基于數(shù)據(jù)挖掘和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究海洋中藥治療乳腺增生的用藥規(guī)律及作用機(jī)制

張婉悅,楊旭杰

河北中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,石家莊 050020

乳腺增生是由乳腺纖維和上皮組織增生引起的退行性疾病,臨床表現(xiàn)以兩側(cè)或單側(cè)乳房出現(xiàn)硬結(jié)腫塊為主,多伴疼痛,本病病情與月經(jīng)周期及情緒變化相關(guān),好發(fā)于25～44歲的女性[1]。乳腺增生具有發(fā)病率高、難治愈、易復(fù)發(fā)的特點(diǎn),近年來(lái),乳腺增生的發(fā)病率逐年上升,且發(fā)病有年輕化的趨勢(shì),本病具有一定的惡變傾向,其中重度乳腺增生、非典型乳腺增生和囊性乳腺增生患者的乳腺癌發(fā)病率較高[2]。中醫(yī)藥治療乳腺增生具有歷史悠久、經(jīng)驗(yàn)豐富的特點(diǎn),已上市的中成藥如乳康片、乳癖消片等均具有較好療效。

海洋中藥是傳統(tǒng)中藥的重要組成部分,指在中醫(yī)學(xué)理論指導(dǎo)下,來(lái)源于海洋且用于防治疾病的天然藥物,海洋中藥多生長(zhǎng)在海域、海灘、濱海濕地、鹽土等受海水浸潤(rùn)影響的濱海地帶[3],獨(dú)特的生長(zhǎng)環(huán)境使海洋中藥具有獨(dú)特的藥用價(jià)值[4]。目前已上市的海洋來(lái)源藥物種類(lèi)較少,且相關(guān)藥物的研發(fā)成功率較高,使得海洋中藥具有較大的發(fā)展空間。

專利文獻(xiàn)是知識(shí)產(chǎn)權(quán)的重要組成部分,囊括了全球90%以上的最新技術(shù)情報(bào),能夠反映發(fā)明創(chuàng)造的技術(shù)特征[5]。新穎性、創(chuàng)造性、實(shí)用性是影響專利能否獲得授權(quán)的重要因素,專利經(jīng)多次審核后,只有符合規(guī)定、質(zhì)量較優(yōu)的專利申請(qǐng)案能夠獲得授權(quán)。本研究以治療乳腺增生為主要目的的授權(quán)專利組方為研究對(duì)象,旨在挖掘含海洋中藥的專利組方的用藥規(guī)律及核心藥組發(fā)揮療效的作用機(jī)制,以期為相關(guān)專利的申請(qǐng)及相關(guān)藥物的開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源

以國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局網(wǎng)站(http://pss-system.cnipa.gov.cn/)作為數(shù)據(jù)來(lái)源,獲取1993年1月31日至2022年9月30日間治療乳腺增生的專利文獻(xiàn),此外本研究還選擇了專利事務(wù)所、知識(shí)產(chǎn)權(quán)機(jī)構(gòu)、中醫(yī)藥企業(yè)、高校等單位作為信息來(lái)源,以保證數(shù)據(jù)的查全率。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

①以治療乳腺增生為主要目的的專利文獻(xiàn);②已獲得授權(quán)的專利文獻(xiàn);③含海洋中藥的專利文獻(xiàn)。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

①排除治療儀器、熏洗裝置等不含中藥成分的專利文獻(xiàn);②排除重復(fù)的專利文獻(xiàn);③排除公開(kāi)、駁回、撤回等其他法律狀態(tài)下的專利文獻(xiàn)。

1.4 建立數(shù)據(jù)庫(kù)與數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化

1.4.1 建立數(shù)據(jù)庫(kù)

將以上數(shù)據(jù)錄入WPS Excel建立數(shù)據(jù)庫(kù),由雙人兩臺(tái)計(jì)算機(jī)錄入并復(fù)查,對(duì)差異數(shù)據(jù)進(jìn)行修改。

1.4.2 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化

藥物名稱優(yōu)先依據(jù)2020版《中國(guó)藥典》進(jìn)行規(guī)范,未收錄者依據(jù)《中華本草》《中藥大辭典》規(guī)范。如將“川軍”規(guī)范為“大黃”,“二花”規(guī)范為“金銀花”,“坤草”規(guī)范為“益母草”;海洋中藥的確認(rèn)及名稱標(biāo)準(zhǔn)化依據(jù)《中華海洋本草》進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)分析

運(yùn)用WPS Excel中數(shù)據(jù)透視表對(duì)藥物進(jìn)行頻數(shù)統(tǒng)計(jì);運(yùn)用SPSS Statistics 21.0對(duì)頻數(shù)≥40的藥物進(jìn)行聚類(lèi)分析;運(yùn)用SPSS Modeler18.0建模,進(jìn)行Apriori關(guān)聯(lián)規(guī)則分析。

1.6 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.6.1 藥物成分的篩選與靶點(diǎn)信息獲取

在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù),以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%,類(lèi)藥性指數(shù)(drug likeness,DL)≥0.18為條件,篩選柴胡、當(dāng)歸的主要成分,在BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)以Score cutoff≥20,P-value<0.5的條件,篩選牡蠣的主要成分,結(jié)合文獻(xiàn)補(bǔ)充藥物的靶點(diǎn)信息,在Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得藥物成分的分子結(jié)構(gòu)圖,將分子結(jié)構(gòu)圖導(dǎo)入Swiss ADME平臺(tái)中,參考相關(guān)文獻(xiàn),對(duì)胃腸吸收(GI absorption)為high、藥物相似性中有兩個(gè)及兩個(gè)以上“yes”的成分予以納入,對(duì)于未納入的藥物成分,參考相關(guān)文獻(xiàn),若為主要成分或作用明顯者仍予以納入。在Pharm Mapper數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取藥物成分的潛在靶點(diǎn)。利用uniprot數(shù)據(jù)庫(kù),獲取已驗(yàn)證的人類(lèi)靶點(diǎn)基因名稱。將上述信息錄入WPS Excel表格,運(yùn)用Cytoscape3.8.0軟件繪制藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6.2 乳腺增生相關(guān)靶點(diǎn)的獲取

以“hyperplasia of mammary glands”為關(guān)鍵詞,在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)及OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索。為獲取相關(guān)性較高的疾病靶點(diǎn),計(jì)算GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中疾病靶點(diǎn)的相關(guān)度分?jǐn)?shù)(relevance score)中位數(shù),記為M,篩選相關(guān)度分?jǐn)?shù)>2M的基因靶點(diǎn),與OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取的靶點(diǎn)合并去重后,錄入WPS Excel表格。

1.6.3 蛋白質(zhì)互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與核心靶點(diǎn)獲取

使用微生信網(wǎng)站繪制藥物-疾病Venn圖。將Venn圖中藥物-疾病的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù),設(shè)置蛋白種屬為人類(lèi)、medium confidence>0.4,構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。運(yùn)用Cytoscape3.8.0軟件中的CytoNCA計(jì)算其拓?fù)鋮?shù),篩選核心藥組中治療乳腺增生的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.6.4 核心成分獲取

運(yùn)用Cytoscape3.8.0軟件,將藥物-疾病的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中進(jìn)行篩選,繪制成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖,并運(yùn)用CytoNCA計(jì)算其拓?fù)鋮?shù),獲取網(wǎng)絡(luò)中的核心成分。

1.6.5 GO生物功能分析與KEGG通路富集分析

利用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO生物功能分析和KEGG通路富集分析,利用微生信網(wǎng)站繪制GO生物功能條目圖和KEGG通路富集氣泡圖。

1.7 分子對(duì)接

利用Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)獲取配體信息,運(yùn)用OpenBabel-2.4.1軟件將文件格式轉(zhuǎn)換為mol2格式,運(yùn)用AutoDuckTools-1.5.7軟件對(duì)配體加氫、分配電荷、設(shè)置扭轉(zhuǎn)鍵。利用PDB數(shù)據(jù)庫(kù)獲取受體信息,運(yùn)用Pymol軟件去除受體中的水及配體,運(yùn)用AutoDuckTools1.5.7對(duì)受體加氫。將上述文件保存為pdbqt格式,導(dǎo)入AutoDuckTools-1.5.7軟件,運(yùn)行autogrid4、autodock4將受體配體對(duì)接,所得結(jié)果運(yùn)用Pymol進(jìn)行可視化。

1.8 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.8.1 動(dòng)物

雌性SD大鼠60只,購(gòu)自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司,許可證號(hào):SCXK(京)2019-0010,本實(shí)驗(yàn)經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)審批(編號(hào):DWLL2018059),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的相關(guān)操作符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例。

1.8.2 主要試劑與儀器

枸櫞酸他莫昔芬(上海復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司,批號(hào):200905);黃體酮注射液(批號(hào):B210205)、苯甲酸雌二醇注射液(批號(hào):B210206)(寧波三生生物科技有限公司);ChemiDOC XRS型凝膠成像分析系統(tǒng)、S1000型逆轉(zhuǎn)錄儀、CFX96型Optics Module PCR儀、10705型酶標(biāo)儀、CG05型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR)儀、BJYX2017002型逆轉(zhuǎn)錄儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.8.3 藥物制備

實(shí)驗(yàn)所需中藥飲片購(gòu)自北京廣安門(mén)醫(yī)院中藥房,經(jīng)承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所蘇占輝副教授鑒定均為正品。藥組中柴胡10 g、當(dāng)歸10 g、牡蠣30 g,常規(guī)浸泡1 h,煎2次,每次文火煎煮30 min,得到藥液濃縮至每毫升藥液含生藥1 g,冷卻后置4 ℃冰箱備用。

1.8.4 分組與給藥

按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)選取大鼠10只作為正常組,剩余大鼠隨機(jī)分為5組,分別為模型組、枸櫞酸他莫昔芬組、中藥組合物高、中、低劑量組。中藥組合高、中、低劑量組每日分別給予12、6、3 g/kg中藥組合物藥劑灌胃,枸櫞酸他莫昔芬組每日給予4 mg/kg枸櫞酸他莫昔芬灌胃,等效劑量按人與動(dòng)物體型系數(shù)折算。正常組和模型組每日給予等量蒸餾水灌胃,持續(xù)干預(yù)30 d。

1.8.5 標(biāo)本采集

于末次灌胃給藥后,各組大鼠禁食不禁水24 h,采用1%戊巴比妥鈉按1 mL/kg腹腔注射進(jìn)行麻醉后,常規(guī)觀察大鼠一般癥狀、體征。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中觀察各組大鼠一般生存狀況(體質(zhì)量、性情、毛發(fā)等)和大鼠乳頭形態(tài)(形態(tài)、皮色等)。

1.8.6 大鼠乳頭形態(tài)學(xué)測(cè)定

大鼠麻醉后,將大鼠第二對(duì)乳頭周?chē)撁?腹部向上置于超聲操作臺(tái),使用醫(yī)用膠帶固定其四肢,用游標(biāo)卡尺測(cè)量乳頭直徑和高度。

1.8.7 血清中雌激素及孕酮含量測(cè)定

麻醉大鼠后取血,使用高速冷凍離心機(jī)離心10min,取上層血清,采用ELISA法檢測(cè)大鼠血清中雌二醇(estradiol,E2)、孕酮(progesterone,PG)含量。

1.8.8 乳腺組織中PTEN、PI3K、Akt mRNA表達(dá)

使用Real-time PCR法,取乳腺組織0.1 g,提取試劑盒抽提組織中總RNA,測(cè)定RNA濃度(吸光度A260/A280,1.8～2.0)。RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA以備擴(kuò)增,引物(寶生物工程有限公司)以GAPDH作為內(nèi)參基因(引物序列見(jiàn)表1),擴(kuò)增(95 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性10 s、60 ℃退火30 s、60個(gè)循環(huán))。獲取目的基因和內(nèi)參基因的循環(huán)閾值(Ct),2-ΔΔCt計(jì)算目的蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列

1.8.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果

2.1.1 中藥頻數(shù)統(tǒng)計(jì)

檢索得乳腺增生授權(quán)專利共計(jì)387篇,篩選后納入含海洋中藥的專利組方157首,涉及中藥398味,用藥頻數(shù)共計(jì)2 437次,單首專利組方中用藥最多55味、最少2味。海洋中藥的用藥頻數(shù)共計(jì)257次,涉及22味海洋中藥。專利組方中使用頻數(shù)≥40的中藥有13味,其中高頻海洋中藥三味:牡蠣(83次,52.87%)、海藻(72次,45.86%)、昆布(57次,36.31%),高頻非海洋中藥有柴胡(83次,52.87%)、當(dāng)歸(70次,44.59%)、夏枯草(67 次,42.68%)等(見(jiàn)表2)。

表2 含海洋中藥專利組方治療乳腺增生的高頻藥物

2.1.2 聚類(lèi)分析

運(yùn)用SPSS Statistics21.0,選取使用頻數(shù)≥40的藥物,聚類(lèi)方法設(shè)置為組間聚類(lèi),度量標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置為Pearson相關(guān)性進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析,并繪制樹(shù)狀圖(見(jiàn)圖1)。當(dāng)組間距離為23.5時(shí),可將藥物分為三類(lèi)。類(lèi)別A:莪術(shù)、三棱、海藻、昆布;類(lèi)別B:香附、青皮、丹參、柴胡、牡蠣、郁金、當(dāng)歸、王不留行;類(lèi)別C:夏枯草。

圖1 聚類(lèi)分析圖

2.1.3 中藥的關(guān)聯(lián)規(guī)則分析

將專利組方導(dǎo)入SPSS Modeler18.0軟件,運(yùn)用Apriori模型,設(shè)置支持度≥10%,置信度≥80%進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析。關(guān)聯(lián)規(guī)則較強(qiáng)的藥物組合有柴胡-牡蠣+當(dāng)歸、沒(méi)藥-乳香、柴胡-夏枯草+牡蠣、柴胡-郁金+牡蠣、柴胡-青皮+牡蠣(見(jiàn)表3)。選取其中支持度、置信度最高的藥組柴胡-牡蠣+當(dāng)歸,進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究。

表3 關(guān)聯(lián)規(guī)則分析

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果

2.2.1 核心藥組的藥物作用靶點(diǎn)獲取及疾病靶點(diǎn)篩選

綜合數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)查閱結(jié)果[6-9],共納入37個(gè)藥物成分,其中柴胡21個(gè),當(dāng)歸7個(gè),牡蠣9個(gè)(見(jiàn)表4),整理藥物成分的作用靶點(diǎn),去除重復(fù)值后獲得靶點(diǎn)317個(gè)。

表4 核心藥組成分

在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中輸入“hyperplasia of mammary glands”檢索乳腺增生疾病靶點(diǎn),分別檢索得4 832個(gè)、462個(gè)乳腺增生的潛在靶點(diǎn)。為去除相關(guān)性低的疾病靶點(diǎn),計(jì)算GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)度分?jǐn)?shù)中位數(shù),記為M,取相關(guān)度分?jǐn)?shù)>2M的靶點(diǎn)。整理去重后共獲得潛在靶點(diǎn)1 386個(gè)。運(yùn)用Cytoscape3.8.0軟件繪制成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(見(jiàn)圖2)。

圖2 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.2.2 藥物-疾病共同靶點(diǎn)獲取及PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建結(jié)果

取藥物與疾病的共同靶點(diǎn)繪制Venn圖(見(jiàn)圖3),將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),使用Cytoscape3.8.0軟件進(jìn)行可視化(見(jiàn)圖4),計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)(見(jiàn)圖5),其中TP53的拓?fù)渲底罡?推測(cè)是相關(guān)藥物發(fā)揮治療作用的重要靶點(diǎn),此外AKT1、ALB、ESR1等靶點(diǎn)也相對(duì)重要。

圖3 藥物-疾病靶點(diǎn)Venn圖

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)

圖5 重要靶點(diǎn)統(tǒng)計(jì)條目圖

2.2.3 核心成分獲取

運(yùn)用Cytoscape3.8.0軟件,繪制成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(見(jiàn)圖6),并運(yùn)用CytoNCA分析網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋮?shù),計(jì)算參數(shù)中度中心性(degree centrality,DC)、緊密中心性(closeness centrality,CC)、特征向量中心性(eigenvector centrality,EC)、中介中心性(between centrality,BC)的平均數(shù),取大于平均值的成分作為核心成分(見(jiàn)表5),篩選后共獲得四個(gè)成分,其中槲皮素拓?fù)渲底罡?推測(cè)其為高頻藥組發(fā)揮療效的主要成分,此外,山奈酚、異鼠李素、β-谷甾醇也較為重要。

圖6 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

表5 成分拓?fù)渲?/p>

2.2.4 GO富集分析與KEGG通路富集分析結(jié)果

利用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù),在P<0.01的條件下,進(jìn)行GO富集分析與KEGG通路富集分析,利用微生信網(wǎng)站繪制GO富集分析條目圖(見(jiàn)圖7)及KEGG通路富集條目圖(見(jiàn)圖8)。結(jié)果顯示核心藥組參與的生物學(xué)過(guò)程主要涉及激素反應(yīng)(response to hormone)、對(duì)無(wú)機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)(response to inorganic substance)、細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的反應(yīng)(cellular response to lipid)等;細(xì)胞組分涉及膜筏(membrane raft)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物(transcription regulator complex)、質(zhì)膜蛋白復(fù)合物(plasma membrane protein complex)等;分子功能可能與DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(DNA-binding transcription factor binding)、蛋白激酶活性(protein kinase activity)、激酶結(jié)合(kinase binding)相關(guān)。KEGG通路富集分析獲得197條通路,按照P值由小到大排序,選取排名前20的條目繪制氣泡圖(見(jiàn)圖8),發(fā)現(xiàn)與核心藥組治療乳腺增生關(guān)系較為密切的通路有P13K-ATK信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、內(nèi)分泌抵抗等。

圖7 GO生物功能條目圖

2.3 分子對(duì)接結(jié)果

選取靶點(diǎn)TP53(PBDID:1aie)、AKT1(PBDID:6hhg)、ALB(PBDID:7vr0)、ESR1(PBDID:1sj0)與核心成分槲皮素、山奈酚、異鼠李素、β-谷甾醇進(jìn)行分子對(duì)接。結(jié)合能越低,說(shuō)明成分與蛋白靶點(diǎn)間的結(jié)合越緊密[10],核心成分與靶點(diǎn)間的對(duì)接能在-5.86 kcal/mol至-10.32 kcal/mol間(見(jiàn)表6),提示成分和靶點(diǎn)間對(duì)接情況良好。以槲皮素與靶點(diǎn)間的構(gòu)象關(guān)系為例,進(jìn)行可視化展示(見(jiàn)圖9)。

圖9 分子對(duì)接模式圖

表6 分子對(duì)接結(jié)果

2.4 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

2.4.1 中藥組合對(duì)大鼠乳頭直徑和高度的影響

與正常組比較,模型組大鼠的乳頭直徑明顯縮小、高度明顯降低(P<0.05);與模型組比較,各給藥組大鼠乳頭直徑明顯縮小、高度明顯降低(P<0.05)(見(jiàn)表7)。

表7 核心藥組對(duì)大鼠乳頭直徑和高度的影響

2.4.2 中藥組合對(duì)大鼠血清E2及PG表達(dá)的影響

與正常組比較,模型組大鼠血清中E2水平顯著升高、PG水平顯著降低(P<0.05);與模型組比較,各給藥組中的大鼠血清中E2水平降低、PG水平升高(P<0.05),以高劑量中藥組合效果最佳(見(jiàn)表8)。

表8 核心藥組對(duì)大鼠血清E2及PG表達(dá)的影響

2.4.3 中藥組合對(duì)大鼠乳腺組織中PTEN、PI3K、Akt mRNA表達(dá)的影響

模型組與正常組比較,大鼠乳腺組織中的PTEN mRNA明顯下降(P<0.05),PI3K、Akt mRNA明顯升高(P<0.05);與模型組相比,高劑量組的PTEN mRNA明顯升高,PI3K、Akt mRNA明顯下降(P<0.05),表明中藥組合對(duì)P13K-ATK信號(hào)通路具有抑制作用(見(jiàn)表9)。

表9 核心藥組對(duì)大鼠乳腺組織中PTEN、PI3K、Akt mRNA的影響

3 討論與結(jié)論

中醫(yī)學(xué)將乳腺增生歸屬“乳癖”范疇,《外科正宗》載:“憂郁傷肝,思慮傷脾,積想在心,所愿不得志者,致經(jīng)絡(luò)痞澀,聚結(jié)成核。”指出本病起病多由情志不遂、七情過(guò)極而損傷肝脾,導(dǎo)致肝失疏泄、脾失健運(yùn);或因肝腎虧損、沖任失調(diào),導(dǎo)致痰凝、瘀血郁滯乳絡(luò),凝滯成核,遂成本病。

對(duì)含海洋中藥的授權(quán)專利組方進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘,發(fā)現(xiàn)專利組方中治療乳腺增生的海洋中藥以牡蠣、海藻、昆布為主。牡蠣能潛陽(yáng)補(bǔ)陰、軟堅(jiān)散結(jié),具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等功能,牡蠣水解物能產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫刺激作用,且具有抗腫瘤活性[11];海藻性寒、味苦咸,能軟堅(jiān)散結(jié),是臨床常用治療乳腺增生的藥物,《本草備要》認(rèn)為海藻“咸潤(rùn)下而軟堅(jiān),寒行水以泄熱,能消堅(jiān)聚”;昆布性寒、味咸,功效類(lèi)似于海藻,藥理研究顯示昆布具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤的作用,此外,昆布能夠下調(diào)Bcl-2基因蛋白表白,增加異常增殖的乳癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[12]。非海洋藥物中,柴胡是治療乳腺增生的常用藥物,柴胡能條達(dá)肝氣、疏肝解郁、調(diào)節(jié)氣機(jī),擅治肝氣郁結(jié)型乳腺增生;當(dāng)歸為“補(bǔ)血之圣藥”,既能補(bǔ)血,又能活血行滯,具有抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等作用[13];夏枯草既能清肝經(jīng)火,又能散結(jié)消腫,其治療乳腺疾病的作用首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,迄今千年有余,療效廣經(jīng)驗(yàn)證。研究證實(shí),夏枯草通過(guò)調(diào)控激素代謝水平,抑制乳腺增生;另一方面,夏枯草可以調(diào)節(jié)免疫功能,清除體內(nèi)病變細(xì)胞[14]。

對(duì)高頻藥物進(jìn)行聚類(lèi)分析,類(lèi)別A中莪術(shù)、三棱可活血行氣止痛,海藻、昆布能軟堅(jiān)散結(jié),本組藥物的功效以活血散積止痛為主;類(lèi)別B中香附、柴胡能疏肝理氣、條達(dá)郁滯,二藥是柴胡疏肝散的組成部分,具有理氣解郁的作用,郁金行氣化瘀、青皮破氣疏肝,王不留行、丹參能活血,當(dāng)歸補(bǔ)血活血,牡蠣軟堅(jiān)散結(jié),本組藥物功效以疏肝理氣活血為主;類(lèi)別C中夏枯草能清瀉肝火、散結(jié)消腫。三類(lèi)藥物組合功效各有側(cè)重,可依據(jù)患者具體證型靈活應(yīng)用。關(guān)聯(lián)規(guī)則分析結(jié)果表明柴胡-牡蠣-當(dāng)歸藥組關(guān)聯(lián)性最高,柴胡疏肝理氣、當(dāng)歸補(bǔ)血活血,二藥相合既能理氣疏肝,又能補(bǔ)血養(yǎng)肝,再配以海洋藥物牡蠣,既能軟堅(jiān)散結(jié),又能防止疏肝藥物宣散太過(guò),本藥組能理氣活血疏肝,有助于宣通乳絡(luò),促進(jìn)氣血運(yùn)行恢復(fù)正常,查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),柴胡-牡蠣-當(dāng)歸藥組多應(yīng)用于臨床,且具有較好的臨床效果[15]。乳頭直徑和高度能從形態(tài)學(xué)上直觀反映乳腺增生的增生程度[16]。E2的升高及PG降低,導(dǎo)致乳腺實(shí)質(zhì)過(guò)度增生,在乳腺組織的病變過(guò)程中起主導(dǎo)作用[17]。實(shí)驗(yàn)表明柴胡-當(dāng)歸-牡蠣藥組能縮小乳頭直徑、降低乳頭高度,且能降低血清中E2表達(dá)、提高PG表達(dá)水平,能改善乳房形態(tài),抑制乳腺增生。

運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)核心藥組進(jìn)一步分析,發(fā)現(xiàn)槲皮素、山柰酚、異鼠李素、β-谷甾醇度值最高。槲皮素的結(jié)構(gòu)與雌激素類(lèi)似,具有雌激素效能,對(duì)雌激素具有雙向調(diào)節(jié)作用,此外,槲皮素能下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)、上調(diào)Bax蛋白表達(dá),從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,治療乳腺增生[18,19];山柰酚是一種黃酮類(lèi)化合物,具有抗腫瘤、抗炎和抗氧化等作用,山柰酚可以活化半胱天冬酶,促使細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞增生[20];異鼠李素具有抗氧化活性,可由AKT和ERK信號(hào)通路介導(dǎo),抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡[21];β-谷甾醇具有抗炎作用,能調(diào)控多種細(xì)胞信號(hào)通路,具有抑制細(xì)胞增殖和血管生成的作用[22]。

本研究共篩選出317個(gè)藥物潛在作用靶點(diǎn),依據(jù)拓?fù)鋮?shù),推測(cè)TP53、AKT1、ALB、ESR1是核心組方治療乳腺增生的核心作用靶點(diǎn)。研究表明,TP53在Nedd4介導(dǎo)下調(diào)節(jié)Spy1蛋白,當(dāng)TP53突變時(shí),Spy1蛋白積聚,導(dǎo)致乳腺增生[23];在小鼠模型中,雌激素受體過(guò)表達(dá)時(shí),MMTV啟動(dòng)子啟動(dòng)AKT1,AKT1驅(qū)動(dòng)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化,促進(jìn)乳腺管腔上皮細(xì)胞的存活和遷移[24];ALB是白蛋白的基因表達(dá),白蛋白來(lái)源于肝臟,能有效抑制中性粒細(xì)胞誘捕網(wǎng)(NETs)的生成[25],NETs參與了細(xì)胞殺傷、無(wú)菌性炎癥、組織損傷,且能在一定程度上促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖,在乳腺癌的疾病進(jìn)程中起重要作用[26],乳腺增生存在癌變可能,結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn),推測(cè)ALB可能是預(yù)防乳腺增生癌變的重要靶點(diǎn);乳腺組織中早期遺傳缺陷、環(huán)境條件等因素可能導(dǎo)致ESR1突變,其中XbaⅠ位點(diǎn)的變異增加了乳腺增生的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[27]。

通過(guò)GO功能富集分析,發(fā)現(xiàn)高頻藥組可能于膜筏等部位發(fā)揮治療乳腺增生的作用,膜筏是由蛋白或類(lèi)球蛋白所組成的細(xì)胞膜微結(jié)構(gòu)域,參與如血管壁細(xì)胞凋亡、免疫細(xì)胞活化等生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)[28]。藥組發(fā)揮治療作用的生物學(xué)過(guò)程主要涉及激素反應(yīng)、對(duì)無(wú)機(jī)物質(zhì)的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的反應(yīng)等,與DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白激酶活性、激酶結(jié)合等方面的分子功能密切相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn),P13K-ATK信號(hào)通路可能是柴胡-牡蠣+當(dāng)歸藥組治療乳腺增生的重要通路。P13K-ATK信號(hào)通路與細(xì)胞增殖、遷移、分化、凋亡密切相關(guān)[29],乳腺上皮細(xì)胞中P13K-ATK信號(hào)通路被激活后,對(duì)雌激素的生長(zhǎng)抑制具有抑制作用,從而導(dǎo)致乳腺上皮細(xì)胞的增生性改變。實(shí)驗(yàn)表明,核心藥組具有抑制P13K-ATK信號(hào)通路的作用。拓?fù)渲蹬琶笆暮诵陌悬c(diǎn)中,AKT1、TP53、EGFR、VEGFA、MYC、IL6均位于P13K-ATK信號(hào)通路,推測(cè)可能是核心藥組抑制P13K-ATK信號(hào)通路的重要媒介。此外,抑癌基因PTEN能夠抑制P13K-ATK信號(hào)通路,從而抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[30]。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,藥物靶點(diǎn)較多作用于癌癥相關(guān)通路,提示中藥組方在治療乳腺增生同時(shí),具有減緩疾病發(fā)展進(jìn)程、延緩甚至阻止乳腺癌發(fā)生的可能性。核心藥組還能作用于動(dòng)脈粥樣硬化、乙型肝炎、丙型肝炎等通路,體現(xiàn)中醫(yī)理論中異病同治的思想,為相關(guān)申請(qǐng)人后續(xù)申請(qǐng)乳腺增生復(fù)方專利,拓寬專利權(quán)保護(hù)范圍提供參考。

綜上所述,本文運(yùn)用數(shù)據(jù)挖掘、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn),以授權(quán)專利組方為研究對(duì)象,從理論層面探究其中海洋中藥治療乳腺增生的用藥規(guī)律及核心藥組治療乳腺增生的作用機(jī)制。本文的研究結(jié)果對(duì)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)海洋中藥,促進(jìn)相關(guān)專利的申請(qǐng)具有積極意義。

中藥牡蠣多去肉,以殼入藥,目前牡蠣殼成分的測(cè)定年代較早,公知有效成分主要是礦物質(zhì),此類(lèi)物質(zhì)可查的作用靶點(diǎn)較少,導(dǎo)致相關(guān)成分的拓?fù)鋮?shù)較小,在網(wǎng)絡(luò)中排名較為靠后,但牡蠣作為治療乳腺增生的臨床常用藥物,其治療作用不容忽視。本研究揭示出對(duì)牡蠣成分、靶點(diǎn)等方面的研究不夠充分這一現(xiàn)狀,為相關(guān)的系列研究提供了新思路。本研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)設(shè)計(jì)了牡蠣潛在成分深入挖掘的相關(guān)實(shí)驗(yàn),并且密切關(guān)注同行的藥理研究進(jìn)展,隨著牡蠣有效成分的不斷公開(kāi),牡蠣治療乳腺增生的藥理機(jī)制必將有新的突破。