基于硅基過濾片的精子優選芯片設計與優化

李金坤，童先宏，江小華，周典法，魏 鈺，周成剛，

（1.中國科學技術大學 微電子學院，安徽 合肥 230026；2.中國科學技術大學附屬第一醫院（安徽省立醫院）生殖中心，安徽 合肥 230001；3.中國科學技術大學微納研究與制造中心，安徽 合肥 230026）

0 引言

隨著生存環境和生理條件的變化，男性不育率逐年增加，人類對輔助生殖技術（assisted reproduction technology，ART）的應用需求日益增長［1］。自1978年首例試管嬰兒誕生以來，在全球約有800 萬嬰兒是借助ART 誕生的，并且新生兒數量每年都在持續增加［2］。宮腔內人工授精（intrauterine insemination，IUI）和體外受精（in vitro fertilization／intracytoplasmic sperm injection，IVF／ICSI）技術已成為治療不孕癥的有效手段［3～5］。健康精子的選擇對于ART 至關重要，它既影響ART的成功率，又影響后代健康。

在ART中，精液處理方法主要有密度梯度離心法和直接上游法。這些方法均使用了離心富集精子的步驟，離心會產生活性氧（reactive oxygen species，ROS），導致精子過氧化損傷，影響DNA碎片率（DNA fragmentation index，DFI）并損害精子功能［6～9］。過多的ROS含量，還會引起精子質量降低而影響精卵結合，可能降低ART 成功率［10～13］。近些年，隨著微納米制造技術的發展涌現許多新技術，如微流控、電泳技術等，消除了離心步驟，可以選擇具有較低的DFI、更高活力的精子，并改善了ART結果［14］，但這些設備的精液處理的吞吐量低，因此限制了他們在生殖醫學臨床的應用［15～18］。

為了解決傳統精子優選和當前微流控精子優選方法的局限性，本文構建了一種基于微孔過濾片的精子優選微流控設備，通過對硅基過濾片的孔間距和優選時間進行優化，利用高活力的健康精子可以抵抗重力，在微孔的引導下游向樣本收集腔，提供了一種可以從未處理的精液樣本中高通量地分離出高活力、高DNA完整性和高形態正常率精子的優選方法，可滿足ART臨床需要。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

1.1.1 精液樣本

本文研究所用精液樣本全部來自安徽省立醫院生殖中心就診的男性患者，共20 例，年齡22～48 歲，禁欲3～7天，患者通過手淫方式取精于干燥無菌取精杯中，置于37 ℃水浴箱內30 min 后液化，實驗在液化后10 min 內進行。納入標準：按WHO 標準，精液量≥2 mL，精液密度≥15×106（百萬個／mL），正常形態率≥4%。排除標準：少弱精癥或畸形精子癥患者的精液。

1.1.2 試劑與儀器

人類輸卵管液（human tube fluid，HTF）（M1130，南京愛貝生科技有限公司）；聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）（Sylgard 184，Dow Corning）；精子形態檢測試劑盒（快速染色法，安科生物）；精子DNA碎片染色試劑盒（流式細胞法，浙江星博生物科技股份有限公司）；接觸式紫外光刻機（MABA6，Karl Suss）；磁控濺射（LAB 18，Kurt J.Lesker）；反應離子刻蝕機（PlasmaPro NGP 80，Oxford）；等離子清洗機（PTL-VM500，PTL電氣科技）。

1.2 實驗方法

1.2.1 硅基過濾片設計與加工

利用標準的光刻技術，在表面覆蓋100～200 nm 的氮化硅（Si3N4）片的正反兩面先后進行光刻顯影與干法刻蝕。硅片正面光刻圖形為直徑10 μm的圓形孔陣列，背面套刻圖形為邊長為10mm 的正方形陣列。用黑蠟涂覆硅片正面，保護正面圖形，然后將硅片放入氫氧化鉀（KOH）溶液中，從背面正方形窗口進行濕法刻蝕。預留約80 μm 厚的硅薄膜，再使用干法刻蝕從正面將微米（μm）級的孔陣列刻穿，最后用激光將硅片劃成15 mm×15 mm 獨立的過濾片。硅基過濾片掩模版及實物如圖1所示。硅基過濾片的孔徑固定為10 μm，通過改變孔的邊緣距離（孔間距），進而改變過濾片的通量。

圖1 硅基過濾片示意

圖1（a）為硅基過濾片掩模版，硅基過濾片過濾膜部分為邊長11 000 μm的正方形，有微孔部分為邊長10 000 μm的正方形，其中過濾片微孔的孔徑固定為10 μm，孔間距分別為4，6，10 μm，3 種不同孔間距的過濾片通量比為即40∶35∶28，即使最大孔間距10 μm的過濾片也有25萬個微孔。在微孔全部導通的情況下，單位時間內最高可處理25萬個精子。

1.2.2 PDMS芯片設計

根據所設計的PDMS器件，使用數控機床加工聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate，PMMA）—鋁（Al）模具，然后將適量PDMS前聚合物和固化劑按照10∶1 體積比混合，充分攪拌后，用真空泵去除氣泡。將混合后PDMS緩慢地澆筑在模具中，放置在75 ℃烤箱中。2 h 后，PDMS 固化成型，將PDMS從模具中取出，然后使用氧等離子體分別處理PDMS、硅基過濾片和玻璃基底表面，再進行鍵合。鍵合后的PDMS芯片原理如圖2所示。

圖2 PDMS芯片結構示意

由圖2可知，精子優選芯片由PDMS、硅基過濾片和玻璃基底3部分組成，PDMS 與玻璃基底鍵合形成水平通道。硅基過濾片水平放置，將精液腔室分成精液存儲池和精液收集池。圖中尺寸標注單位為mm。

1.2.3 精子活力篩選時間優化

在收集池中加入400 μL 的HTF，精液液化后，混勻等分為4組，4組精液按同樣標準處理。取500 μL 液化后的精液樣本，緩慢加入精子優選芯片的進樣池，精液液面至硅基過濾片下表面，加樣期間避免氣泡產生。將帶有精液樣品和HTF的芯片水平放入37℃恒溫箱中靜置，分別于7，15，30，60 min，從收集池取20 μL 精液樣本，精液樣本參照《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊（第五版）》的標準進行處理，使用計算機輔助精子分析（computer-assissted sperm analysis，CASA）系統進行精液常規分析，每次每組實驗重復3次。

1.2.4 過濾片孔間距優化

選取最優精子活力篩選時間（15 min），用于芯片的過濾片孔間距優化，分別在過濾片孔間距為4，6，10 μm 的芯片的收集池加入400 μL的HTF，然后在進樣池加入500 μL精液。將芯片放入37 ℃恒溫箱中，經過15 min，在收集池取20 μL精液樣本進行精液常規分析，每次每組實驗重復3次。

1.2.5 精子形態學染色

使用精子形態學快速染色液（Diff-Quik 法）對精子形態染色。評估200個沒有重疊的完整精子，對每個精子的各個部位進行仔細觀察，嚴格區分正常與缺陷的精子。

1.2.6 精子DFI分析

所用精子DNA碎片染色試劑盒是一種基于流式細胞術的精子DNA完整性檢測技術，實驗操作步驟嚴格按照試劑盒說明書實施。精液經過酸化變質處理，去除核蛋白，保留精子DNA部分。經過酸處理的精子和細胞核在丫啶橙染色后，異常的單鏈DNA結構與染料結合發出紅色熒光，正常的雙鏈DNA結構與染料結合發出綠色熒光，最終通過流式細胞儀讀取比例得出結果。

1.2.7 分組設計

每份精液收集液化后，完成精液常規檢查和形態學分析，符合納入標準的精液等分為4份。

1.2.8 觀察指標

獲得足夠多且活力高的精子是精子篩選實驗的主要目的，因此實驗結果主要從這兩方面進行評估：1）收集池精子活力＝（收集池前向運動精子數目／收集池總精子數目）×100%；2）收集池活動精子回收率＝（1 mL 收集池樣本中前向運動精子數量／1 mL進樣池樣本中前向運動精子數量）×100%。其中，收集池精子活力可以使用精液常規參數中前向運動精子百分比表示，收集池活動精子回收率計算方法為：［（收集池前向運動精子百分比×收集池精子濃度×收集池體積）／（進樣池前向運動精子百分比×進樣池精子濃度×精液體積）］×100%。

1.2.9 統計學處理

采用SPSS24.0統計軟件進行數據處理與統計分析，呈正態分布、方差齊的計量數據以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著差異t 檢驗（LSD－t），P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與討論

2.1 精子活力篩選與篩選時間優化結果

通過硅基過濾片的精子優選，精子活力明顯升高，但隨著上游時間的延長，收集池中精子活力逐漸下降，且差異有統計學意義（F ＝22.894，P ＜0.05）。如圖3 所示，實驗開始7 min后，精子活力從原液的（36.99 ± 3.08）%上升到（88.68 ±3.40）%，60 min 時，精子活力下降至（78.43 ±2.43）%；但前向運動精子回收率明顯升高，前向運動精子回收率從7 min時為（5.79 ±3.71）%，60 min 時為（62.58 ±18.05）%，但15 min和30 min的活動精子回收率數據之間的差異無統計學意義。綜合考慮精子活力和活動精子回收率，因此15 min為理想的精子的優選時間。

圖3 收集池精子活力和活動精子回收率隨時間的變化

2.2 精子活力篩選與過濾孔間距優化結果

使用孔間距分別為4，6，10 μm 3 種規格的過濾片進行精子活力和回收率的優選實驗。將芯片放置在恒溫箱保溫15 min后進行精液常規檢測和活動精子回收率的計算。3種規格芯片的回收率分別為（39.79 ± 12.06）%、（37.26 ±19.73）%、（21.71 ±8.91）%，各組數據差異有統計學意義（F ＝7.63，P ＜0.05）。優化結果如圖4 所示，從圖中可以看出，精子活力隨著硅基過濾片孔間距的增大而升高，而活動精子回收率隨著過濾片孔間距的增大而逐漸降低，且各組數據之間有統計學差異。綜合考慮收集池精子活力和活動精子回收率，從3 種規格的過濾片中選擇6 μm孔間距的過濾片作為最優的精子篩選器件。

圖4 收集池精子活力和活動精子回收率隨過濾片孔間距的變化

2.3 優選后精子形態和DFI分析結果

選擇6 μm孔間距過濾片的精子優選芯片進行精子篩選實驗，在篩選15 min后，對收集池的精子DFI和精子形態正常率進行分析。未篩選的精液樣本DFI 為（20.86 ±2.61）%，篩選后收集池中精液DFI降低至（6.77 ±0.64）%，兩組數據差異有統計學意義（t ＝9.087，P ＜0.05）。篩選前精液樣本中精子形態正常率為（10.33 ±5.69）%，篩選后形態正常率提高至（58.00 ±12.00）%，兩組數據差異有統計學意義（t ＝－6.217，P ＜0.05）。該實驗裝置篩選后的精子具有較低的DFI和較高的形態正常率，如圖5 所示。其中，圖5（c）、（d）為精子染色后使用40倍油鏡觀察圖。

圖5 優選后精子DNA碎片和形態分析

2.4 結果討論

實驗結果顯示，使用硅基過濾片可以對精子質量進行有效篩選，篩選后的精子具有更高的活力、DNA 完整性和形態正常率。精子活力、數量與DFI和形態正常率呈一定的相關性［19］，相比于未經篩選的精液樣本，收集池中的高活力精子的DFI降低，形態正常率得到提升。硅基過濾片的孔間距對篩選后的精子活力和活動精子回收率有明顯影響。

篩選時間和過濾片孔間距對精子活力和活動精子回收率的影響是相互制約的。較長的篩選時間，允許更多的活動精子通過過濾片，但是同時也有一些低活力精子被帶入到收集池，所以相比于15 min，30 min的活動精子回收率較高，但精子活力有所下降。較小的孔間距意味著在相同面積的硅基過濾片上有更多的微孔，這允許更多的精子通過過濾片，所以在相同時間內收集池中會有更多的活動精子，但較小的孔間距同時也增大了低活力精子被帶入收集池中的風險。所以相比于4 μm的孔間距的過濾片，使用10 μm的過濾片收集的精子具有更高的活力值，但回收率較低。

3 結論

本文開發了一種簡單的微流控精子優選芯片，該芯片利用過濾片中數十萬微米尺度的小孔，高活力精子會克服重力穿過微孔，游向精子收集池。使用該方法可以從液化后的精液樣本中優選出具有高活力、高DNA完整性和高形態正常率的精子。根據精子活力和活動精子回收率兩項標準，對精子篩選時間和硅基過濾片的孔間距進行了優化，確定了一般情況下的最優篩選時間為15 min，過濾片孔間距為6 μm。

綜上，利用該精子優選芯片可以有效地篩選出足夠多的前向運動的精子。篩選后的精子同時具有較高的DNA完整性和形態正常率。芯片精液吞吐量大，活動精子回收率較高具有一定的臨床應用價值，為后續進行體外受精實驗奠定基礎。