隨著淹水脅迫的時間增加，鴨茅根系可溶性糖、可溶性蛋白和丙二醛含量呈遞增趨勢，均在淹水24 h 達到最高值，且其含量均顯著高于對照組（P<0.05）。其中，可溶性糖含量在淹水8 和24 h，相比0 h（對照）分別提高了36.34%和60.89%。可溶性蛋白含量在淹水24 h 后，根系中含量最高，為2.04 mg·g-1。丙二醛含量在淹水8 h 與對照差異不顯著，在淹水脅迫24 h 后顯著升高（P<0.05）。相對電導率在淹水8 h 時略低于對照（0 h），但差異不顯著（P>0.05），這可能是植株本身啟動防御機制的作用，而在淹水24 h 根系相對電導率達到最高，為23.52%。在淹水8 和24 h 期間，從以上指標變化趨勢可以看出鴨茅根系內部積極響應淹水脅迫。

圖1 淹水脅迫下鴨茅根系生理指標變化Fig.1 Changes of physiological indexes of D. glomerata roots under flooding stress

2.2 測序數據質量評估分析

對鴨茅淹水0、8 和24 h 的3 個時間處理組的根系組織進行轉錄組測序，原始數據已上傳至NCBI（National Coalition Building Institute）的SAR（Sequence Read Archive）數據庫中，登錄號為 PRJNA896863。測序數據結果統計如表2，在將原始數據進行一系列質控和過濾低質量序列后共獲得 58.51 G 的Clean data，各樣本的Clean reads 數據量介于39685822～47826980。所有樣本轉錄組中，Q20≥97.91%，Q30≥94.05%，GC 含量為52.56%～56.10%。將根系樣品質控后的Clean reads 與鴨茅參考基因組序列進行比對，得到各序列在參考基因組上的位置信息。樣品的平均總比對率為68.14%，與參考基因組唯一位置序列匹配的占樣本Clean reads 的61.18%～70.88%。比對到鴨茅參考基因組多處位置的序列數目占比小于4.28%；綜合以上數據統計結果，表明鴨茅根系測序數據可靠性良好，可用于后續基因差異表達分析。

表2 各樣本測序數據質控結果Table 2 Quality control results of sequencing data for each sample

2.3 差異表達基因篩選

為探究鴨茅根系在淹水脅迫下的基因表達情況，以|log2FC|≥1.5 且padj<0.05 作為篩選標準，對不同時間處理組組間樣品兩兩比較進行差異基因篩選。如表3 所示，與0 h 對照相比，鴨茅根系在脅迫8 h 后，篩選到5788 個差異表達基因，其中，上調基因2872 個（占比49.62%），下調基因2916 個（占比50.38%）；在脅迫24 h 后，有8807個差異表達基因，其中，上調基因4123 個（占比46.82%），下調基因4684 個（占比53.18%）。脅迫8 與24 h 相比，有1687 個基因差異性表達，其中，上調基因515 個，下調基因1172 個。如圖2 所示，通過韋恩分析AB8hvs AB0h、AB24hvs AB0h和AB24hvs AB8h3 個比較組合中上調和下調的差異基因，發現共有106 個基因在受到淹水脅迫后持續上調，154 個基因在持續下調表達。這些差異基因極有可能是鴨茅響應淹水脅迫調控根系生長代謝的重要候選基因。

圖2 差異表達基因的韋恩圖Fig.2 Venn diagram of differentially expressed genes

表3 差異表達基因數量統計Table 3 Statistical of number of differentially expressed genes

2.4 差異表達基因富集分析

2.4.1 差異表達基因GO 功能富集分析 將AB8hvs AB0h和AB24hvs AB0h比較組的差異基因提交至GO 數據庫進行功能注釋分析，用于了解淹水脅迫條件下鴨茅根系的響應機制，結果顯示兩個比較組的差異基因均被分類到生物過程（biological processes，BP）、細胞組分（cellular components，CC）和分子功能（molecular functions，MF）3個組別中。如圖3 展示了兩個比較組合，3 個類別中顯著性前10 的GO 條目，發現BP 和MF 類別差異基因均富集相對較多。在BP 類別中，AB8hvs AB0h差異表達基因主要涉及多糖代謝過程、纖維素代謝過程、葡聚糖代謝過程、細胞碳水化合物代謝過程等；AB24hvs AB0h差異基因主要富集在對脅迫的響應、抗氧化反應、基于微管的運動、DNA 復制等過程中。其中基于微管的運動、纖維素代謝過程兩個比較組中均位列前10。在MF 類別中，兩個比較組合差異基因均被富集到微管結合、作為受體作用于過氧化物的氧化還原酶活性、焦磷酸酶活性、細胞骨架蛋白結合中。如圖4 所示，通過對這些GO 條目中的重要基因（|log2FC| >3）進一步分析發現，隨著淹水時間的增加，與對照0 h 相比，差異表達的基因數量均呈增多趨勢。在基于微管的運動、纖維素代謝過程、葡聚糖代謝過程、細胞骨架蛋白結合等條目中，淹水8 和24 h 相比對照（0 h），下調差異表達基因數量均多于上調差異基因，且差異倍數呈增加趨勢，表明淹水脅迫可能影響了鴨茅根系的細胞壁合成。同時，焦磷酸酶活性、細胞碳水化合物代謝、抗氧化活性等條目中基因差異表達也十分活躍。以上表明，差異表達基因主要涉及多糖代謝、微管結合、纖維素代謝、抗氧化反應等過程，這些差異基因可能在鴨茅根系響應淹水脅迫中發揮重要作用。

圖3 差異表達基因GO 注釋類別顯著性前10 條目統計Fig.3 Statistics of the top 10 entries of GO annotation category significance for differentially expressed genes

圖4 部分顯著富集GO 條目差異表達基因分析Fig.4 Analysis of some significantly enriched GO entries with differentially expressed genes

2.4.2 差異表達基因KEGG 代謝途徑富集分析 將AB8hvs AB0h和AB24hvs AB0h比較組篩選到的差異基因在KEGG 數據庫進行通路富集，分別選擇前20 條通路作氣泡圖進一步分析，如圖5 所示，兩個時間處理與0 h 對照相比，差異基因注釋到的通路中前5 條均相同，分別為苯丙烷生物合成、碳代謝、氨基酸生物合成、淀粉和蔗糖代謝以及糖酵解/糖異生。值得注意的是，苯丙烷生物合成通路所涉及的差異基因數目最多，在8 和24 h 分別涉及114和146 個差異基因，表明該通路在響應淹水脅迫刺激中具有重要作用。其次，在碳代謝、氨基酸生物合成、淀粉和蔗糖代謝以及糖酵解/糖異生通路中，涉及的差異基因數量相對較多，且這些通路中AB24hvs AB0h的差異基因數量均高于AB8hvs AB0h，如在氨基酸生物合成、淀粉和蔗糖代謝中淹水脅迫8 和24 h 分別有61 和85 個、56 和80 個差異基因參與該通路中。此外，兩個時間處理下差異基因同樣被顯著富集到了谷胱甘肽代謝、α-亞麻酸代謝、乙醛酸和二羧酸代謝，說明這些物質代謝過程可能與鴨茅根系響應淹水脅迫密切相關。

圖5 差異表達基因KEGG 富集氣泡圖Fig.5 KEGG enrichment bubble diagram of differentially expressed genes

2.5 差異基因相關表達通路分析

2.5.1 苯丙類生物合成通路相關差異基因分析 通過以上差異基因通路富集結果可知，在鴨茅淹水脅迫8 和24 h 時，富集到苯丙類生物合成通路的差異基因數量最多且富集結果最為顯著（P<0.001）。根據功能注釋結果發現，這些差異基因主要涉及木質素的生物合成途徑，通過繪制差異基因聚類熱圖，以更清晰呈現不同基因的表達情況。如圖6 所示，苯丙氨酸在苯丙氨酸裂解酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）脫氨基作用下轉化為肉桂酸，除PAL2 在脅迫24 h 時上調表達外，其余11 個編碼PAL1 的差異基因隨著淹水時間的延長均逐漸下調表達。肉桂酸-4-羥化酶（cinnamic acid-4-hydroxylase，C4H）屬于細胞色素P450 家族，催化肉桂酸生成對香豆酸，C4H 的合成基因DG5C04650、DG6C03214在8 和24 h 時逐漸下調表達，DG2C02162逐漸上調表達。此外，對香豆酸生成對香豆醇相關催化酶：4-香豆素-CoA 連接酶（4-coumarate-CoA ligase，4CL）、肉桂酰-CoA 還原酶（cinnamoyl-CoA reductase，CCR）和肉桂酸脫氫酶（cinnamyl-alcohol dehydrogenase，CAD）中，除CCR 相關基因DG2C00197、DG2C00196、DG3C06240、DG7C00896在8 和24 h 上調表達外，其余均下調表達。對香豆醇是重要的黃酮類化合物，同時也是合成木質素的重要單體之一，在過氧化物酶（peroxidase，POD）的催化作用下生成木質素，而在POD相關合成基因當中，兩個淹水脅迫處理下共有56 個基因差異表達，其中除了5 個在8 和24 h 時上調，其余均顯著下調表達。綜合以上說明，木質素的生物合成可能是鴨茅根系響應淹水脅迫的重要途徑。

圖6 苯丙類生物合成通路相關差異基因聚類熱圖Fig.6 Phenylpropanoid biosynthesis pathway related differential gene clustering heat map

2.5.2 碳代謝通路相關差異基因分析 碳代謝是植物生存的重要基礎代謝通路，根據富集結果發現，碳代謝通路是被富集的第二大通路。在AB8hvs AB0h比較組中該通路有64 個差異基因，AB24hvs AB0h比較組中有100 個差異基因（圖5）。注釋結果顯示，這些基因參與該通路的多個途徑，如圖7 所示，隨著淹水脅迫的加劇，多個參與編碼糖酵解途徑酶的基因均呈現上調表達。己糖激酶（hexokinase，HXK）、磷酸果糖激酶（phosphofructokinase，PFK）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）是糖酵解途徑中最為關鍵的3 個限速酶，其中，HXK1 的兩個合成基因DG6C04565、DG4C01020和HXK2 的DG4C01019在鴨茅受到淹水脅迫8 和24 h，表達量分別提升2.29 和3.23倍、3.45 和5.62 倍、1.00 和3.37 倍。同時，7 個編碼PFK 基因家 族的差異基因中，PFK4 的合成基因DG6C00996、DG6C04544和PFK3 的合成基因DG7C01212、novel.3741均顯著持續上調，在受到淹水脅迫后表達量提升 了1.98～7.30 倍。結果顯示，PK 基因家族中，DG2C04597、DG3C02444、DG1C07053、DG1C01304和novel.7965隨著脅迫的加劇，表達量均持續上調了0.95～2.72 倍。此外，丙酮酸代謝途徑中合成乙醇脫氫酶1（alcohol dehydrogenase 1，ADH1）的相關基因DG7C02275、DG4C03415、DG4C03416、novel.7272在受到淹水脅迫后劇烈表達，淹水8 h 平均提升了7.68 倍，到24 h 持續與8 h 相近的表達水平。丙酮酸脫氫酶復合體（pyruvate dehydrogenase complex，PDC）相關編碼基因在受到淹水脅迫后均顯著抑制表達。而丙酮酸脫氫酶復合體是植物有氧呼吸的重要限速酶，催化丙酮酸生成乙酰輔酶A 進入三羧酸循環（tricarboxylic acid cycle，TCA），說明鴨茅在缺氧環境下有氧呼吸進程也受到抑制。綜合上述分析，推斷HXK1、HXK2、PFK3、PFK4、PK和ADH1可能是鴨茅響應淹水脅迫的關鍵基因。

圖7 碳代謝通路相關差異基因聚類熱圖Fig.7 Clustering heat map of differential genes related to carbon metabolism pathway

2.5.3 谷胱甘肽代謝通路相關差異基因分析 谷胱甘肽（glutathione，GSH）是植物體內普遍存在的關鍵抗氧化物質，谷胱甘肽代謝在調節植物細胞氧化還原穩態中具有重要作用，其中谷胱甘肽轉移酶（glutathione Stransferase，GST）是參與該代謝途徑中的關鍵酶之一。該通路中差異基因表達情況如圖8 所示，在鴨茅淹水8 和24 h 共有58 個差異基因被顯著富集到谷胱甘肽代謝通路中，其中0～8 h 有42 個差異基因，包括上調22 個，下調20 個；0～24 h 共有48 個差異基因，包括上調17 個，下調31 個。在該通路所有上調的差異基因中，合成GST 的基因家族共有21 個，包括ATGSTF13（2 個）、ERD9（7 個）、GSTU18（5 個）、GSTU8（2 個）、GSTU16、GSTL2、GSTL3、GSTU19和GSTU25，這些差異基因除GSTU16只在0～8 h 上調外，其余在鴨茅淹水0～8 h 和0～24 h 表達量均顯著提升，說明GST 相關基因的上調表達可能在鴨茅根系響應水淹脅迫中發揮重要作用。同時，抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase 2，APX2）、核糖核苷還原酶（ribonucleotide reductase 1，RNR1）和亮氨酸氨基肽酶1（leucine aminopeptidase 1，LAP1）在受到淹水脅迫后也均上調表達，它們可能在協同谷胱甘肽清除無氧呼吸過程產生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）中起到重要作用。

圖8 谷胱甘肽代謝通路相關差異基因Fig.8 Differential genes related to glutathione metabolic pathway

2.6 轉錄因子分析

在不良環境下，一些與逆境相關的轉錄因子（transcription factor，TF）能夠在轉錄水平促進功能基因的表達和信號傳遞，激活更多抗逆相關基因同時表達，提高植物的抗逆性。因此，基于淹水脅迫鴨茅根系轉錄組數據，分析了兩個處理時間下編碼TFs 的差異基因。如表4 所示，這些TF 主要來自MYB、NB-ARC、WRKY、GRAS 和AP2等多個轉錄因子家族。其中，MYB 編碼基因主要被富集到植物晝夜節律通路中，在AB8hvs AB0h和AB24hvs AB0h分別上調19 和32 個，下調20 和39 個。NB-ARC 編碼基因主要被富集到植物-病原互作通路中，在淹水0～8 h 和0～24 h 分別上調了23 和20 個，下調了16 和32 個。WRKY 相關編碼基因主要被富集到植物-病原互作、植物MAPK 信號通路中，且在8 和24 h 兩組處理下分別上調了4 和5 個。GRAS 是植物特有的一類TFs，參與植物激素信號轉導，在淹水0～8 h 和0～24 h 分別上調表達了2 和7 個，下調表達2 和4 個。AP2 家族在響應逆境脅迫中具有重要作用，主要參與植物激素信號轉導、植物MAPK 信號通路過程，在淹水0～8 h 上調了8 個，下調了19 個，而在0～24 h 上調的差異基因數量多于下調基因，上調了28 個，下調了13 個。綜合分析，發現隨著淹水脅迫時間的延長，這些轉錄因子家族的編碼基因逐漸增多，說明這些TFs 家族可能與鴨茅響應逆境密切相關。

表4 重要轉錄因子差異基因數量統計Table 4 Statistics on the number of differential genes of important transcription factors

2.7 qRT-PCR 驗證

為了驗證轉錄組數據結果的準確性，共隨機挑選出6 個差異表達基因，并以Actin作為內參基因，進行qRTPCR 試驗驗證。從圖9 和圖10 可看出，qRT-PCR 驗證的差異基因表達趨勢與RNA-Seq 結果的相關系數為0.8739，表明二者的相關性高，說明本次測序所得數據準確性和可信度較高，數據較為可靠。

圖9 實時熒光定量PCR 和轉錄組數據相關性分析Fig.9 Real-time fluorescence quantitative PCR and transcriptome data correlation analysis

圖10 差異基因的實時熒光定量PCR 驗證轉錄組數據Fig.10 Real-time fluorescence quantitative PCR of differential genes verified transcriptome data

3 討論

當植物處于低滲透環境時，可通過積累可溶性糖、可溶性蛋白等滲透調節物質，提高胞質濃度從而維持滲透勢以適應逆境［18］。可溶性糖和可溶性蛋白含量變化也常作為植物適應淹水環境的重要標志。項洪濤等［19］研究結果表明淹水脅迫引起幼苗期的小豆（Vigna angularis）根系可溶性蛋白及可溶性糖含量明顯提升。本研究淹水脅迫8 和24 h 后，鴨茅根系中可溶性糖和可溶性蛋白含量均明顯升高，說明可溶性糖和可溶性蛋白的積累對鴨茅維持細胞滲透勢，提高其耐淹能力具有重要作用。丙二醛和相對電導率是衡量細胞質膜過氧化和受損的重要指標，脅迫環境會引起植物細胞的活性氧水平失調，造成膜脂過氧化，細胞膜受損導致質膜透性增強，電解質外滲。其中，膜脂過氧化的產物為丙二醛，可使細胞膜蛋白和酶失活，從而影響細胞代謝［20］。李立婷等［21］研究發現隨著淹水脅迫程度的加深，流蘇樹（Chionanthus retusus）幼苗丙二醛含量和相對電導率呈上升趨勢。本研究中，隨著淹水脅迫時間的延長，丙二醛含量和相對電導率總體上也呈上升趨勢，表明長時間的淹水脅迫，損害了鴨茅根系的質膜穩定性。

植物在感受到逆境脅迫時，首先會在基因水平進行響應，通過調動大量基因共同編織成復雜調控網絡生產相應蛋白，以控制代謝物合成來調節植物體的機理平衡［13］。本研究對鴨茅淹水脅迫處理0、8 和24 h 后的根系進行轉錄水平分析，以|log2FC|≥1.5 且padj<0.05 作為篩選標準，淹水8 h 后，與0 h 對照相比在鴨茅根系中共獲得了5788 個差異基因，包括上調2872 個，下調2916 個。淹水24 h 后共獲得8807 個差異基因，包括上調4123 個，下調4684 個。GO 富集結果表明這些差異表達的基因可能在根系多糖代謝、微管結合、纖維素代謝過程、抗氧化反應等過程發揮重要作用。KEGG 富集結果顯示差異基因被顯著富集到了苯丙烷生物合成、碳代謝、氨基酸生物合成、淀粉和蔗糖代謝、糖酵解/糖異生和谷胱甘肽代謝等多個通路中。在葉片中，8 h 淹水脅迫下差異表達基因數量（1454 個）多于24 h 淹水脅迫（754 個）［15］，而在根中則相反，說明鴨茅葉片和根系在面對不同淹水脅迫時期具有不同的響應機制。葉片中差異基因富集的代謝通路主要涉及谷胱甘肽代謝和硒化合物代謝等，其中硒化合物代謝對葉片抗氧化系統和葉綠體的穩定具有積極作用［22］，可能是鴨茅葉片不同于根系響應淹水脅迫的機制之一。

碳水化合物是植物能量代謝的重要來源，植物體內的碳水化合物以結構性和非結構性碳水化合物的形式存在，木質素為結構性碳水化合物重要組成部分之一［23］。木質素也是植物細胞壁的重要組成部分，參與維管形成、水分和礦質運輸、抵御生物和非生物脅迫［24-25］。PAL 和CAD 分別是苯丙烷途徑的第一個步驟和合成木質醇最后一個步驟的酶，因此，一般認為PAL 和 CAD 是調節植物木質素合成的關鍵酶。楊野等［26］研究表明在鋁脅迫下小麥（Triticum aestivum）根系通過增加PAL、CAD 和過氧化物酶活性，促進細胞壁木質素的合成，使細胞木質化加快以響應脅迫。本研究鴨茅根系富集苯丙烷生物合成通路差異表達基因數量最多，且主要參與木質素的合成代謝途徑，而PLA1、C4H、4CL 和CAD 等木質素合成關鍵酶的相關基因在淹水脅迫下均顯著下調表達。這可能由于淹水環境下，鴨茅地上部分光合作用顯著降低，根系主要以無氧呼吸產生能量來維持生命活動，而無氧呼吸途徑對碳利用率遠低于有氧呼吸［27］，從而引發對非結構性碳水化合物的需求增加，如可溶性糖、淀粉等，尤其是葡萄糖。這可能導致更多磷酸烯醇式丙酮酸參與糖酵解途徑，而不是產生苯丙氨酸的莽草酸途徑，后者是合成木質素的前體物質［28］。另一方面，木質素、纖維素等結構性碳水化合物的合成是一個耗能且不可逆的過程［29-30］。因此，這可能是鴨茅根系在短期響應淹水脅迫中所采取的節能和節碳的策略之一。類似地，Wang 等［31］研究表明芝麻（Sesamum indicum）根系在遭受水澇脅迫后，苯丙烷類化合物合成相關基因下調表達，顯著減緩了次生代謝物的合成。Nguyen 等［32］研究澇害脅迫對不同抗宿根性小麥木質素生物合成影響時，發現澇害脅迫處理均顯著降低了小麥節間木質素的含量，并推測淹水脅迫條件下木質素含量降低可能受PAL6、CCR5、阿魏酸5-羥化酶2（ferulate 5-hydroxylase2，F5H2）相關基因的轉錄抑制調節。

本研究GO 注釋結果中，發現鴨茅根系淹水8 和24 h 差異基因在纖維素合成酶、細胞骨架蛋白、微管蛋白結合等條目中，相關基因大多數被顯著下調。纖維素、木質素是細胞壁的主要成分，而微管是細胞分裂、生長和分化過程的關鍵，并通過與微管相關蛋白協同形成細胞骨架來維持細胞的結構［32］，說明鴨茅根系在受到淹水脅迫時細胞壁合成可能受到抑制。類似地，淹水也導致大豆（Glycine max）中糖轉運蛋白、細胞壁相關合成基因下調表達［33］。細胞壁合成相關基因的下調表達意味著鴨茅根系細胞停止生長至凋落，可能是其通過控制細胞程序性凋亡，降解細胞壁形成空腔，從而有利于根系組織通氣，同時減少能量的消耗以緩解脅迫壓力［7，34］。Wang 等［35］前期利用組織切片觀察了淹水脅迫0、14 和28 d 的鴨茅根系顯微結構，發現14 d 時大部分鴨茅根皮層細胞分離形成細長縫隙，隨著脅迫的加劇，根部導管數量、維管直徑等均呈下降趨勢，細胞壁破壞且細胞骨架塌落，這也可能印證了這一假設。植物對淹水脅迫的適應包括兩種不同的策略，即“低氧靜默”策略（low-O2quiescence syndrome，LOQS）和“低氧逃逸”策略（low-O2escape syndrome，LOES）。“低氧靜默”策略即植物暫時減緩甚至停滯生長以保存能量，同時為減少能量消耗，一些生命過程如細胞分化和生長、細胞壁的形成也會減慢，從而延長在淹水脅迫下的生存時間。相反，“低氧逃逸”策略則植物通過主動形成通氣組織和不定根，莖伸長生長等來逃離淹水壓力［36］，如荷花（Nelumbo nucifera）在完全淹沒一段時間后，通過生出含有高密度通氣組織的薄葉片和拉長的葉柄，來緩解淹水壓力［8］。以上分析推測，鴨茅在響應淹水脅迫時可能主要采取“低氧靜默”策略，盡可能減少碳源和能量的消耗以延長在淹水脅迫下的存活時間，以便在澇害脅迫解除后恢復生長，這可能在不同種類植物中適應淹水脅迫的機制不同。

碳代謝是植物最重要的生理代謝途徑，它連通核酸、蛋白質、脂類和次生物質等多個代謝途徑，在植物抵御逆境脅迫，生長發育和代謝調控中發揮關鍵作用［23］。其中，糖酵解和發酵途徑是碳代謝的一個重要過程，在缺氧條件下，激活糖酵解和發酵途徑加速糖的分解以維持ATP 的生產，是植物能夠延長存活時間的關鍵。Zhang 等［37］對鳳丹（Paeonia osti）淹水脅迫下的轉錄組分析發現，參與糖酵解和發酵的編碼ADH、3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、PDC 和PK 的基因在澇害下明顯上調，而參與TCA 循環的編碼異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）和蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，MDH）的基因明顯下調。本研究兩個處理組的差異基因也均被極顯著富集到了碳代謝通路（P<0.001），進一步分析發現糖酵解和乙醇發酵途徑關鍵酶基因大多明顯上調，而催化丙酮酸生成乙酰輔酶A 的丙酮酸脫氫酶復合體（pyruvate dehydrogenase complex，PDC）相關基因明顯下調，說明淹水脅迫同樣促進鴨茅根系糖的無氧酵解，而抑制有氧呼吸進程，從而造成可溶性糖的積累，這與生理試驗結果一致。值得注意的是，在鴨茅葉片受短期淹水脅迫時，糖酵解相關基因的表達劇烈程度似乎略低于根系，Qiao 等［15］的研究中發現與糖酵解相關的基因，在淹水8 h 時僅2 個差異基因上調，9 個下調，24 h 時有4 個上調，2 個下調，而在根系中均具有較高表達水平。這可能由于在淹水初期，根系糖積累且缺氧時根系韌皮部運輸能力下降，根部和地上部分生長受抑。在這種條件下，葉中光同化物積累，可溶性糖生產量大于消耗量，可能造成可溶性糖的過度累積［38］。因此，這可能是鴨茅響應淹水缺氧脅迫時，根和葉平衡碳水化合物的一種負反饋調節機制。HXK 是磷酸化葡萄糖和果糖的關鍵酶，同時在糖信號和植物激素信號之間起著紐帶作用［39-40］，在植物響應逆境脅迫中，調節生理代謝過程具有重要作用。孫美紅［41］的研究結果表明外源添加葡萄糖可以提高MdHXK1介導的蘋果（Malus domestica）的耐鹽性。周玥［42］采用生物信息學方法在大豆中鑒定到17 個HXK 家族成員，且發現GmHXKs的啟動子含有脫落酸（abscisic acid，ABA）、生長素（indole-3-acetic acid，IAA）、赤霉素（gibberellin acid，GA）等植物激素響應原件，同時過表達GmHXK2能夠提高擬南芥（Arabidopsis thaliana）的耐鹽性。在HXK 介導的糖信號轉導過程中，高濃度的糖可觸發AtHXK1誘導ABA 水平升高，使細胞分裂暫停［43］。此外，低氧脅迫能夠刺激擬南芥中AtHXK2和AtHXK3的表達，以提高糖酵解和發酵速率來增強耐低氧性［44］。本研究中鴨茅根系HXK1、HXK2 合成基因DG6C04565、DG4C01020、DG4C01019均顯著上調且24 h 表達量顯著高于8 h。同時，乙醇脫氫酶ADH1 的合成基因DG7C02275、DG4C03415、DG4C03416、novel.7272在淹水8 和24 h 后平均上調了7.68 倍，說明淹水脅迫顯著刺激了鴨茅ADH 相關基因的高度表達。在獼猴桃（Actinidia Chinensis）［45］、大麥（Hordeum vulgare）［46］、黃瓜（Cucumis sativus）［47］、櫻桃（Cerasus sachalinensis）［48］中同樣發現淹水脅迫引起ADH 的高度表達。因此，綜合分析表明HXK1、HXK2、ADH1可能是提高鴨茅耐淹性的關鍵基因。未來有望通過調控這些基因的表達，激活糖代謝相關酶的活性，提高糖的分解效率，從而影響鴨茅在淹水脅迫下的耐受性。

植物在遭遇淹水等逆境脅迫時導致單線態氧（1O2）、超氧陰離子（·O2-）、過氧化氫（H2O2）和羥 基自由基（·OH）等活性氧積累，從而造成膜脂過氧化，嚴重損傷植物細胞［49］。抗氧化物質和抗氧化酶組成的抗氧化防御系統是植物清除過量的ROS，保護植物體免受氧化應激的重要機制［50］。酶促抗氧化系統中，GST 是谷胱甘肽代謝途徑的關鍵酶，GST 可以催化GSH 與親電底物共價結合并轉移至質體或液泡，以及催化H2O2使GSH 轉化為氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG），從而緩解細胞受損［51-52］。在大腸桿菌中過表達牧豆樹（Prosopis juliflora）的PjGSTU1基因，發現PjGSTU1同時具有GSH 轉移酶以及GSH 過氧化物酶活性，煙草（Nicotiana tabacum）中過表達PjGSTU1，在干旱脅迫中提高了其清除ROS 的能力［53］。Zeng 等［54］研究耐澇型“M12”和澇敏型“M25”紫花苜蓿響應澇害脅迫機制時，發現5 個GST 相關基因在“M12”和“M25”品種中均高度表達，且在“M12”中表達量更高，表明GST 的高表達可能是增強紫花苜蓿耐澇性的重要因素。類似地，在大麥濕害脅迫12 和48 h 后GST 相關基因均上調表達［46］。本研究在谷胱甘肽代謝通路共富集到58 個差異基因，其中GST 相關基因就包含了48 個，GST 家族成員中AtGSTF13、EDR9、GSTL2、GSTL3、GSTU8、GSTU16、GSTU18、GSTU19和GSTU25的21 個相關基因在受到淹水脅迫刺激后均被顯著誘導表達。因此，可以認為在鴨茅遭受澇害脅迫時GST 高度表達，對緩解氧化應激反應起著重要作用。此外，本研究中也發現APX2的編碼基因DG1C00313在淹水8 和24 h 上調了1.78 和1.41 倍，APX 在抗壞血酸-GSH 循環途徑中分解超氧化物生成的H2O2，并產生單脫氫抗壞血酸，從而防御ROS 及清除逆境導致的過量H2O2［51］。類似地，歐洲油菜（Brassica napus）在高溫脅迫時APX2的同源基因劇烈響應，玉米在PEG6000 脅迫下葉片中ZmAPX2表達量最高，相比對照提高了4.3 倍。因此，說明APX2可能也是鴨茅根系低氧環境下氧化應激的重要緩解因子［55］。

TFs 是一類DNA 結合蛋白，通過與啟動子中的順式元件特異性結合來促進或者抑制目標基因的表達，在多個生物學過程，如生長發育、細胞周期調節、轉錄調節和對環境脅迫的響應中扮演著關鍵角色［56］。許多TF 家族，包括MYB、ARC、WRKY、GRAS 和AP2 被證明在植物響應非生物脅迫時起著關鍵作用［33，57］，本研究篩選出了MYB、NB-ARC、WRKY、GRAS 和AP2 成員數目較多的5 個TFs 家族，推測它們可能在鴨茅根系響應淹水過程中起重要作用。其中，MYB 是植物中成員較多的一類轉錄因子，具有高度保守的MYB 結構域，其成員參與植物生育周期和多種逆境響應的調控，任明輝等［58］對干旱脅迫下紫花苜蓿中MYB 的調控作用研究發現，MsMYB12，MsMYB45，MsMYB52，MsMYB73等9 個R2R3-MYB 成員可能在提高紫花苜蓿的耐旱性中發揮研究作用。也有研究表明，水稻（Oryza sativa）OsMYBS3基因可以降低對 ABA 的敏感性以提高低溫、冷害的耐受性，OsMYB2也被證明與水稻的耐寒性有關［59］。此外，MYB 轉錄因子也參與調控苯丙烷通路中花青素、木質素和類黃酮合成途徑的特定結構基因表達，如GmMYB176可增強大豆在脅迫期間的類黃酮生物合成，以響應逆境脅迫［60］。Karpinska 等［61］研究發現在楊樹（Populus tremula）中降低PttMYB21a基因的表達，韌皮部中咖啡酰-CoA 3-O-甲基轉移酶（caffeoyl-CoA 3-O-methyltransferase，CCoAOMT）轉錄水平更高，且木質素含量增加，從而說明PttMYB21a可能是轉錄抑制因子。本研究鴨茅根系在淹水8 和24 h 中MYB 轉錄因子均有顯著差異表達，且在24 h 差異表達的數量更多，表明MYB 轉錄因子在鴨茅抵御脅迫時可能在調控苯丙烷生物合成、信號轉導多個途徑中發揮著重要作用，其具體作用機制也值得未來進一步探究。GRAS同樣也是植物特有的一類轉錄因子，參與調控脅迫響應、信號轉導、生長發育等多個生物學過程［62］。WRKY、NB-ARC、AP2 等轉錄因子同樣在植物響應多種逆境途徑中發揮重要作用。譚胤靜等［63］通過轉錄組鑒定北美鵝掌楸（Liriodendron tulipifera）淹水4 d 后葉片中的轉錄因子，發現NAC、WRKY、AP2/ERF等基因淹水脅迫后普遍上調表達，且WRKY、AP2/ERF在耐淹北美鵝掌楸中上調基因數更多。AP2 是植物特有的一類轉錄因子家族，在進化上屬于AP2/ERF 的一個亞家族。Xu 等［64］對AP2/ERF在鴨茅中的表達譜和潛在功能等研究發現，DgERFs 在鴨茅不同組織特異性表達，且在根系中表達相對較多，同時表明DgERF053、DgERF175等DgERF 家族成員可能與鴨茅響應鹽、熱和干旱脅迫有關。隨著淹水時間的加長，鴨茅更多AP2 的編碼基因差異表達，且在24 h 時，上調基因多于下調基因，推斷AP2 轉錄因子的上調表達可能在鴨茅根系抵御淹水導致的低氧脅迫中具有積極作用。

4 結論

本研究對不同時間淹水脅迫處理下的鴨茅根系生理和轉錄組進行了分析。結果表明，淹水脅迫可引起鴨茅根系中可溶性糖和可溶性蛋白含量增加，長時間淹水也導致根系相對電導率和細胞膜傷害率增加。在淹水脅迫8 和24 h（相較于0 h）分別篩選出了5788 和8807 個差異表達基因。差異基因功能富集分析表明，苯丙烷生物合成、碳代謝、谷胱甘肽代謝、多糖代謝等通路是鴨茅抵御淹水脅迫的重要調控途徑。MYB、NB-ARC、WRKY、GRAS 和AP2 等是鴨茅根系抵御淹水脅迫的重要轉錄因子。本研究初步解釋了鴨茅根系響應淹水脅迫的分子機制，為后續研究鴨茅耐淹基因的功能提供了數據支撐。