HPV 感染相關CIN 患者血清HLA-E 和HLA-G 表達與疾病進展及治療后復發(fā)的相關性

魏艷飛 徐春燕 魏 玲 劉 勃 于 倩 董 闖

宮頸上皮內瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）是子宮頸鱗狀上皮內非典型增生性病變，人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）感染是CIN 的重要致病因素［1-2］。早期識別、早期處理可促進病情轉歸，防止惡變［3］。研究發(fā)現(xiàn)，人類白細胞化抗原（human leukocytoized antigen，HLA）可識別外來抗原，啟動免疫反應，其中HLA-E、HLA-G 在多種腫瘤組織中高表達，在腫瘤的發(fā)生、復發(fā)、轉移過程中發(fā)揮重要作用［4-5］。本研究探討HPV 感染相關CIN 患者血清HLA-E、HLA-G表達及與疾病進展及治療后復發(fā)的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2021 年6～12 月在河北中石油中心醫(yī)院婦科治療的HPV 感染相關CIN 患者120 例作為觀察組，其中高危型HPV 感染70 例，低危型HPV感染50 例；選取同期無HPV 感染的CIN 患者60 例作為對照組，兩組患者一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。見表1。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 納入與排除標準 納入標準：①經病理活檢與實驗室檢查確診為CIN、HPV 感染者［6-7］；②在我院接受手術治療者；③治療后隨訪資料完整者；④患者及家屬知情同意。排除標準：①合并有其他生殖系統(tǒng)疾病者；②妊娠期或哺乳期婦女；③合并有肝腎功能障礙、惡性腫瘤、內分泌疾病等其他嚴重疾病者；④近3 個月內有性激素使用史者；⑤既往有宮頸手術史者。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準［KYLL-2021-03］。

1.3 治療及隨訪方法 CIN3 合并16、18 型HPV 感染一般選擇宮頸切除性治療，首先在陰道鏡下評估宮頸病變程度，采用電切環(huán)或冷刀環(huán)切宮頸病變部位，切除組織呈錐形。年輕、陰道鏡檢查滿意且強烈要求無創(chuàng)治療的CIN1-2 患者均接受氨基乙酰丙酸-光動力（Aminolaevulinic Acid-based Photodynamic Therapy，ALA-PDT）治療，光敏劑為氨酮戊酸外用散（上海復旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司，生產批號：221005），光動力治療儀（武漢亞格光電技術股份有限公司，型號：LED-IBS）治療當日清晨勿飲水，治療前排空小便。取截石位，在陰道鏡下確定病灶位置，并采集圖像。抽取溫敏凝膠溶劑配制20% 的氨基酮戊酸（aminolevulinic acid， ALA）溶液。須新鮮配制，時間不超過4 h。清潔患處后將浸泡ALA 溶液的棉球覆蓋于病灶及其周圍2 cm 范圍，敷藥時間根據(jù)分組進行。采用635 nm 紅光直接照射患處，光斑應完全覆蓋病灶，能量密度為80～100 J/cm2，照射時間根據(jù)分組進行。每2 周治療1 次，連續(xù)治療4 次。隨訪12 個月，觀察治療后復發(fā)情況（復發(fā)標準［8］：即術后病灶及周邊病理結果顯示細胞正常，在隨訪期間再次發(fā)現(xiàn)病變，病變經病理組織學證實為CIN）。治療結束后，每3 個月復查HPV、TCT 和陰道鏡，必要時進行組織病理學檢查。

1.4 檢查方法 入院時檢測患者HPV 感染情況，采用第二代雜交捕獲法檢測13 種高危型HPV-DNA（即HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68 型）含量、5 種低危型HPV-DNA（即HPV6、11、42、43、44）含量。檢測系統(tǒng)來自美國Digene 公司，檢測結果用所測標本的相對熒光光度值（relative light unit，RIU）與陽性定標（cut off，CO）的比值表示，RIU/CO≥1.0 為陽性。

入院時抽取患者空腹外周靜脈血離心，取血清采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清HLA-E 和HLA-G 水平，試劑盒為武漢華美生物工程有限公司產品，根據(jù)試劑盒說明書操作步驟，包被、封閉后加入1∶100 的鼠抗人 HLA-E 單克隆抗體和鼠抗人 HLA-G 單克隆抗體，于 4℃孵育過夜，洗滌后加入通用型二抗試劑盒，室溫孵育30 min。洗滌后采用 DAB 試劑盒顯色，3 min 后終止。于405 nm 處測定吸光度，代入標準曲線計算HLA-E 和HLA-G。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 24.0 軟件進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料用表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，組內比較采用配對t檢驗。計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，等級資料比較采用Wilcoxon 秩和檢驗。采用Spearman 秩相關分析血清HLA-E 和HLA-G 表達與CIN 分級相關性。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組對象血清HLA-E 和HLA-G 表達情況比較觀察組血清HLA-E 和HLA-G 高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組患者血清HLA-E和HLA-G表達情況比較（）

表2 兩組患者血清HLA-E和HLA-G表達情況比較（）

注：HLA-E為人類白細胞抗原E，HLA-G為人類白細胞抗原G；與對照組比較，①P＜0.05。

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2.2 觀察組不同臨床資料患者血清HLA-E 和HLA-G表達情況比較 觀察組CIN 分級Ⅱ/Ⅲ級患者血清HLA-E 和HLA-G 高于CIN 分級Ⅰ級，差異有統(tǒng)計學意義P＜0.05）；觀察組高危型HPV 感染者血清HLAE 和HLA-G 高于低危型HPV 感染者，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；不同年齡、身體質量指數(shù)、產次患者血清HLA-E 和HLA-G 比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 觀察組不同臨床資料患者血清HLA-E和HLA-G表達情況比較（）

表3 觀察組不同臨床資料患者血清HLA-E和HLA-G表達情況比較（）

注：HLA-E為人類白細胞抗原E，HLA-G為人類白細胞抗原G，CIN為宮頸上皮內瘤變，HPV為人乳頭瘤病毒。

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2.3 觀察組血清HLA-E 和HLA-G 表達與CIN 分級相關性 Spearman 秩相關分析結果顯示，觀察組血清HLA-E 和HLA-G 表達與CIN 分級呈正相關（rs=0.437、0.376，P＜0.001）。見圖1。

圖1 觀察組血清HLA-E和HLA-G表達與CIN分級相關性分析

2.4 觀察組治療后復發(fā)和未復發(fā)患者血清HLA-E 和HLA-G 比較 觀察組所有患者治療后隨訪1 年，其中有21 例復發(fā)CIN，復發(fā)率為16.67%；復發(fā)和未復發(fā)患者術前血清HLA-E 和HLA-G 比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；復發(fā)和未復發(fā)患者治療后1 周血清HLA-E、HLA-G 較術前降低（P＜0.05）；復發(fā)患者治療后1 周血清HLA-E 和HLA-G 高于未復發(fā)患者，兩組間差值比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 觀察組治療后復發(fā)和未復發(fā)患者血清HLA-E和HLA-G比較（）

表4 觀察組治療后復發(fā)和未復發(fā)患者血清HLA-E和HLA-G比較（）

注：HLA-E為人類白細胞抗原E，HLA-G為人類白細胞抗原G，與同組術前比較，①P＜0.05。

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3 討論

CIN 是宮頸癌的前趨癥狀，根據(jù)CIN 病變占上皮層的范圍和細胞病理特征，可將其分為CIN1、CIN2 和CIN3［9-10］。CIN1 級患者中57%左右可自然消退，但仍有43% 左右持續(xù)進展［11-12］。研究發(fā)現(xiàn)，HLA-E、HLAG 在卵巢癌、口腔癌、宮頸癌等惡性腫瘤患者血清中高表達［13-15］。但目前鮮有HPV 感染相關CIN 患者血清HLA-E、HLA-G 表達水平與疾病進展及治療后復發(fā)關系的報道。

本研究結果顯示，HPV 感染相關CIN 患者血清HLA-E 和HLA-G 表達更高。HPV 感染相關CIN 患者血清HLA-E 和HLA-G 表達與CIN 分級有關，CIN 分級越高，血清HLA-E 和HLA-G 表達水平越高。提示今后可通過檢測血清HLA-E 和HLA-G 表達來輔助評估患者的CIN 分級。這是由于HLA-E、HLA-G 可介導機體免疫耐受過程，降低自然殺傷細胞、T 細胞以及B 細胞功能，可與細胞表面受體結合，產生免疫抑制作用，引起腫瘤細胞免疫逃逸［16-19］，因此HPV 感染相關CIN 患者血清HLA-E 和HLA-G 表達更高，則機體免疫功能相對較差。張莉等［20］研究發(fā)現(xiàn)，HLA-E、HLA-G表達水平與HPV 感染均隨著宮頸病變程度的增加而升高，且相互間存在正相關關系，與本結果基本一致。

本研究根據(jù)不同的CIN 分級給予不同的治療方法，CIN3 合并高危HPV 特別是16、18 型感染選擇宮頸切除性治療。所有患者治療后隨訪1 年，其中有21 例復發(fā)CIN，復發(fā)率為16.67%。提示CIN 患者的復發(fā)率較高，即便是經過手術或ALA-PDT 治療后，1 年內的復發(fā)情況仍較嚴重。CIN 術后較易復發(fā)，因此在治療后應定期復查。劉渝等［21］研究發(fā)現(xiàn)，CIN 復發(fā)與術前HPV 病毒載量無明顯相關，但與術后HPV 持續(xù)陽性關系密切，如果術后持續(xù)陽性需警惕復發(fā)。本研究結果顯示，復發(fā)患者治療后1 周血清HLA-E 和HLA-G 高于未復發(fā)患者，提示在今后的臨床工作中可通過檢測患者治療后1 周時的HLA-E 和HLA-G 水平來預測治療后的復發(fā)風險。分析原因可能與CIN 術后機體免疫抑制狀態(tài)相關，機體免疫功能與疾病預后有關，治療后1 周時的HLA-E 和HLA-G 水平高的患者機體免疫功能較差，使患者在治療后更易再次發(fā)生HPV 感染而導致CIN。但本研究也存在一些不足，在隨訪過程中僅檢測患者治療后1 周時的HLA-E 和HLA-G 水平，并未進行周期性檢測，后期可開展周期性檢測，根據(jù)檢測結果進一步判斷HLA-E 和HLA-G 水平在復發(fā)中的表達。