附子多糖的提取純化、結構表征及其對RAW 264.7巨噬細胞免疫活性的影響

摘要：目的 探討附子多糖（Aconiti Lateralis Radix Praeparata polysaccharide， ACP）的結構特征及其對RAW264.7細胞的免疫活性影響。方法 采用水提醇沉的方法獲得附子粗多糖，通過陰離子交換色譜柱和分子篩凝膠色譜柱對附子粗多糖進行分離、純化，獲得ACP。采用高效凝膠滲透色譜法測定ACP的分子量分布；采用離子色譜法測定ACP的單糖組成；采用甲基化實驗及核磁圖譜解析ACP的糖苷鍵類型及多糖一級結構。最后，通過體外細胞實驗，測定ACP對于RAW 264.7細胞的作用。結果與結論 從附子中分離得到一種分子量為11.37 kDa的均一多糖，該多糖主要由葡萄糖組成，且以→4）-Glcp-（1→糖苷鍵為主鏈的結構，端基Glcp-（1→為支鏈經→4，6）-Glcp-（1→的O-6鏈接到主鏈。體外細胞實驗結果表明，ACP能夠促進誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、白介素-1β（IL-1β）、IL-6及腫瘤壞死因子（TNF-α）分泌，具有一定的免疫活性。

關鍵詞：附子；多糖；結構表征；免疫活性；葡聚糖；RAW 264.7細胞

中圖分類號：R932 文獻標志碼：A

Extraction， purification， structural characterization of polysaccharide from Aconiti Lateralis Radix Praeparata and its biological evaluation on immune activity of RAW 264.7 cells

Xie Yiheng， Zhang Rui， Guo HaiYang， Zhang Xue， and Li Xiaojun

（Medical college， Yangzhou University， Yangzhou 225009）

Abstract Objective To characterize the chemical structure of polysaccharide from Aconiti Lateralis Radix Praeparata （ACP） and evaluate its immunological activity on RAW 264.7 cells. Methods Crude polysaccharide from Aconiti Lateralis Radix Praeparata was extracted by hot water extraction and the alcohol precipitation method， and purified by the anion exchange chromatography column and the gel chromatography column to obtain homogeneous ACP. The homogeneity and molecular weight distribution of ACP were determined by high-performance gel permeation chromatography （HPGPC）， the monosaccharide composition was determined by ion chromatography， and the glycosidic bond type and primary structure of ACP were elucidated by methylation experiments and NMR spectroscopy. Finally， the effects of ACP on macrophages were determined by in vitro cell experiments. Results and conclusions ACP was successfully isolated from Aconiti Lateralis Radix Praeparata with a molecular weight of 11.37 kDa. The ACP was mainly composed of glucose， and the backbone of ACP was →4）-Glcp-（1→ glycosidic bond as the main chain， and the terminal Glcp-（1→ as the brached chain through O-6 linkage of →4，6）-Glcp-（1→ linked to the main chain. The in vitro experiment results showed that ACP promoted the secretion of inflammatory factors including IL-1β， IL-6， iNOS， and TNF-α within a certain concentration range， indicating the immunological activity of ACP.

Key words Aconiti Lateralis Radix Praeparata; Polysaccharide; Structural characterization; Immunoregulatory activity; Glycan; RAW 264.7 cells

附子（Aconiti Lateralis Radix Praeparata），為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaeli Debx的子根的加工品，具有溫經散邪止痛、溫臟助陽、回陽救逆、溫陽利水和活血化瘀的功效，在中國和其他亞洲國家被廣泛使用的傳統草藥[1]。在臨床實踐中，它通常用于治療心力衰竭、類風濕性關節炎和各種疼痛[2]。附子提取物及其活性成分具有顯著的抗癌、抗炎和鎮痛作用[3]。目前認為，附子的主要活性成分是水溶性成分，包括生物堿類、多糖類、香豆素苷及尿嘧啶

等[4]。附子中生物堿和多糖是其發揮抗癌作用的主要成分[5-6]，其中生物堿類研究較多[7]，附子多糖作為附子的主要功能成分逐漸被關注[8]。

多糖（polysaccharides）是一類由多個單糖通過糖苷鍵連接而成的高分子化合物。中藥多糖具有毒性小、安全性高、功能廣泛等優點[9]，其開發與研究成了近些年中藥創新研究的熱點，并表現出廣闊的應用前景。中藥多糖可以通過不同的作用機制發揮不同的生物活性，例如免疫調節、抗腫瘤、降血糖、抗炎、神經保護和抗病毒等作用[10]。

目前對附子多糖的藥理特性的研究主要集中在心血管系統方面[8]，且不同來源、不同處理方式所得到的附子多糖結構不盡相同；更重要的是，大多數研究局限在附子多糖的提取純化方面，而對附子多糖的精細結構研究甚少。因此，進一步探究附子多糖精細結構以及附子多糖構效關系具有重要的意義。本研究首先從附子中提取粗多糖，經過一系列的分離純化獲得均一多糖（ACP），進一步對該均一多糖進行結構信息表征并闡明其一級結構。并采用RAW 264.7細胞，評估該均一多糖對免疫細胞活性影響，以期為附子的開發利用提供理論參考，并為免疫增強藥物發現提供數據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

主要用到的儀器有LC-10A型高效液相色譜儀、RI-10A型示差檢測器（日本Shimadzu公司）；多糖凝膠純化系統（型號BTR-GS）、BRT105-103-101

（8.0 mm× 300 mm）串聯凝膠柱、甲基化試劑盒、BSZ-100型自動收集器和單糖標準品（揚州博睿糖公司）；ICS5000型離子色譜儀（美國Thermo Fisher公司）； 6890-5973型氣相質譜聯用儀（GC-MS）（美國Agilent公司）；Bruker Avance 600型核磁共振光譜儀（德國Bruker公司）；酶標儀（美國Bio-Tek公司）。分子量標準品（1152，5000，11600，23800，48600，80900，148000和273000）（美國Sigma公司）。

1.2 多糖的提取、分離與純化

采用常規的熱水浸提和乙醇沉淀法[11]對3 kg的烏頭子根（產于四川江油的皺皮附子，經上海中醫藥大學曹海峰教授鑒定為附子）進行提取。以料液比1 ： 30進行熱水提取，每次提取3 h。合并3次提取液，濃縮至1 L，加入無水乙醇至終濃度為80%攪拌靜止過夜。對混懸液進行離心，以6000 r/min離心10 min，收集沉淀。用Sevage試劑進行脫蛋白處理，詳細工藝流程，見圖1。隨后，采用DE-52纖維素柱進行分離，分別用純水、0.2、0.5和1.0 mol/L NaCl溶液梯度洗脫。采用苯酚硫酸法于490 nm波長進行酶標儀檢測，繪制洗脫曲線，并收集洗脫樣品。根據洗脫曲線收集各部位多糖，進行凍干計算得率，并命名為ACP-W、ACP-0.2、ACP-0.5和ACP-1.0。其中，ACP-W進一步經多糖凝膠純化系統進行在線純化，用0. 2 mol/L氯化鈉溶液洗脫，得到ACP，凍干、備用。

1.3 多糖純度及分子量測定

采用高效凝膠滲透色譜（HPGPC）配置示差檢測器和BRT105-103-101串聯凝膠柱（8 mm×300 mm），對ACP進行分子量和純度測定[12]。ACP經0.05 mol/L

NaCl溶解成5 mg/mL，進樣量為20 μL，流動相為

0.05 mol/L NaCl，流速為0.6 mL/min。

1.4 單糖組成分析

精確稱取4 mg的ACP樣品，加入2 mL 3 mol/L的三氟乙酸在120 ℃進行水解。待水解3 h后，進行氮吹干。隨后加入4 mL超純水進行渦旋，待樣品完全溶解后離心。上清液按照1：20加入去離子水進行稀釋后上機。采用離子色譜系統配置Dionex Carbopac PA20 （3 mm×150 mm） 色譜柱和電化學檢測器，對樣品進行分析。進樣量為5 μL，流動相為A：H2O；B：15 mmol/L NaOH、C：15 mmol/L NaOH中含

100 mmol/L NaOAC。洗脫方法如下表1所示，流速為0.3 mL/min。

1.5 甲基化分析

ACP樣品的糖苷鍵分析采用氣相質譜聯用（GC-MS）和數據庫比對的方法。首先，對ACP樣品進行甲基化，隨后甲基化產物進行水解和乙?；磻猍13]。采用GC-MS測定乙酰化產物樣品；色譜柱為RXI-5 SIL MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為He，流速為1 mL/min；程序升溫條件為：起始溫度120 ℃，以3 ℃/min升溫至 250 ℃/min，保持5 min；進樣口溫度為250 ℃。

1.6 核磁共振（NMR）分析

采用重水（99.9% D）溶解ACP樣品，并配置成

110 mg/mL，使用NMR進行掃描樣品，獲得ACP的一維、二維NMR光譜，以氘代丙酮（δH 2.225，δC 31.45）作為內標。數據處理采用MestRenova V6.1.0-6224軟件對C/H信號進行歸屬。

1.7 體外免疫活性評價

1.7.1 RAW 264.7細胞培養

RAW 264.7小鼠巨噬細胞購自中國科學院干細胞庫，采用DMEM高糖培養基添加10%牛血清和1%青霉素/鏈霉素進行培養，并置于含5% CO2的37 ℃環境下的細胞培養箱內進行孵育。

1.7.2 細胞毒性評價

采用MTT對ACP的細胞毒性進行評價。首先，將RAW 264.7細胞接種到96孔板中，培養過夜使貼壁。接著，棄去舊培養基，將用培養基配置好的ACP溶液（0～800 μg/mL）加入細胞內繼續培養。待培養24 h后，每孔加入10 μL MTT溶液（5 mg/mL）培養4 h。隨后，棄掉溶液，每孔各加100 μL DMSO溶液，進行避光混勻15 min。采用酶標儀在570 nm處測定細胞的吸光度值A，計算細胞活力。

細胞活力=A實驗組/A空白對照組×100%

1.7.3 中性紅吞噬

采用中性紅吞噬實驗驗證樣品對巨噬細胞的吞噬能力影響。將RAW 264.7細胞接種到96孔板中，培養過夜使貼壁。接著，棄掉舊培養基，將不同濃度ACP樣品（0～800 μg/mL）加入RAW 264.7細胞進行共培養。待24 h后，收集舊培養基待用，細胞加入100 μL的中性紅溶液（1 mg/mL）孵育1 h，隨后加入細胞裂解液（乙醇：乙酸=1：1）進行裂解。采用酶標儀在540 nm處測定裂解后細胞殘渣的吸光度值A，計算吞噬指數。

吞噬指數= A實驗組/A空白對照組×100%

1.7.4 一氧化氮（NO）含量測定

將上述實驗收集得到的上清液與100 μL Griess試劑混合，室溫孵育10 min，以NaNO2為標準品配制一系列的標準溶液，采用酶標儀在492 nm處測定吸光度，并繪制標準曲線。將測得的吸光度值代入標準曲線中，計算NO濃度。

1.7.5 qRT-PCR檢測

設置空白組、脂多糖（LPS，0.5 μg/mL）陽性對照組、ACP低劑量組（25 μg/mL）和ACP高劑量組（100 μg/mL），處理24 h后收集4組培養后的細胞，按照說明書用TRIzol （Invitrogen）提取總RNA，采用qRT-PCR分析各組細胞因子iNOS、IL-6、IL-1β、TNF-α的基因表達。扣除背景，計算ACP及LPS的相對表達量?；蛐蛄幸姳?所示。

1.8 統計分析

所有實驗均為3次重復，生物學活性的結果以（x±s）表示，并使用Graphpad Prism軟件進行分析。當實驗結果中包含2個以上組時，進行單向方差分析（ANOVA），然后進行Dunnett-t多重比較檢驗。Plt; 0.05定義為差異具有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 ACP的分離純化

經DE-52纖維素柱層析后的各組分使用硫酸苯酚法進行糖顯色反應，并在490 nm處進行吸光度檢測，繪制呈曲線如圖2A所示。從左到右依次對應峰進行收集，得到水洗脫組分、0.2 mol/L NaCl洗脫組分、0.5 mol/L NaCl洗脫組分和1.0 mol/L NaCl洗脫組分，得率分別為3.77%，2.90%，2.83%和1.41%。將其中得率相對較高的水洗脫組分進一步經多糖凝膠純化系統進行純化，示差檢測器在線檢測如圖2B所示，收集對稱峰部位，進行凍干。

2.2 純度及分子量分布

如圖2C所示，ACP為表現出了單一對稱峰的特征，說明經過該分離、純化過程，所制備的ACP為均一多糖。根據標準曲線帶入峰的保留時間，可得ACP的重均分子量（Mw）為11367 Da，數均分子量（Mn）為8507 Da，峰位分子量（Mp）為9970 Da。

2.3 單糖組成分析

如圖3所示， 單糖標準品在離子色譜中能夠很好地區分開來，ACP樣品在色譜圖的16.6 min出現1個強度較高的色譜峰，峰面積為71.3。并與標準品色譜圖相同保留時間峰進行對照，發現其為葡萄糖（Glc）成分，說明ACP樣品中主要含有的單糖是葡萄糖，即該ACP多糖可能為葡聚糖型結構。

2.4 糖苷鍵類型分析

通過甲基化分析確定了ACP樣品中的糖苷鍵殘基的類型和比例。如圖4所示，ACP的GC-MS譜圖中，分別在17.04、21.59和26.75 min等3處有明顯的色譜峰，對應各色譜峰提取質譜碎片，可見在17.04 min處的例子碎片主要含有m/z 43、71、87、101、117、129、145、161和205，對應為2，3，4，6-Me4-Glcp的裂解特征峰；而21.59 min處色譜峰對應的特征質譜碎片m/z 101、113、129、161、173和233，主要為2，3，6-Me3-Glcp的裂解特征峰；而26.75 min處對應的主要質譜碎片為85、99、117、127、159、161和201，對應為2，3-Me2-Glcp的裂解特征峰。由此，可以推測出ACP中主要糖苷鍵類型為Glcp-（1→、→4）-Glcp-（1→、→4，6）-Glcp-（1→，摩爾比為0.118 ： 0.642 ： 0.050。

2.5 NMR核磁圖譜分析

對樣品進行NMR掃描，氫譜的異頭區在4.6～5.3 ppm內有5個信號峰，在碳譜中同樣出現5個異頭碳；另外，DEPT135圖譜中出現5個倒峰，歸屬為亞甲基的信號，即C6的信號峰。進一步通過二維圖譜的HSQC圖譜（圖5A）對同核碳氫信號進行歸屬，根據1H-1H COSY對相鄰氫信號進行歸屬（圖5B）。具體而言，糖苷鍵α-D-Glcp-1→（指定為A）的異頭區H/C信號為5.26/101.33 ppm，在1H-1HCOSY中對應H1-H2信號為δ 5.26/3.6，進一步根據HSQC得出C2的化學位移為δ71.94，同理可得到H2-H3、H3-H4、H4-H5、H5-H6的化學位移，對應的C3-C6的化學位移依次可得出，分別為δ74.03、70.61、71.68和62.65。糖苷鍵→4）-α-D-Glcp-（1→（指定為B）的異頭區H/C信號為5.31/100.89 ppm，在1H-1HCOSY中對應H1-H2、H2-H3、H3-H4、H4-H5的化學位移分別為δH 5.31/3.55、3.55/3.90、3.90/3.58、3.58/3.78。在HSQC中，根據歸屬得到的H的化學位移，可以歸屬出C2-C5的化學位移。同理，對→4，6）-α-D-Glcp-（1→（指定為C）、→4）-β-D-Glcp（指定為D）和→4）-α-D-Glcp（指定為E）進行了化學位移的歸屬，見表3。

從1H-13C HMBC圖譜及NOESY對糖苷鍵之間的連接方式進行分析。如圖5C～D所示，糖苷鍵→4）-α-D-Glcp-（1→（B）的異頭氫（5.31 ppm）與其自身的C4（78.31 ppm）有相關信號峰；另外異頭碳（100.89 ppm）與其自身的H4（3.58 ppm）有相關信號峰；表明存在→4）-α-D-Glcp-（1→4）-α-D-Glcp-（1→的鏈接方式。此外，→4）-α-D-Glcp-（1→（B）的異頭氫（5.31 ppm）與糖苷鍵→4，6）-α-D-Glcp-（1→（C）的C4（77.1 ppm）有相關峰，表明存在糖苷鍵→4）-α-D-Glcp-（1→4，6）-α-D-Glcp-（1→。在NOESY圖譜中，→4）-α-D-Glcp-（1→（B）的異頭氫（5.31 ppm）與→4，6）-α-D-Glcp-（1→（C）的H4（3.36 ppm）有相關峰，表明存在糖苷鍵→4）-α-D-Glcp-（1→4，6）-α-D-Glcp-（1→。且α-D-Glcp-（1→（A）的異頭氫（5.26 ppm）與→4，6）-α-D-Glcp-（1→（C）的H6（3.78， 3.89 ppm）有相關峰，表明存在糖苷鍵α-D-Glcp-（1→4，6）-α-D-Glcp-（1→。由此可以推斷，ACP樣品的一級化學結構如圖5E所示。

2.6 ACP的免疫調節作用

首先通過MTT法對ACP的細胞活性影響進行評價，如圖6A所示，ACP濃度在0～200 μg/mL下，RAW264.7細胞的細胞活力呈穩定趨勢，為80%左右。當達到400和800 μg/mL時細胞活力明顯下降。而ACP對細胞吞噬中性紅的活力并沒有明顯提高。但與空白對照組相比，ACP能夠顯著性促進NO的釋放。

進一步通過qRT-PCR對iNOS及細胞因子的基因表達情況進行分析，如圖7所示，與空白對照組相比，ACP呈濃度依賴性升高RAW264.7細胞中IL-1β、IL-6、iNOS及TNF-α的基因表達水平，且高濃度ACP處理組與LPS（0.5 μg/mL）陽性對照組效果幾乎持平。

3 討論

最近，有研究者對附子多糖的結構、構效關系及生物活性進行了綜述[14]，發現對附子多糖的結構表征，主要集中在分子量、單糖組成及糖苷鍵類型方面，僅有少量研究解析了附子多糖的一級精細結構。對烏頭（母根）和附子（子根）中提取的水溶性多糖進行研究，發現其分別主要由淀粉型和非淀粉型α-D-葡聚糖組成。非淀粉型多糖組分具有良好的抗腫瘤活性和顯著的非特異性的免疫刺激活性。另外，非淀粉型多糖組分還能恢復抗腫瘤藥物抑制的免疫功能[15]。本研究中，通過一系列的分離純化，并進行結構表征，最終明確了所獲得ACP的精細結構為α-1，4-葡聚糖結構。因此，推測ACP可能為潛在的免疫刺激調節劑。

巨噬細胞在先天免疫防御系統對抗感染過程中發揮關鍵作用[16]。巨噬細胞通過吞噬作用和產生免疫介質如NO和細胞因子等，引起免疫級聯反應而抵抗入侵者。其中，NO是一種具有多種生理和病理功能的親脂性自由基。它是由一種稱為一氧化氮合酶（NOS）的酶家族氧化L-精氨酸產生的[17]。已知的NOS有3種不同亞型，其中由免疫細胞（如巨噬細胞）表達的誘導異構體（iNOS），在免疫原性和炎癥刺激下釋放高產量的NO，介導抗菌和抗腫瘤活性[18]。本研究中，進一步選擇巨噬細胞進行活性評價。結果表明，通過ACP處理后，RAW 264.7細胞產生大量的NO，且具有濃度依賴性。PCR分析發現低濃度和高濃度的ACP糖均具有顯著提高iNOS基因表達的作用，且高濃度（100 μg/mL）的效果明顯。由此說明，ACP具有一定的促進NO釋放的活性。

另外，細胞因子在體內的免疫和局部或全身炎癥反應中發揮關鍵作用，其中TNF-α是炎癥反應中出現最早的促炎細胞因子，可以促使IL-6等其他炎性細胞因子的合成和分泌。IL-6是腫瘤細胞、免疫細胞、成纖維細胞等分泌的可溶性介質，可誘導T細胞增殖分化參與機體的免疫應答，促進慢性炎癥和腫瘤細胞免疫抑制的過程[19]。IL-1β則通過喚醒機體免疫系統，誘導各種免疫反應的發生，促進其他炎癥因子表達。本研究中，與空白對照組相比，ACP處理的RAW 264.7細胞具有明顯誘導細胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6基因表達升高的特點，且具有濃度依賴性，說明ACP可能通過刺激RAW 264.7細胞分泌細胞因子，而提高免疫活性。

4 結論

從附子中經水提醇沉得到附子粗多糖，經分離純化后得到分子量11.37 kDa且主要含有葡萄糖的均一多糖ACP。該均一多糖的精細結構為→4）-Glcp-（1→糖苷鍵為主鏈，Glcp-（1→為支鏈的葡聚糖結構。ACP在0～200 μg/mL濃度范圍內，對RAW 264.7細胞無細胞毒性，在25～800 μg/mL濃度范圍內，均能夠顯著性刺激RAW 264.7細胞釋放NO。進一步，經ACP低濃度（25 μg/mL）和高濃度（100 μg/mL）處理后的RAW 264.7細胞，與空白對照組相比，均能夠提高細胞因子iNOS、IL-1β、IL-6和TNF-α的基因表達。由此說明，ACP多糖能夠刺激RAW 264.7細胞促進細胞因子的分泌進而發揮增強免疫的活性，詳細的作用機制有待進一步研究。

參 考 文 獻

Wang M， Hu W J， Zhou X， et al. Ethnopharmacological use， pharmacology， toxicology， phytochemistry， and progress in Chinese crude drug processing of the lateral root of Aconitum carmichaelii Debeaux. （Fuzi）： A review[J]. J Ethnopharmacol， 2023， 301： 115838.

Liu X， Xie X， Luo M， et al. The synergistic compatibility mechanisms of fuzi against chronic heart failure in animals： A systematic review and meta-analysis[J]. Front Pharmacol， 2022， 13： 954253.

Zhang J， Li D， Zhong D， et al. Processed lateral root of Aconitum carmichaelii Debx.： A review of cardiotonic effects and cardiotoxicity on molecular mechanisms[J]. Front Pharmacol， 2022， 13： 1026219.

He G， Wang X， Liu W， et al. Chemical constituents， pharmacological effects， toxicology， processing and compatibility of Fuzi （lateral root of Aconitum carmichaelii Debx）： A review[J]. J Ethnopharmacol， 2023， 307： 116160.

Esmeeta A， Adhikary S， Dharshnaa V， et al. Plant-derived bioactive compounds in colon cancer treatment： An updated review[J]. Biomed Pharmacother， 2022， 153： 113384.

Ren M Y， Yu Q T， Shi C Y， et al. Anticancer activities of C（18）-， C（19）-， C（20）-， and bis-diterpenoid alkaloids derived from genus aconitum[J]. Molecules （Basel， Switzerland）， 2017， 22（2）： 267.

Gao Y， Fan H， Nie A， et al. Aconitine： A review of its pharmacokinetics， pharmacology， toxicology and detoxification[J]. J Ethnopharmacol， 2022， 293： 115270.

Fu Y P， Zou Y F， Lei F Y， et al. Aconitum carmichaelii Debeaux： A systematic review on traditional use， and the chemical structures and pharmacological properties of polysaccharides and phenolic compounds in the roots[J]. J Ethnopharmacol， 2022， 291： 115148.

de Almeida W S， da Silva D A. Does polysaccharide quaternization improve biological activity？[J]. Int J Biol Macromol， 2021， 182： 1419-1436.

Zeng P， Li J， Chen Y， et al. The structures and biological functions of polysaccharides from traditional Chinese herbs[J]. Prog Mol Biol Transl Sci， 2019， 163： 423-444.

Tang W， Liu D， Yin J Y， et al. Consecutive and progressive purification of food-derived natural polysaccharide： Based on material， extraction process and crude polysaccharide[J]. Trends Food Sci Technol， 2020， 99： 76-87.

Fasciano J M， Danielson N D. Ion chromatography for the separation of heparin and structurally related glycoaminoglycans： A review[J]. J Sep Sci， 2016， 39（6）： 1118-1129.

Zhang X， Hu P， Zhang X， et al. Chemical structure elucidation of an inulin-type fructan isolated from Lobelia chinensis lour with anti-obesity activity on diet-induced mice[J]. Carbohydr Polym， 2020， 240： 116357.

唐軍， 楊欣， 楊鑫， 等. 附子多糖的結構、構效關系與生物活性研究進展[J]. 中國中藥雜志， 2023， 48（20）： 5410-5418.

Gao T， Bi H， Ma S， et al. The antitumor and immunostimulating activities of water soluble polysaccharides from Radix Aconiti， Radix Aconiti Lateralis and Radix Aconiti Kusnezoffii[J]. Nat Prod Commun， 2010， 5（3）： 447-455.

Kim S， Lee C H， Yeo J Y， et al. Immunostimulatory activity of stem bark of Kalopanax pictus in RAW 264.7 macrophage[J]. J Herb Med， 2022， 32： 100504.

Bogdan C. Nitric oxide synthase in innate and adaptive immunity： An update[J]. Trends Immunol， 2015， 36（3）： 161-178.

Soufli I， Toumi R， Rafa H， et al. Overview of cytokines and nitric oxide involvement in immuno-pathogenesis of inflammatory bowel diseases[J]. World J Gastrointest Pharmacol Ther， 2016， 7（3）： 353-360.

Li L， Yu R， Cai T， et al. Effects of immune cells and cytokines on inflammation and immunosuppression in the tumor microenvironment[J]. Int Immunopharmacol， 2020， 88： 106939.