金屬離子對黑翅土白蟻消化代謝的影響

漆夢雯，沈 毅，羊桂英，余 婷，李吳晗，周琪歡，謝曉俊，朱婭寧，莫建初

（浙江大學(xué) 昆蟲科學(xué)研究所 農(nóng)業(yè)部作物病蟲害分子生物學(xué)重點實驗室，浙江 杭州 310058）

中國每天產(chǎn)生約5 萬t 廚余垃圾，占城市生活垃圾的40%～60%[1]。現(xiàn)有的廚余垃圾處理模式中，飼料化的環(huán)境效應(yīng)最好且成本效益高[2]。利用資源昆蟲進(jìn)行垃圾處理是目前廚余垃圾資源化利用的研究熱點，擬黑多刺蟻Polyrhachisvicina幼蟻、黑水虻Hermetiaillucens、黃粉蟲Tenebriomolitor等昆蟲均可以作為資源昆蟲處理垃圾[3-5]。黑水虻可有效分解廚余垃圾并將其轉(zhuǎn)化為油脂和蛋白質(zhì)等高價值生物質(zhì)[6]，黃粉蟲幼蟲對廚余垃圾的利用率可達(dá)38.88%[7]。廚余垃圾含有一定量的金屬元素，一般較難對其進(jìn)行有效處理[8-10]。有研究表明：白蟻與微生物的共同作用，可使木質(zhì)纖維素材料得到高效的利用[11]，據(jù)統(tǒng)計，白蟻1 a 可以消耗30～70 億t 木質(zhì)纖維素[12]。白蟻還可以通過取食腐爛的有機(jī)物和木材，富集重金屬[13]。在培菌白蟻腸道和菌圃中存在不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的金屬離子，這些金屬離子可能對腸道共生微生物和木質(zhì)纖維素降解酶的活力有一定影響[14-16]。白蟻腸道系統(tǒng)中許多種酶需要與某些金屬離子相結(jié)合，來實現(xiàn)其催化活性，這些酶的催化活性在許多生物過程中起到至關(guān)重要的作用，例如產(chǎn)氫過程、呼吸過程和碳水化合物水解過程等[17-18]。

黑翅土白蟻Odontotermesformosanus對林木、綠化、堤壩等具有嚴(yán)重危害性，但同時也是一種重要的資源昆蟲，在自然環(huán)境下，它可以高效降解木質(zhì)纖維素[19]。黑翅土白蟻是否具有處理廚余垃圾的潛力目前尚不明確。本研究擬探究食物中含有的Al3+、Ca2+、Fe3+和Mg2+對黑翅土白蟻消化代謝的影響，為生產(chǎn)上仿生利用黑翅土白蟻來處理農(nóng)林廢棄物和廚余垃圾提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

供試黑翅土白蟻蟻巢采自福建省三明市大田縣，帶回室內(nèi)在26 ℃避光條件下饑餓3 d 后供處理。供試餌料為桂花Osmanthusfragrans枯枝木屑，采自浙江大學(xué)紫金港校區(qū)校友林，在80 ℃烘箱內(nèi)烘48 h，研磨過20 目篩；在100 ℃烘箱內(nèi)烘24 h 后備用。無水三氯化鋁、無水氯化鈣、無水三氯化鐵和無水硫酸鎂均為分析純，購自滬試國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。漆酶(laccase)和纖維素酶(cellulase)試劑盒購自蘇州夢犀生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 金屬離子最大可取食質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定 將無水三氯化鋁用去離子水稀釋至100.00、10.00、1.00、0.10、0.01 g·L-15 個質(zhì)量濃度，以去離子水為對照(ck)。每個處理取10.00 mL，分別與10 g 木屑混合均勻，靜置24 h 后置于80 ℃烘箱中烘干48 h，得到含有Al3+質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為100.00、10.00、1.00、0.10、0.01 g·kg-1的5 組Al3+餌料處理組和ck 餌料。將餌料分別裝入1.50 mL 離心管中并壓實，用電子天平稱量獲得餌料質(zhì)量。取3 個直徑一致的蟻巢，在每個蟻巢中同時放入6 組餌料。15 d 后取出離心管，80 ℃烘干至恒量，去除泥土后稱量剩余餌料質(zhì)量，計算取食率，取平均值。與對照組無顯著差異的Al3+最大質(zhì)量分?jǐn)?shù)為黑翅土白蟻對該金屬離子的最大可取食質(zhì)量分?jǐn)?shù)。其他3 種金屬離子的最大可取食質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定同上。分別以含最大可取食質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Al3+、Ca2+、Fe3+、Mg2+餌料飼喂黑翅土白蟻，共4 個處理組，以去離子水處理的餌料為對照(ck)，設(shè)3 次重復(fù)，持續(xù)飼喂30 d。

1.2.2 蟲體金屬元素測定 參考LI 等[16]的方法。在蟻巢中隨機(jī)挑選10 只體長為0.45±0.05 mm 的低齡工蟻置于PTFE 燒杯中，加入5.00 mL 濃硝酸后，用封口膜密封，依次于80 ℃加熱盤上加熱1.0 h，160 ℃加熱1.5 h，蒸發(fā)約0.50 mL。用孔徑為0.22 μm 的水系濾膜過濾，取0.75 mL 濾液用去離子水定容至25.00 mL，得到體積分?jǐn)?shù)約3%的濃硝酸稀釋液。每個處理重復(fù)3 次，使用電感耦合等離子發(fā)射光譜儀測定金屬元素。

1.2.3 菌圃金屬元素測定 參考TOYAMA-KATO 等[20]的方法。稱取0.1 g 上層菌圃于PTFE 燒杯中，加入1.00 mL 濃硝酸后，用封口膜進(jìn)行密封。置于60 ℃加熱盤上加熱4.0 h 后向燒杯內(nèi)加入1.00 mL 濃硝酸，再依次在加熱盤75 ℃加熱0.5 h，130 ℃加熱0.5 h，最后200 ℃加熱0.5 h。冷卻后向燒杯內(nèi)加入10.00 mL 濃硝酸復(fù)溶，用孔徑為0.22 μm 的水系濾膜進(jìn)行過濾，后續(xù)處理同1.2.2。

1.2.4 漆酶與纖維素酶活力測定 采用分光光度法對黑翅土白蟻工蟻及新建菌圃中的漆酶和纖維素酶活力進(jìn)行測定，參照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，使用SPSS 26 進(jìn)行單因素方差分析，采用LSD 法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 4 種金屬離子處理餌料最大可取食質(zhì)量分?jǐn)?shù)

黑翅土白蟻對含Al3+、Ca2+和Fe3+餌料的最大可取食質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為1.00 g·kg-1，對含Mg2+餌料的最大可取食質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.00 g·kg-1(圖1)。對Al3+、Ca2+、Fe3+和Mg2+4 種金屬離子而言，黑翅土白蟻總體上偏好取食質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低的餌料。同時，在供試的4 種金屬離子中，黑翅土白蟻對Mg2+的接受程度最高。

圖1 黑翅土白蟻對不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)金屬離子處理餌料的取食率Figure 1 Bait consumption rate of O.formosanus treated with different mass fraction of metal ions

2.2 黑翅土白蟻蟲體內(nèi)相關(guān)金屬元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)

取食含有1.00 g·kg-1Al3+、Ca2+或Fe3+的餌料后，黑翅土白蟻蟲體對應(yīng)的金屬元素Al、Ca 和Fe 質(zhì)量分?jǐn)?shù)與ck 之間無顯著差異(圖2A～C)。取食含有1.00 g·kg-1Ca2+的餌料后，黑翅土白蟻蟲體內(nèi)Al 質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，與ck 差異顯著(P＜0.05)。由圖2D 可見：取食含有10.00 g·kg-1Mg2+餌料后，黑翅土白蟻蟲體內(nèi)Mg 質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為6.18 mg·g-1，與ck 和取食其他3 種金屬元素的均差異顯著(P＜0.05)。說明只有取食含有10.00 g·kg-1Mg2+的餌料，Mg 會在黑翅土白蟻體內(nèi)富集，而其他3 種金屬元素不會在黑翅土白蟻體內(nèi)富集。

圖2 餌料飼喂后黑翅土白蟻蟲體內(nèi)金屬元素Al、Ca、Fe 和Mg 質(zhì)量分?jǐn)?shù)Figure 2 Mass fraction of metal elements Al, Ca, Fe and Mg in the body of O.formosanus after feeding with baits

2.3 新建菌圃內(nèi)相關(guān)金屬元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)

取食含有1.00 g·kg-1Al3+或Ca2+的餌料后，其菌圃內(nèi)對應(yīng)的金屬元素Al 和Ca 質(zhì)量分?jǐn)?shù)與ck 之間無顯著差異(圖3A～B)。取食含有1.00 g·kg-1Fe3+或含有10.00 g·kg-1Mg2+的餌料后，菌圃內(nèi)對應(yīng)的Fe 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.29 mg·g-1，Mg 為2.52 mg·g-1，均顯著高于ck (P＜0.05)(圖3C～D)。其中取食含有10.00 g·kg-1Mg2+餌料后菌圃內(nèi)的Al 質(zhì)量分?jǐn)?shù)較ck 顯著提高(P＜0.05)，取食含有1.00 g·kg-1Al3+、Ca2+、Fe3+的餌料后，菌圃中Mg 質(zhì)量分?jǐn)?shù)較ck 顯著降低(P＜0.05)。說明取食含金屬離子的餌料對黑翅土白蟻新建菌圃內(nèi)相應(yīng)金屬元素質(zhì)量分?jǐn)?shù)有一定影響。就本研究而言，黑翅土白蟻取食含有1.00 g·kg-1Fe3+或含有10.00 g·kg-1·Mg2+餌料后，對應(yīng)的金屬元素Fe 和Mg 會在菌圃中富集。

圖3 餌料飼喂后新建菌圃內(nèi)金屬元素Al、Ca、Fe 和Mg 質(zhì)量分?jǐn)?shù)Figure 3 Mass fraction of metal elements Al, Ca, Fe and Mg in new-built fungus combs after feeding with baits

2.4 黑翅土白蟻蟲體內(nèi)及新建菌圃內(nèi)漆酶和纖維素酶活性

表1 數(shù)據(jù)表明：1.00 g·kg-1Al3+、Ca2+和Fe3+顯著促進(jìn)了黑翅土白蟻蟲體內(nèi)的漆酶活性(P＜0.05)，說明上述質(zhì)量分?jǐn)?shù)的3 種金屬離子可提高白蟻的木質(zhì)素降解能力；1.00 g·kg-1Fe3+顯著抑制了新建菌圃內(nèi)的漆酶活性(P＜0.05)，其酶活性僅為62.91 nmol·g-1·min-1，但被攝入食物中的10.00 g·kg-1Mg2+顯著促進(jìn)(P＜0.05)，酶活性達(dá)到了419.65 nmol·g-1·min-1，說明Fe 在菌圃富集會降低菌圃微生物的木質(zhì)素降解能力，而Mg 正好相反。1.00 g·kg-1Ca2+和Fe3+顯著抑制了黑翅土白蟻蟲體內(nèi)的纖維素酶活性(P＜0.05)，但10.00 g·kg-1Mg2+則對該酶起到顯著促進(jìn)作用(P＜0.05)，說明不同金屬離子在白蟻體內(nèi)可能存在競爭關(guān)系，且Mg 的富集會提高黑翅土白蟻蟲體內(nèi)的纖維素降解能力。1.00 g·kg-1Fe3+顯著促進(jìn)了新建菌圃中的纖維素酶活性(P＜0.05)，其酶活性為1 098.77 μg·g-1·min-1，但10.00 g·kg-1Mg2+顯著抑制了新建菌圃中的纖維素酶活性(P＜0.05)，其酶活性為745.40 μg·g-1·min-1。說明Fe 在菌圃富集會提高菌圃微生物的纖維素降解能力，而Mg 在菌圃富集則會降低菌圃微生物的纖維素降解能力。

表1 黑翅土白蟻蟲體內(nèi)及新建菌圃內(nèi)漆酶和纖維素酶活性Table 1 Activities of laccase and cellulase in the body of O.formosanus and in new-built fungus combs

3 討論

白蟻富含蛋白質(zhì)、維生素和許多必需的礦物質(zhì)元素[21]，可以食用；培菌白蟻的共生真菌蟻巢傘，味道鮮美，營養(yǎng)價值高，研究還發(fā)現(xiàn)蟻巢傘屬真菌具有鎮(zhèn)痛抗炎、防癌抗癌、降血脂及抗氧化等藥理作用和生物功能活性[22]。在本研究中，取食含有1.00 g·kg-1Al3+、Ca2+、Fe3+或10.00 g·kg-1Mg2+的餌料后，黑翅土白蟻仍可進(jìn)行正常的生理活動并構(gòu)建菌圃，由此可以看出黑翅土白蟻具有處理含有一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)金屬離子的廚余垃圾和農(nóng)林廢棄物的潛力。

培菌白蟻可以在腸道微生物的幫助下有效分解木質(zhì)纖維素，菌圃內(nèi)的細(xì)菌[23]可以通過產(chǎn)生包括纖維素酶在內(nèi)的大量降解木質(zhì)纖維素的酶，來實現(xiàn)與蟻巢傘協(xié)同降解木質(zhì)纖維素的功能[24]。培菌白蟻的共生蟻巢傘可以產(chǎn)生纖維素酶、果膠質(zhì)水解酶類、木聚糖酶等，同時也能產(chǎn)生與木質(zhì)素分解有關(guān)的漆酶，培菌白蟻可以利用共生蟻巢傘高效降解木質(zhì)纖維素[25-26]。LI 等[27]發(fā)現(xiàn)Al3+對解淀粉芽孢桿菌漆酶活性有促進(jìn)作用，與本研究中1.00 g·kg-1Al3+能夠促進(jìn)黑翅土白蟻蟲體內(nèi)的漆酶活性結(jié)果一致，在餌料中添加1.00 g·kg-1Al3+有利于提高黑翅土白蟻及其菌圃微生物聯(lián)合降解木質(zhì)素的能力，而不會顯著影響纖維素降解能力，對黑翅土白蟻的資源性利用具有現(xiàn)實意義。肖東來等[28]研究發(fā)現(xiàn)Mg2+對香菇Lentinuda edodes羧甲基纖維素酶活性具有激活作用，而WANG 等[29]的研究結(jié)果表明較高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Mg2＋能夠抑制黃粉蟲纖維素酶活力。在本研究中，10.00 g·kg-1Mg2+抑制了菌圃內(nèi)的纖維素酶活性，卻促進(jìn)了黑翅土白蟻蟲體內(nèi)的纖維素酶活性，一方面是因為同種金屬離子對不同來源的同一類酶的影響程度可能不同[30]；另一方面，LI 等[19]的研究已經(jīng)證實白蟻和菌圃微生物對木質(zhì)素的降解具有互補性，推測黑翅土白蟻能夠通過自身和菌圃微生物對木質(zhì)纖維素降解的互補性來抵抗一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)金屬離子的負(fù)面影響，有關(guān)金屬離子對木質(zhì)纖維素降解酶的聯(lián)合影響有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究確定了黑翅土白蟻對餌料中Al3+、Ca2+和Fe3+的最大可取食質(zhì)量分?jǐn)?shù)均為1.00 g·kg-1，對餌料中Mg2+的最大可取食質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.00 g·kg-1。金屬元素Mg 能夠在黑翅土白蟻蟲體內(nèi)和菌圃內(nèi)富集，不同金屬離子對黑翅土白蟻蟲體和菌圃內(nèi)漆酶和纖維素酶活性的影響不同，其中1.00 g·kg-1Al3+可以提高黑翅土白蟻及其菌圃微生物聯(lián)合降解木質(zhì)素的能力。黑翅土白蟻具有對含有金屬離子的廚余垃圾和農(nóng)林廢棄物進(jìn)行資源化處理的應(yīng)用潛力，今后需要進(jìn)一步研究混合金屬離子對黑翅土白蟻消化代謝的影響，以推動其資源化處理廚余垃圾和農(nóng)林廢棄物的實際應(yīng)用。