常見塑料的微生物降解研究進展

陳張燕,鄭燕虹,劉湘晴,李海玥,夏 麗,楊坪萍,李 芹,2,劉 峰,2*,張懷東,2*

(1.福建師范大學生命科學學院,福建 福州 350117;2.工業微生物發酵技術國家地方聯合工程研究中心,福建 福州 350117)

1 塑料污染概況

塑料產品由于生產成本低、耐用性好,廣泛應用于各個領域。塑料可以分為熱塑性塑料和熱固性塑料。目前最常使用的塑料是聚乙烯(polyethylene,PE)、聚丙烯(polypropylene,PP)、聚氯乙烯(polyvinyl chloride,PVC)、聚對苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate,PET)、聚氨酯(polyurethane,PU)、聚苯乙烯(polystyrene,PS),除了PU是熱固性塑料外,其余5種均為熱塑性塑料。廣泛應用于包裝材料、薄膜、飲料瓶和玩具的主要是PE、PET、PP和PS;PVC廣泛應用于建筑材料、管道和電線電纜;PU則被應用于輪胎和保險杠等;產量較大的依次是PE、PP、PVC。據估計,全世界原始塑料的總產量達到83 億t,僅有20%左右的廢棄塑料被回收利用或者焚燒,其余的都堆積在垃圾填埋場或者自然環境中[1]。塑料垃圾已經被發現出現在地球的多個區域,例如南大洋的海洋沉積物和地表水[2]、北極弗拉姆海峽、瑞士阿爾卑斯山[3]等。

廢棄塑料經過焚燒處理,會產生有毒的揮發性廢物,如呋喃、二噁英、硫化物等,這些都被認為是潛在的致癌物[4],會對空氣造成嚴重的污染。經過填埋處理的廢棄塑料會滲入土壤,毒害土壤物種,改變土壤微生物生態環境[5]。散布在水環境中的廢棄塑料對水生生態系統造成巨大的破壞,會纏繞水生動物,攝入后導致腸道堵塞[6],并且在非生物因素或生物因素作用下形成小粒徑(<5 mm)的微塑料,導致微塑料污染。微塑料在紫外線照射下會產生各種降解產物,其中氣體產物,主要是揮發性有機化合物(volatile organic compounds,VOC)通常被忽視,對人類和環境造成潛在未知風險[7]。環境中的塑料碎片甚至可以分解為納米(<1 000 nm)塑料,納米塑料更容易被生物體吸收,對生態和健康的威脅可能比微塑料更大[8]。海洋中的魚類[9]、蝦類[10]、貝殼類[11]均被檢測出微塑料的存在。微塑料不僅可以改變土壤結構和微生物群落,還可以通過植物根系進入植物體內[12],開發和完善生物降解塑料的綠色循環工藝對確保未來的食品安全以及減少環境污染具有重大意義。Sanchez-Vidal等[13]發現,海洋海藻Posidonia會將塑料顆粒卡住,Posidonia球形團聚體每年可以捕獲多達8.67億個塑料微粒。Wang等[14]發現,大型蚤暴露在不同粒徑的PE微塑料MP-20(20 μm)和MP-30(30 μm)中均導致存活率和心率顯著降低。Wang等[15]研究發現,蜜蜂攝入的100 nm的PS會堵在花粉孔上,干擾腸道菌群利用花粉中的營養,導致腸道發育不良和炎癥,最終導致蜜蜂體重顯著減輕和死亡率提高。

2 塑料的微生物降解

2.1 聚乙烯(PE)

PE是由乙烯聚合而成的最豐富的石油基塑料合成材料,廣泛應用于日常生活、工業及農業。2020年全球PE產能為12 690.6 萬t,產量為10 630.8萬t,產量約占塑料總產量的1/4。PE生產方法按聚合壓力的高低可以分為高壓法、中壓法、低壓法,其中低壓法可以分為淤漿法、溶液法、氣相法。主要的PE產品有:低密度PE(low-density polyethylene,LDPE)、線性低密度PE(linear low-density polyethylene,LLDPE)和高密度PE(high-density polyethylene,HDPE)。PE塑料的回收方式主要有機械回收、化學回收和能量回收。PE的聚合物鏈非常穩定,化學回收相對困難,主要利用機械回收方式。2021年, Haussler等[16]在分子水平上使用了“斷點”的方法回收PE塑料,更加節能,且回收率高達96%。

已報道的降解PE的微生物主要有細菌、真菌和藻類,其中數量最多的是細菌(表1)。

表1 PE降解菌株Tab.1 PE-degrading strains

Balasubramanian等[21]篩選出2株高效降解HDPE菌株Pseudomonassp.GMB7和Arthrobactersp.GMB5,孵育30 d后HDPE樣品分別失重15%和12%;Bhatia等[23]篩選出LDPE降解菌株PseudomonascitronellolisEMBS027,4 d降解率達到最高(17.8%);Usha等[24]分離出鏈霉菌StreptomycesKU8,60 d降解率為22.58%±0.03%;Gilan等[26]分離出1株細菌RhodococcusruberC208,培養30 d后PE薄膜降解率為8%;Yang等[36-37]從印度粉蛾(Plodiainterpunctella)腸道中分離出2株降解PE菌株EnterobacterasburiaeYT1和Bacillussp.YP1,培養60 d后分別能降解6.1%±0.3%和10.7%±0.2%的PE薄膜;Montazer等[46-47]分離出細菌AcinetobacterpittiIRN19,孵育28 d能夠將PE薄膜降解26%;Hadad等[50]分離出細菌Brevibaccillusborstelensis,孵育30 d后PE質量和分子量分別降低了11%和30%;Elsamahy等[54]構建了從白蟻腸道中分離的SterigmatomyceshalophilusSSA1575、MeyerozymaguilliermondiiSSA1547和MeyerozymacaribbicaSSA1654組成的酵母菌群,該菌群導致LDPE拉伸強度降低63.4%、凈質量減少33.2%。

目前已發現的能降解PE的酶主要是漆酶和烷烴羥化酶。Santo等[27]用細胞外漆酶孵育的類似PE的FTIR分析顯示羰基峰增加,表明漆酶在PE的生物降解中起主要作用。烷烴羥化酶系統中最重要的酶是單加氧酶,不同的細菌中烷烴羥化酶的數量和類型差異很大。大多數PE降解酶只能對PE進行末端氧化(聚烯烴中末端碳被氧化)和亞末端氧化(聚烯烴中靠近末端碳被氧化)。例如,漆酶和錳過氧化物酶可以進行末端氧化,AlkB家族可以通過末端或亞末端羥基化反應降解PE的主要成分正烷烴[61]。紅球菌TMP2基因組編碼5個AHs(alkB1,alkB2,alkB3,alkB4,alkB5),而銅綠假單胞菌基因組編碼2個AHs(alkB1、alkB2)[31]。Yoon等[17]研究表明,P.aeruginosaE4的AlkB酶在LMWPE礦化和生物降解轉化為CO2過程中發揮核心作用,在菌株E4中克隆到alkB基因,重組菌株表達的AlkB酶參與了低分子量PE生物降解的早期階段。

Elsamahy等[54]構建了從白蟻腸道中分離的酵母菌群,并提出了假設LDPE生物降解途徑,揭示了幾種代謝產物的形成過程。該生物降解機制始于烷烴(如十三烷)的形成,再轉化為較低分子量的烷烴(如十二烷);十二烷在乙醇和由漆酶、木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶的活性形成的乙基自由基的存在下轉化為正十二烷-1-醇,隨后轉化成正十二烷酸(羧酸)。十四烷酸在酵母細胞中與輔酶A反應產生十四酰輔酶A(其轉化為脂肪酸),并參與β-氧化以產生乙酰輔酶A,乙酰輔酶A參與三羧酸循環(tricarboxylic acid cycle,TCA)并隨后礦化為CO2和H2O。

烷烴羥化酶是細菌有氧降解烷烴的關鍵酶。第一步是C-C鍵的羥基化,釋放伯醇或仲醇,氧化生成酮或醛,隨后生成親水羧酸[62];由于羧酸的形成,微生物氧化減少了羰基的數量。羧基正鏈烷烴類似于脂肪酸,由細菌通過β-氧化途徑分解(圖1)。Usha等[24]和Yoon等[17]已經證明細菌通過 β-氧化途徑和三羧酸循環對正烷烴進行微生物氧化。在此過程中通過酶催化降解產生的氧化產物可能被微生物細胞吸收,從而被分解代謝。

圖1 PE的生物降解過程Fig.1 Biodegradation process of PE

2.2 聚丙烯(PP)

PP是一種半結晶熱塑性塑料。PP按單體種類可以分為:均聚PP(polypropylene homopolymer,PP-H)、無規共聚PP(polypropylene random,PP-R)和嵌段共聚PP(polypropylene block copolymer,PP-B)。2019年,Plastics Europe報道PP塑料的需求占塑料總需求的19.3%。2020年,PP全球產量為7 539.5萬t。PP的傳統生產方法主要有溶液法、淤漿法、本體法、氣相法和本體-氣相法,隨著生產工藝的不斷改進,淤漿法逐漸被淘汰。目前,PP的先進生產工藝有Spheripol工藝、Spherizone工藝和Borstar工藝[63]。PP塑料的回收方式主要有材料資源化、化學回收和能量回收。材料資源化回收主要對廢棄PP進行簡單再生利用和改性再生利用;化學回收主要采用熱分解法;由于能量回收采用焚燒技術會產生大量有害氣體、工藝流程長且費用高,故大受限制。

目前,已發現的PP降解菌株數量較少(表2)。

表2 PP降解菌株Tab.2 PP-degrading strains

Auta等[66]分離出2株細菌Bacillussp.和Rhodococcussp.,孵育40 d后PP樣品失重率分別為4.0%和6.4%;Skariyachan等[67]分離出8株塑料降解菌,其中,AneurinibacillusaneurinilyticusbtDSCE01、BrevibacillusagribtDSCE02、Brevibacillussp.btDSCE03和BrevibacillusbrevisbtDSCE04混合菌群的降解率最高且高于單一菌株,50 ℃下培養140d后PP降解率高達56.3%±2.0%;Jeon等[68]篩選出細菌StenotrophomonaspanacihumiPA3-2,堆肥90 d后對LMWPP-1(Mn2 800,Mw10 300)的降解率為20.30%±1.39%,對LMWPP-2(Mn3 600,Mw17 900)的降解率為16.60%±1.70%。

2.3 聚氯乙烯(PVC)

PVC是由引發劑作用于氯乙烯單體聚合而成的一種熱塑性塑料。2020年,全球PVC產量為5 431萬t。PVC的工業化生產工藝一般有4種:懸浮聚合、本體聚合、乳液聚合和溶液聚合[69]。根據聚合方法的不同可以將PVC分為:懸浮法PVC、乳液法PVC、本體法PVC和溶液法PVC。PVC塑料的回收方式主要有機械回收、化學回收和能量回收。由于化學回收的工藝復雜,成本較高;能量回收會產生有害氣體,PVC的回收方式主要采用機械回收。

目前,關于PVC聚合物及塑料的生物降解的報道較少,多數利用真菌進行PVC塑料降解(表3)。

表3 PVC降解菌株Tab.3 PVC-degrading strains

Das等[71]篩選出2株細菌PseudomonasaeruginosaNBTU01和Achromobactersp.NBTU02,180 d后對PVC的降解率分別為35.65%和34.63%;Webb等[74]分離的真菌Aureobasidiumpullulans使PVC薄膜質量損失3.7%±0.7%;Ali等[75]篩選出4株PVC降解真菌,其中PhanerochaetechrysosporiumPV1的降解性能最高;Giacomucci等[77]分離出2株細菌Pseudomonascitronellolis和Bacillusflexus,其中,Pseudomonascitronellolis在培養30 d后就能部分降解PVC薄膜。

目前尚未發現直接參與PVC降解的酶的相關報道。Sumathi等[76]分離出1株產漆酶的PVC降解菌株Cochliobolussp.,以低密度PVC為唯一碳源,經菌株處理的PVC與未經處理的PVC存在明顯差異,推測漆酶是Cochliobolussp.降解PVC的關鍵酶。

2.4 聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)

PET是由對苯二甲酸與乙二醇縮聚而成的熱塑性塑料,分纖維和非纖維兩大類。PET的生產工藝主要有3種:酯交換法、直接酯化法和環氧乙烷法。工業上PET塑料的回收方式主要是機械回收和化學回收,機械回收相對成熟,化學回收成本較高,因此,PET的回收方式主要采用機械回收。

目前,關于PET微生物降解的報道較少,已發現的降解PET的微生物主要有Ideonellasakaiensis[78]、Micbacteriumoleivorans[79]、Comamonastestosteroni[80]、Thermobifidasp.[81-83]、Fusariumsp.[84-85]和Streptomycessp.[86](表4)。

表4 PET降解菌株Tab.4 PET-degrading strains

已研究的能降解PET的酶主要為酯酶、角質酶和脂肪酶。Kleeberg等[88]從Thermobifidafusca中純化出脂肪酶BTA-1,該酶可以在3周內將商業PET飲料瓶和PET顆粒水解40%～50%,這是較早的對PET降解酶的報道。

Sulaiman等[89]從枝葉堆肥的微生物基因組克隆了LCC角質酶編碼基因,利用大腸桿菌對LCC進行表達,經鑒定,LCC具有降解聚己內酯和PET的能力,且酶活較高,LCC為PET降解酶的分子機理提供了很好的模型,并且具有較高的應用價值。Tournier等[90]通過飽和突變和定向進化構建了LCC的突變體ICCG,其催化溫度和降解效率都得到較大的提升。

Yoshida等[78]鑒定了Ideonellasakaiensis201-F6中2個起關鍵作用的酶PETase和MHETase。Joo等[91]解析了PETase的分子結構,通過蛋白質工程構建了具有增強蛋白質活性的IsPETase突變酶,并通過實驗證明:201-F6可以附著在PET塑料表面,利用胞外酶PETase將PET降解成單(2-羥乙基)對苯二甲酸(monohydroxyethyl terephthalate,MHET), 同時產生微量的雙(2-羥乙基)對苯二甲酸[bis(2-hydroxyethyl) terephthalate,BHET],MHET可以進入細胞,被MHETase進一步降解成乙二醇(ethylene glycol,EG)和對苯二甲酸(terephthalate,TPA),如圖2所示。

圖2 PET的生物降解過程Fig.2 Biodegradation process of PET

Cui等[92]將PETase突變為更嗜熱的DuraPETase,該突變酶在60 ℃高溫下孵育3 d仍能保持活性,對PET薄膜的降解率達到23%。Lu等[93]使用機器學習系統預測PETase的突變,通過對突變體進行工程改造,確定了一種命名FAST-PETase的突變酶;FAST-PETase可以在1周內幾乎完全降解PET廢舊塑料。該課題組展示了一個閉環PET回收過程,首先使用FAST-PETase快速降解PET廢舊塑料,然后回收單體并重新聚合成原始PET,該過程可在短短幾天內完成。

2.5 聚氨酯(PU)

PU是一種主鏈含有氨基甲酸酯基的大分子化合物。PU主要分為兩大類:以二異氰酸酯和端羥基聚酯為原料制備的聚酯型PU、以二異氰酸酯和端羥基聚醚為原料制備的聚醚型PU。PU塑料的回收方式主要有機械回收、化學回收和能量回收。機械回收主要有粘結成型、用作填料和熱壓成型;化學回收主要有醇解法、水解法和堿解法[94]。Liu等[95]研究了亞/超臨界甲醇降解PU廢舊塑料的過程,發現,在230 ℃、7.2 MPa、50 min條件下,PU廢舊塑料的降解率超過 90%,降解液主要成分含有 4,4′-二苯基甲烷氨基甲酸酯、聚酯二醇和1,4-丁二醇。

目前已報道的PU降解微生物中,真菌的數量較多,主要來源于土壤(表5)。

表5 PU降解菌株Tab.5 PU-degrading strains

Peng等[98]篩選出3株細菌,其中PseudomonasputidaA12的降解活性最高,4 d內可以降解92%的水性PU(Impranil);Nakajima-Kambe等[99]篩選出2株聚酯型PU降解菌,其中,ComamonasacidovoransTB-35培養7 d后對PU的降解率為48%;Crabbe等[103]從華盛頓特區花園土壤中分離出4株真菌,分別為Curvulariasenegalensis、Fusariumsolani、Aureobasidiumpullulans和Cladosporiumsp.,其中Curvulariasenegalensis的降解活性最高;Khan等[106]分離出真菌Aspergillustubingensis,可以在自然環境中使難降解塑料在2周內出現明顯的生物降解跡象,在液體培養基中使PU薄膜在2個月內完全降解;Russell等[111]分離得到1株植物內生真菌Pestalotiopsismicrospora,2周內對PU的降解率達到99%。

目前,對PU降解微生物中相關酶的分離純化已有不少報道,但其降解機理是通過測定酶學性質和降解產物推測得到的,還未獲得PU降解的完整歷程。Peng等[98]通過酶學分析檢測到PseudomonasputidaA12能分泌酯酶,該酶具有PU降解活性,分子量45 kDa;Akutsu等[100]對ComamonasacidovoransTB-35進行研究,發現菌株TB-35能分泌1種新型的塑料降解酯酶,可以水解PU的酯鍵;Crabbe等[103]通過二乙酸熒光素水解測試發現Curvulariasenegalensis可分泌胞外酯酶;Russell等[111]發現Pestalotiopsismicrospora分泌的絲氨酸水解酶對降解PU起關鍵作用。

2.6 聚苯乙烯(PS)

PS是由苯乙烯聚合而成的熱塑性塑料。PS的聚合方式有本體聚合、溶液聚合、懸浮聚合及乳液聚合,工業上主要采用本體聚合和懸浮聚合。PS主要分為:普通PS(general purpose polystyrene,GPPS)、可發性PS(expandable polystyrene,EPS)、高抗沖PS(high impact polystyrene,HIPS)和間規PS(syndiotacticpolystyrene,SPS)。PS塑料的回收方式主要有材料資源化和化學回收。材料資源化一般采用直接回收和改性回收兩種方式。Ward等[113]研究了一種新的PS回收方式,即將PS熱解為苯乙烯油,然后通過假單胞菌Aca-3(NCIMB 41162)將苯乙烯油轉化為聚羥基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates,PHA)。

目前,已發現的降解PS的微生物主要是細菌,其中數量較多的是假單胞菌和芽孢桿菌(表6)。

表6 PS降解菌株Tab.6 PS-degrading strains

O′Connor等[115]分離出可以利用苯乙烯作為唯一碳源的細菌PseudomonasputidaCA-3;Kim等[118]從大麥蟲腸道中分離得到1株PS降解細菌PseudomonasaeruginosaDSM50071;Ganesh-Kumar等[120]篩選出1株細菌BacillusparalicheniformisG1,培養60 d后可降解34%的PS薄膜;Yang等[126]發現黃粉蟲幼蟲在16 d內可將攝入的47.7%的PS塑料碳轉化為CO2。

O′Connor等[115]對菌株PseudomonasputidaCA-3誘導和抑制苯乙烯降解的分子機制進行研究,證明了谷氨酸和檸檬酸鹽均能抑制苯乙烯降解;Ganesh-Kumar等[120]研究發現,編碼單加氧酶、雙加氧酶、過氧化物酶、酯酶和水解酶的基因參與了PS薄膜的降解;Yang等[126]發現,在PS降解過程中,菌株PseudomonasaeruginosaDSM50071中絲氨酸水解酶(serine hydrolase,SH)的基因表達水平高度上調,通過SH抑制劑處理實驗進一步證實了PS的酶介導生物降解。

3 結語

塑料由于其穩定的化學結構、較高的分子量、極強的疏水性和結晶度,在自然界中很難被降解,主鏈中具有可水解酯鍵的PET、PU較具有碳鏈骨架的PE、PP、PS、PVC更容易被生物降解。已報道的具有塑料降解能力的微生物主要是PE和PU降解菌,其它塑料降解菌的報道較少,細菌主要有假單胞菌屬和芽孢桿菌屬,真菌主要有曲霉菌屬和地霉菌屬;有關PE和PET降解酶的研究報道相對較多,還未發現與PP和PVC降解相關的酶。大多數PE降解酶只能對PE進行末端氧化和亞末端氧化。PET生物降解近年來在微生物和酶機制方面取得了顯著進展,更接近工業化實施,處于更高的技術水平[127]。Tournier等[90]通過飽和突變和定向進化構建了LCC的突變體ICCG,以此為基礎,建立了PET循環工藝,為PET的工業化循環利用提供了很好的范例。

目前除了PE和PET,其它塑料的生物降解的完整途徑和機制尚不清楚。在PE降解過程中C-C鍵在烷烴羥化酶的作用下羥基化,釋放伯醇或仲醇,氧化生成酮或醛,隨后生成親水羧酸[17]。PET降解酶PETase可以將PET降解成單(2-羥乙基)對苯二甲酸(MHET),同時產生微量的雙(2-羥乙基)對苯二甲酸(BHET),MHET可以進入細胞,被MHETase進一步降解成乙二醇(EG)和對苯二甲酸(TPA)[91]。

真實環境條件復雜多變,生物降解可能會與其它環境行為同時發生、相互影響。有關降解菌和降解酶的研究仍停留在實驗室階段,模擬工業化應用對于深入研究回收工藝及實際應用具有重要意義。雖然生物降解是一種綠色環保的塑料廢棄物處理方式,但效率仍然較低。目前發現的能高效降解塑料的酶很少,大部分塑料的降解機制及完整途徑尚未發現。利用現代微生物育種技術提高降解菌的降解效率,依托基因組學深入挖掘降解基因及降解酶,通過合理的蛋白質工程和定向進化的方法提高降解酶的活性和穩定性,這些措施都可以在提高效率的同時使其更適應于工業生產需要。此外,塑料的大分子聚集體結構阻礙了酶的降解效率,物理或化學預處理有助于破壞這些大分子結構以提高酶的降解效率。將溫和的微生物法或酶法降解與物理或化學處理工藝相結合開發可持續的塑料降解和循環利用工藝具有廣闊的應用前景。