基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證研究檸檬精油緩解焦慮癥的作用機(jī)制

張依萍,徐 旭,呂億婷,黃金琴,王盛東,奚林芝,王丹丹,劉 暢

1浙江萬(wàn)里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院,寧波 315100;2寧波大央科技有限公司,寧波 315020

焦慮癥是一種以暫時(shí)性或持續(xù)性情緒緊張為主要臨床癥狀,并伴有自主神經(jīng)紊亂、運(yùn)動(dòng)障礙等癥狀的神經(jīng)癥,也是一種心情不愉快并且伴隨身體不適的精神類(lèi)疾病[1]。近些年,人們的生活、學(xué)習(xí)和工作壓力不斷增加,使得抑郁癥和焦慮癥患病率大幅度提升。據(jù)統(tǒng)計(jì),全世界患有抑郁癥的人數(shù)占3.01%～5.00%、患有焦慮癥的人數(shù)占4.00%～6.50%[2]。目前,治療抑郁和焦慮的藥物主要是艾司西酞普蘭、文拉法辛、苯二氮卓類(lèi)等西藥,但其副作用大、依賴(lài)性強(qiáng)、用藥周期長(zhǎng),給患者身體帶來(lái)了一定的傷害。

焦慮癥治療除了藥物治療和心理治療外,芳香療法被認(rèn)為是一種有效的輔助治療手段[3]。植物精油有一系列的藥理特性,包括抗焦慮、抗抑郁、鎮(zhèn)靜安神、神經(jīng)保護(hù)作用等藥理活性,許多動(dòng)物和人類(lèi)研究都支持使用香氣及其成分來(lái)減少焦慮相關(guān)癥狀行為[4]。佛手、甜橙、香紫蘇、檸檬草和薰衣草等植物精油,通過(guò)嗅吸或按摩方法對(duì)焦慮癥狀改善有積極的效果且未出現(xiàn)任何不良反應(yīng)[5]。薰衣草精油中富含的芳樟醇、玫瑰精油中富含的香葉醇均在舒緩焦慮方面有作用[6]。研究發(fā)現(xiàn),從檸檬果皮中提取的檸檬精油可以改善情緒、認(rèn)知、緩解疲勞,可防止考試焦慮期間的認(rèn)知能力下降[7];嗅吸檸檬精油(lemon essential oil,LEO)可顯著升高人體腦電波的β波[8]。Martial等[9]采用行為試驗(yàn)研究了檸檬精油蒸汽對(duì)小鼠的抗應(yīng)激作用,發(fā)現(xiàn)吸入檸檬精油后的小鼠在高架迷宮和開(kāi)放場(chǎng)地測(cè)試中都有抗焦慮作用。?zer等[10]研究了大鼠持續(xù)暴露于擴(kuò)散的檸檬精油氛圍的行為、激素和神經(jīng)元反應(yīng),發(fā)現(xiàn)大鼠在抬高加迷宮張開(kāi)臂中花費(fèi)的時(shí)間減少、熱傷害閾值提高、福爾馬林誘導(dǎo)的疼痛行為降低,下丘腦和中腦導(dǎo)水管周?chē)屹|(zhì)中的皮質(zhì)酮濃度降低,表明LEO會(huì)導(dǎo)致與焦慮和疼痛有關(guān)的神經(jīng)元回路發(fā)生顯著變化。但是LEO是多種成分的混合物,具有“多成分、多靶點(diǎn)”的特點(diǎn),對(duì)其抗焦慮癥的作用機(jī)制尚未得到很好的闡明。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是將藥物作用網(wǎng)絡(luò)與生物網(wǎng)絡(luò)相結(jié)合,基于“藥物-靶點(diǎn)-通路-疾病”模型,分析藥物與生物體之間的相互作用,系統(tǒng)地探討藥物與疾病之間的關(guān)系[11,12]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,對(duì)檸檬精油抗焦慮的關(guān)鍵成分、靶點(diǎn)和信號(hào)通路進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,并結(jié)合系列實(shí)驗(yàn)(抗氧化活性、細(xì)胞炎癥和小鼠焦慮模型)對(duì)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選出的檸檬精油中的關(guān)鍵成分、作用靶標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證,為檸檬精油抗焦慮的臨床應(yīng)用提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

材料:新鮮檸檬購(gòu)于寧波果品批發(fā)市場(chǎng),經(jīng)由浙江萬(wàn)里學(xué)院劉利萍教授鑒定確認(rèn);乙酸橙花酯(批號(hào)PPE8F-RN,東京化成工業(yè)株式會(huì)社,純度≥98%)。

試劑:CCK-8試劑盒(批號(hào)23131244,Biosharp);活性氧熒光法測(cè)試盒(批號(hào)UX030F603865,Elabscience);TNF-αELISA試劑盒(批號(hào)GY01X64 D0991,Elabscience);IL-6ELISA試劑盒(批號(hào)GY012R225072,Elabscience);NO含量檢測(cè)試劑盒(批號(hào)20220718,索萊寶);DPPH(批號(hào)GTBXB-QP,上海化成工業(yè)發(fā)展有限公司);ABTS(批號(hào)C14003395,麥克林);DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液(批號(hào)2204025,Viva Cell);胎牛血清(批號(hào)2011B,BOVOGEN);小鼠多巴胺受體D1 ELISA試劑盒(批號(hào)CV04TR4B0207,武漢伊萊瑞特);小鼠AMPA離子能谷氨酸受體2酶聯(lián)免疫試劑盒(批號(hào)E220ER059,武漢菲越生物);小鼠白細(xì)胞介-素6高敏ELISA試劑盒(批號(hào)70-EK206HS-96,聯(lián)科生物);蘇木精(批號(hào)SLBN3249V,SIGMA);伊紅(批號(hào)62R80915X,SIGMA)。

細(xì)胞:HaCaT人永生化表皮細(xì)胞(批號(hào)339817,北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司)。

動(dòng)物:25只ICR小鼠(SPF級(jí)),雌性,體質(zhì)量18～22 g,購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司,動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(滬)2022-0004。飼養(yǎng)于杭州赫貝科技有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物住所許可編號(hào)SYXK(浙)2020-0013,在溫度20～25 ℃、濕度40%～70%,12 h光暗周期,自由進(jìn)食(江蘇協(xié)合藥業(yè)生物工程有限公司提供飼料)飲水。操作符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)3R原則和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理要求(經(jīng)杭州赫貝科技有限公司動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心審批,審批號(hào)為HB2301006)。

儀器:氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(8890-5977B,安捷倫);紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(TU-1810,北京普析通用儀器公司);高速離心機(jī)(5417R,艾本德);霧化機(jī)(405E,魚(yú)躍);病理組織漂烘儀(TEC 2500 型,常州市郝思琳儀器設(shè)備有限公司);輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(RM2235 型,LEICA 公司);顯微鏡(BX43型,OLYMPUS);全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(SpectraMax Plus 384型,美國(guó)MD);恒溫培養(yǎng)箱(PYX-DHS500BS-Ⅱ型,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械公司)。

1.2 檸檬精油活性成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)篩選

采用水蒸氣蒸餾法提取檸檬果皮精油,氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)測(cè)定檸檬精油的組成,以血腦屏障(blood brain barrier,BBB)>0.3為篩選條件,獲得檸檬精油中的主要活性成分。利用中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(tái)(TCSMP)預(yù)測(cè)活性成分的作用靶點(diǎn),并用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行規(guī)范化。利用Cytoscape構(gòu)建“檸檬精油-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 焦慮癥靶點(diǎn)的收集

以“anxiety”和“anxiety disorder”為關(guān)鍵詞,檢索OMIM、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù),從GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)取3次中位數(shù),收集大于中位數(shù)的靶點(diǎn)為焦慮癥的潛在靶點(diǎn)。合并數(shù)據(jù)庫(kù)靶點(diǎn),刪除重復(fù)值,得到焦慮癥靶點(diǎn)。

1.4 檸檬精油-焦慮癥的共同靶點(diǎn)獲取及蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用Venny軟件和微生信網(wǎng)站中的可視化工具獲取檸檬精油與焦慮癥的共同靶點(diǎn)。將二者的共同靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI),其中物種設(shè)為“Homo sapiens”,置信度≥0.15,隱藏網(wǎng)絡(luò)中無(wú)聯(lián)系的節(jié)點(diǎn),利用Cytoscape軟件可視化。以度值評(píng)估靶點(diǎn)的重要性,預(yù)測(cè)關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 靶點(diǎn)功能富集分析與網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用David數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析,GO選擇生物過(guò)程(biological process,BP)、細(xì)胞組分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)3個(gè)模塊。KEGG分析選擇KEGG Pathway模塊。采用Cytoscape軟件,以排行前20條通路及其涉及的交集靶點(diǎn),以及這些靶點(diǎn)映射的活性成分構(gòu)建“檸檬精油-成分-靶點(diǎn)-通路-焦慮癥”網(wǎng)絡(luò)。

1.6 關(guān)鍵化合物及核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接

在PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)下載關(guān)鍵化合物分子結(jié)構(gòu)的SDF格式,通過(guò)Open babel將SDF格式轉(zhuǎn)化為mol2格式;通過(guò)RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)得到核心靶點(diǎn)的最佳蛋白結(jié)構(gòu)的PDB格式。利用1-Click Docking對(duì)活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接,并用Pymol軟件對(duì)分子對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化。

1.7 清除自由基活性

在試管中加入4 mL DPPH或ABTS工作液與1 mL樣品混勻,暗置反應(yīng)30 min,以95%乙醇調(diào)零,在518 nm或734 nm處測(cè)吸光值(A值)。以定容樣液溶劑代替樣液作為空白組,以VC作陽(yáng)性對(duì)照組。重復(fù)平行3次,按公式(1)計(jì)算自由基清除率(RC)。

RC=[(A1-A2)/A1]×100%

(1)

式中,A1為以樣液溶劑代替樣液測(cè)得的吸光度,A2為測(cè)定的樣品的吸光度。

1.8 細(xì)胞活性

細(xì)胞活性:收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至1×104個(gè)/孔,過(guò)夜,加入100 μL濃度為0(正常組,Nor)、0.001、0.01、0.1、1、10、100 μg/mL的樣品液,培養(yǎng)24 h后,每孔加入10 μL CCK-8溶液,繼續(xù)孵育4 h,在450 nm測(cè)定吸光值(A值)。按公式(2)計(jì)算細(xì)胞相對(duì)生長(zhǎng)率(RG)。

RG=[(A1-A2)/A1]×100%

(2)

式中,A1為正常生長(zhǎng)的細(xì)胞的吸光度,A2為加入測(cè)定的樣品的吸光度。

1.9 抗氧化及抗炎活性的測(cè)定

抗細(xì)胞氧化活性[13]:將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按2×105個(gè)/孔接種到6孔培養(yǎng)板中。置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。設(shè)置3個(gè)組:空白對(duì)照組(control,Con),只加2 mL培養(yǎng)基;模型組(model,Mod),加入2 mL含20 μg/mL LPS的培養(yǎng)基;樣品組,為3個(gè)劑量(0.25、0.5、1 μg/mL)且LPS的終濃度為20 μg/mL。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,收集上清液,離心去除殘留細(xì)胞。加入無(wú)血清培養(yǎng)基按1∶1 000稀釋DCFH-DA,37 °C孵育30 min。用無(wú)血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞三次以去除DCFH-DA。用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)(激發(fā)波長(zhǎng)500 nm、發(fā)射波長(zhǎng)525 nm)各組熒光值,并與空白對(duì)照組對(duì)比。

抗炎活性:按上述收集的細(xì)胞上清液,根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)分別測(cè)定NO、TNF-α及IL-6細(xì)胞因子水平。

1.10 小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)

小鼠分組與給藥:小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后,隨機(jī)分組,每組5只,設(shè)立空白對(duì)照組(control,Con)、模型組(model,Mod)、奧沙西泮陽(yáng)性組(Positive,Pos)(用生理鹽水配成100 μg/mL藥液,按照10 mL/kg灌胃給藥)、精油組(LEO)(用純凈水配成5%精油霧化液,每天同一時(shí)間段給予小鼠持續(xù)吸入霧化精油30 min,持續(xù)3周)、乙酸橙花酯單體組(neryl acetate,NA)(濃度5%,同精油組)。

小鼠焦慮模型建立:對(duì)照組小鼠正常飼養(yǎng)不采取任何刺激,其余四組均采用慢性不可預(yù)知應(yīng)激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)方法造模刺激[18]。隨機(jī)設(shè)置7種刺激,每天2種,每種刺激出現(xiàn)6次,分別是:冰水游泳(4 ℃,5 min)、熱應(yīng)激(45 ℃,5 min)、禁水(24 h)、禁食(24 h)、夾尾(1 min)、斜坡飼養(yǎng)、潮濕墊料(24 h),共計(jì)21 d。

水迷宮測(cè)試:21 d刺激后進(jìn)行,(1)定位航行:共5 d,每天同一時(shí)間開(kāi)始,測(cè)試四次。將小鼠頭朝向池壁輕輕地放在水里,從進(jìn)入水里到發(fā)現(xiàn)平臺(tái)為逃避潛伏期,時(shí)限為2 min,2 min后發(fā)現(xiàn)平臺(tái),小鼠在平臺(tái)上逗留15 s;如果2 min后小鼠沒(méi)有發(fā)現(xiàn)該平臺(tái),那么將小鼠引到該平臺(tái)上待30 s。(2)空間探索:第6 d,撤去隱藏在水面下的平臺(tái),選擇與平臺(tái)相對(duì)的象限中點(diǎn)作為入水點(diǎn),記錄小鼠在2 min內(nèi)穿越平臺(tái)的次數(shù)及在平臺(tái)象限的總時(shí)間。

海馬HE染色(hematoxylin-eosin staining)觀測(cè):小鼠麻醉后開(kāi)顱取海馬,海馬用體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定24 h,經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋后切片,HE染色,光鏡(×400)觀察海馬區(qū)狀態(tài)。

紋狀體中相關(guān)蛋白的ELISA測(cè)定:小鼠麻醉后開(kāi)顱取紋狀體(液氮凍存),稱(chēng)取樣品適量,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟檢測(cè)小鼠腦紋狀體中DRD1、GRIA2及IL6含量。

1.11 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 檸檬精油化學(xué)成分

檸檬精油的成分歸屬及鑒定信息的總離子流圖(見(jiàn)圖1)。由GC-MS鑒定出檸檬精油有30種成分,相對(duì)百分含量>1%的化合物有26種,占總峰面積的94.94%,含量最高的組分是β-紅沒(méi)藥烯,占比最高的成分為萜烯類(lèi)化合物。檸檬精油以嗅吸方式給藥,符合BBB篩選條件的成分有23種(見(jiàn)表1)。

表1 檸檬精油的有效成分

圖1 檸檬精油的總離子流圖

2.2 “檸檬精油-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

22種成分均有對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)共計(jì)76個(gè)(見(jiàn)圖2)。該網(wǎng)絡(luò)中總節(jié)點(diǎn)度值為249,平均節(jié)點(diǎn)度值為11.32,大于平均值的有11個(gè),分別是香葉醇、檸檬烯、巴倫西亞橘烯、亞油酸、乙酸橙花酯、異松油烯、β-石竹烯、β-蒎烯、α-萜品醇、甲基丁香酚、4-萜品醇。這11個(gè)成分可能起到重要作用。

圖2 “檸檬精油-成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 “檸檬精油-焦慮癥”的交集靶點(diǎn)及蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖

從GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選焦慮癥靶點(diǎn),經(jīng)除重和標(biāo)準(zhǔn)化,獲得焦慮癥靶點(diǎn)787個(gè)。將檸檬精油成分靶點(diǎn)和焦慮癥疾病靶點(diǎn)作韋恩圖,二者有23個(gè)共同靶點(diǎn)(見(jiàn)圖3)。

圖3 檸檬精油-焦慮癥交集靶點(diǎn)的韋恩圖

23個(gè)交集靶點(diǎn)的蛋白互作(見(jiàn)圖4)。String分析顯示平均節(jié)點(diǎn)度值為16.2,大于平均值的節(jié)點(diǎn)有12個(gè),它們是:白蛋白(ALB)、多巴胺受體D1(DRD1)、5-羥色胺受體2A(HTR2A)、溶質(zhì)載體家族6成員4(SLC6A4)、溶質(zhì)載體家族6成員3(SLC6A3)、γ-氨基丁酸A型受體亞基alpha2(GABRA2)、白細(xì)胞介素6(IL6)、肌動(dòng)蛋白β(ACTB)、單胺氧化酶A(MAOA)、5-羥色胺受體3A(HTR3A)、AMPA離子能谷氨酸受體2(GRIA2)、單胺氧化酶B(MAOB)。這12個(gè)蛋白可能為核心靶點(diǎn)。

圖4 交集靶點(diǎn)的PPI拓?fù)鋱D

2.4 GO富集分析

以P<0.05篩選得到BP 38項(xiàng)、CC 19項(xiàng)、MF 18項(xiàng)。選取-log10(P)值大小排序前12項(xiàng)得到GO條形圖(見(jiàn)圖5)。

圖5 檸檬精油干預(yù)焦慮癥的核心網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)的GO分析條形圖

GO富集結(jié)果表明:生物過(guò)程(BP)中交集靶點(diǎn)主要涉及了給藥反應(yīng)、離子跨膜運(yùn)輸、多巴胺分解代謝過(guò)程、單胺運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程;細(xì)胞組分(CC)中關(guān)鍵靶點(diǎn)主要分布于質(zhì)體膜、突觸后膜、漿膜的整體組成部分、細(xì)胞交界處等部位;分子功能(MF)中關(guān)鍵靶點(diǎn)主要與細(xì)胞外配體門(mén)控離子通道活性、單胺跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)器活性、藥物結(jié)合、一氧化二氮合成酶結(jié)合等有關(guān)。

2.5 KEGG通路富集分析

以P<0.05為標(biāo)準(zhǔn),共富集獲得31條KEGG通路,其中前20條KEGG通路(見(jiàn)圖6)。X軸為通路中關(guān)鍵基因數(shù)占比,Y軸為通路名稱(chēng);氣泡顏色即-log10(P)值,顏色越紅,P值越小,富集程度越好;氣泡大小表示參與通路的基因數(shù)的多少。

圖6 檸檬精油干預(yù)焦慮癥核心靶點(diǎn)的KEGG通路富集氣泡圖

20條通路中包括神經(jīng)活性配體-受體相互作用、羥色胺能突觸、尼古丁成癮、多巴胺能突觸、可卡因成癮、安非他命成癮等,所含交集靶點(diǎn)的數(shù)目相對(duì)較多,可能是檸檬精油抗焦慮癥的關(guān)鍵通路。

2.6 “檸檬精油-成分-靶點(diǎn)-通路-焦慮癥”拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)

前20條KEGG通路中涉及交集靶點(diǎn)有18個(gè),占交集靶點(diǎn)總數(shù)的78.26%。將這20條KEGG通路、18個(gè)交集靶點(diǎn)以及涉及的檸檬精油的19個(gè)活性成分進(jìn)行聯(lián)合分析,得到的網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖7)。

圖7 “檸檬精油-活性成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)

該網(wǎng)絡(luò)中有57個(gè)節(jié)點(diǎn),其中,檸檬烯、α-松油醇、甲基丁香酚、β-蒎烯、乙酸橙花酯、β-石竹烯、4-萜品醇的度值較大,表明是作用于焦慮癥的重要活性成分。γ-氨基丁酸A型受體亞基(GABRA1、GABRA2、GABRA5)、單胺氧化酶(MAOB、MAOA)、溶質(zhì)載體家族6(SLC6A3、SLC6A2)、多巴胺受體D1(DRD1)、AMPA離子型谷氨酸受體亞基2(GRIA2)、白細(xì)胞介素6(IL-6)等靶點(diǎn)的度值較大,可能是檸檬精油參與調(diào)控焦慮癥的重要靶點(diǎn)。

2.7 分子對(duì)接

根據(jù)“2.6”項(xiàng),選取檸檬烯、β-蒎稀、4-萜品醇、α-松油烯、乙酸橙花酯與DRD1、GRIA2、IL-6蛋白進(jìn)行分子對(duì)接(見(jiàn)表2)。

表2 檸檬精油活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的最低結(jié)合能

一般認(rèn)為分子對(duì)接結(jié)合能<-5.0 kcal/mol,表示配體與受體可以較好地自發(fā)結(jié)合。表2中的五個(gè)活性成分和DRD1的結(jié)合能均高于對(duì)照奧沙西泮,與GRIA2和IL6的結(jié)合能多數(shù)都低于-5 kcal/mol,但與對(duì)照奧沙西泮相比略差。總的來(lái)看,五個(gè)成分都能有效的與DRD1、GRIA2、IL-6受體結(jié)合。

以乙酸橙花酯為例,與靶蛋白DRD1、GRIA2與IL-6之間結(jié)合(見(jiàn)圖8)。乙酸橙花酯與DRD1、IL6的結(jié)合模式以鹽橋?yàn)橹鳌⑹杷饔脼檩o;乙酸橙花酯與GRIA2的結(jié)合模式以疏水作用為主、氫鍵為輔。

圖8 乙酸橙花酯與靶點(diǎn)對(duì)接可視化圖

2.8 體外抗氧化活性

檸檬精油抗DPPH、ABTS自由基的效果強(qiáng)于乙酸橙花酯(見(jiàn)圖9),且抗ABTS的效果優(yōu)于抗DPPH,與同濃度的陽(yáng)性對(duì)照VC相近。可見(jiàn)檸檬精油多成分之間有協(xié)同性。

圖9 檸檬精油和乙酸橙花酯對(duì)DPPH和ABTS的清除率

2.9 濃度對(duì)細(xì)胞活性的影響

檸檬精油和乙酸橙花酯對(duì)HaCaT細(xì)胞的活性影響(見(jiàn)圖10)。在0.001～1 μg/mL的濃度范圍內(nèi),幾乎不影響細(xì)胞的存活率,在一定程度上對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)還有促進(jìn)作用。當(dāng)濃度≥10 μg/mL時(shí),細(xì)胞的活力大大降低。因此,選擇精油濃度≤1 μg/mL進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖10 檸檬精油和乙酸橙花酯濃度對(duì)HaCaT活力的影響

2.10 細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性和抗炎癥的影響

精油對(duì)LPS刺激的HaCaT細(xì)胞中ROS的清除率(見(jiàn)圖11a)。通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度發(fā)現(xiàn),與正常組相比,模型組熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)(P<0.01),表示細(xì)胞炎癥造模成功。與模型組比較,檸檬精油與乙酸橙花酯對(duì)ROS都有清除作用,呈劑量依賴(lài)性。說(shuō)明檸檬精油及其關(guān)鍵單體乙酸橙花酯通過(guò)降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平緩解氧化應(yīng)激帶給細(xì)胞的炎癥損傷。

圖11 檸檬和乙酸橙酯對(duì)LPS刺激的HaCaT細(xì)胞的影響

通過(guò)對(duì)炎癥因子的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)(見(jiàn)圖11),模型組的NO、TNF-α及IL-6水平顯著升高(P<0.01),給予檸檬精油與乙酸橙花酯干預(yù)后有不同程度的降低,呈劑量依賴(lài)性。上述結(jié)果初步證明了檸檬精油及其關(guān)鍵成分乙酸橙花酯對(duì)炎癥相關(guān)因子和趨化因子的調(diào)節(jié)作用。

2.11 嗅吸檸檬精油對(duì)小鼠行為學(xué)的影響

與空白組比較,模型組小鼠在水中央?yún)^(qū)域活動(dòng)范圍、目標(biāo)象限游泳時(shí)間以及穿越次數(shù)明顯減少(P<0.01),說(shuō)明采用CUMS刺激造焦慮模型成功(見(jiàn)圖12)。檸檬精油組及乙酸橙花酯組與模型組比較,總體在水中央?yún)^(qū)域活動(dòng)距離、目標(biāo)象限游泳時(shí)間以及穿越次數(shù)都強(qiáng)于模型組,且檸檬精油組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),表明經(jīng)過(guò)嗅吸霧化的檸檬精油后,小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力均較模型組有一定的改善(見(jiàn)表3)。

表3 小鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖12 水迷宮軌跡圖

2.12 嗅吸檸檬精油對(duì)小鼠血漿中DRD1、GRIA2及IL6水平的影響

依據(jù)“2.6、2.7”網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)論,檸檬精油主要作用靶點(diǎn)是DRD1、GRIA2、IL-6蛋白,對(duì)血漿中上述蛋白的ELISA檢測(cè)結(jié)果(見(jiàn)表4)。

表4 嗅吸精油對(duì)小鼠血漿中DRD1、GRIA2、IL6含量的影響

焦慮組小鼠血漿中GRIA2、IL6含量較空白組上升,但DRD1較空白組有所下降,其中GRIA2、IL-6差異有極顯著性(P<0.01),造模成功;各給藥組與焦慮組比較,GRIA2、IL6含量均低于焦慮組,而DRD1含量有所上升,其中IL-6有顯著性差異(P<0.05),但是均高于空白組,表示嗅吸精油后對(duì)焦慮癥狀有不同程度的緩解但還沒(méi)有恢復(fù)到正常水平。

2.13 海馬組織的HE染色

小鼠海馬的HE染色可知,相比空白組,模型組小鼠海馬區(qū)存在大量細(xì)胞核固縮,神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生改變,神經(jīng)元有損傷。而嗅吸LEO和NA組小鼠的海馬中偶見(jiàn)核固縮,且癥狀有所緩減。表明LEO和NA都可以一定程度上保護(hù)和修復(fù)小鼠海馬組織的神經(jīng)元形態(tài),對(duì)焦慮狀態(tài)起到一定的改善作用(見(jiàn)圖13)。

圖13 小鼠海馬組織的HE染色(400×)

3 討論與結(jié)論

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法,挖掘檸檬精油抗焦慮的關(guān)鍵成分、作用靶點(diǎn)及信號(hào)通路,從而探索檸檬精油抗焦慮癥的潛在作用機(jī)制。通過(guò)構(gòu)建“檸檬精油-活性成分-靶點(diǎn)-通路-焦慮”網(wǎng)絡(luò),識(shí)別出檸檬精油抗焦慮的關(guān)鍵成分有19個(gè)(如檸檬烯、α-松油醇、甲基丁香酚、β-蒎烯、乙酸橙花酯、β-石竹烯、4-萜品醇等),關(guān)鍵作用靶點(diǎn)有18個(gè)(如GABRA1、GABRA2、GABRA5、MAO、SLC6A3、SLC6A2、DRD1、GRIA2、IL-6等),涉及的主要通路有神經(jīng)活性配體-受體相互作用、羥色胺能突觸、多巴胺能突觸、尼古丁成癮、可卡因成癮等信號(hào)通路。

檸檬精油的揮發(fā)性物質(zhì)以萜類(lèi)化合物含量較高,已有研究發(fā)現(xiàn)[14,15]萜類(lèi)具有抗焦慮、抑郁以及改善認(rèn)知障礙的作用。乙酸橙花酯具有抗炎和抗氧化效果,廣泛作用于如神經(jīng)炎、焦慮癥等的治療[16];通過(guò)定量構(gòu)效關(guān)系模型計(jì)算對(duì)多巴胺受體D2、血清素轉(zhuǎn)運(yùn)體和5-羥色胺受體1A的親和力,得出乙酸橙花酯可能是有效的抗抑郁藥和神經(jīng)抑制劑[17]。乙酸橙花酯能調(diào)控單胺氧化酶A,防止5-羥色胺在單胺氧化酶A作用下生成5-羥基吲哚乙酸,使突觸間隙的5-羥色胺濃度減少,從而起到緩解焦慮的作用[18]。

DRD1屬于代謝型G蛋白偶聯(lián)受體,可以通過(guò)非受體酪氨酸激酶以Gαq蛋白依賴(lài)抑制DRD1的方式減少離子型谷氨酸受體介導(dǎo)的脊髓神經(jīng)元的激活,從而緩解慢性疼痛[19],也有研究表明可通過(guò)電針刺激杏仁基底外側(cè)激活DRD1來(lái)緩解小鼠焦慮行為導(dǎo)致的神經(jīng)損傷[20]。由GRIA2編碼的亞基在神經(jīng)元中高度表達(dá),敲除GRIA2后,小鼠在高架迷宮中表現(xiàn)出焦慮感降低[21]。IL-6是一種與中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子,在小膠質(zhì)細(xì)胞中激活紋狀體腦區(qū)可上調(diào)包括IL-6在內(nèi)的炎性分子表達(dá),并且誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生負(fù)性情感以及快感缺失[22]。

分子對(duì)接驗(yàn)證了檸檬精油的核心化合物乙酸橙花酯、檸檬烯、β-蒎稀、4-萜品醇、α-松油烯與核心靶標(biāo)DRD1、GRIA2、IL-6蛋白之間的相互結(jié)合能均低于-5 Kcal/mol,具有較好的結(jié)合活性,表明檸檬精油具有抗焦慮癥的良好分子基礎(chǔ)。表明檸檬精油抗焦慮的作用機(jī)制是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路的相互調(diào)節(jié)作用實(shí)現(xiàn)的。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)結(jié)果,在細(xì)胞中對(duì)檸檬精油進(jìn)行抗焦慮體外驗(yàn)證。

一旦機(jī)體的抗氧化機(jī)制遭到破壞,可產(chǎn)生氧化應(yīng)激,導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生,促進(jìn)炎癥發(fā)生[23]。DA能神經(jīng)元因氧化性損傷會(huì)導(dǎo)致焦慮的發(fā)生。通過(guò)對(duì)DPPH、ABTS自由基清除檢測(cè),檸檬精油的清除效果優(yōu)于單體乙酸橙花酯。同時(shí)檸檬精油能夠降低LPS誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS水平且呈劑量依賴(lài)性,能有效降低NO、TNF-α和IL-6炎癥因子,從而緩解氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞炎癥損傷。檸檬精油也可改善小鼠焦慮時(shí)的認(rèn)知能力,對(duì)組織損傷有所緩減,并降低血清中相關(guān)蛋白含量。

綜上所述,本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,篩選出了檸檬精油干預(yù)焦慮癥的主要化學(xué)成分、作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路,并通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,得出檸檬精油中的檸檬烯、乙酸橙花酯等成分通過(guò)對(duì)DRD1、GRIA2、IL6等靶點(diǎn)調(diào)控多條信號(hào)通路,降低細(xì)胞氧化應(yīng)激、抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng),從而干預(yù)焦慮癥。

研究結(jié)果表明檸檬精油成分中化合物的可調(diào)控不同靶點(diǎn),而同一靶點(diǎn)可干預(yù)不同的生物學(xué)過(guò)程及信號(hào)通路,體現(xiàn)了檸檬精油多通路、多靶點(diǎn)聯(lián)合作用的特點(diǎn)。但限于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法論的局限性以及中藥組分在提取時(shí)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的復(fù)雜性,本研究主要是以生物信息學(xué)與生化指標(biāo)的結(jié)果為基礎(chǔ),后續(xù)將在此基礎(chǔ)進(jìn)一步完善從基因組或蛋白組學(xué)方面進(jìn)行驗(yàn)證,進(jìn)而明晰檸檬精油的主要調(diào)控靶點(diǎn)與作用機(jī)制。