肝細胞癌復發進程中DNA修復調節的蛋白質組學分析及驗證

常 凱， 王艷艷， 江忠勇， 孫 巍， 劉晨霞， 那琬琳， 許宏宣， 謝 靜， 劉 媛， 陳 敏，5

1 中國人民解放軍西部戰區總醫院檢驗科， 成都 610083

2 成都市第七人民醫院檢驗科，成都醫學院附屬腫瘤醫院， 成都 610041

3 四川省疾病預防控制中心微生物檢驗所， 成都 610041

4 成都市實驗外國語學校生物教學與研究組， 成都 611134

5 西南大學藥學院/中醫藥學院， 重慶 400715

我國每年肝細胞癌（HCC）新發病例數超全球50%以上，死亡率逐年升高［1］。HCC 的發生發展受一系列遺傳和環境因素共同作用，致病機制復雜多樣。手術切除目前仍是主要治療方法，但術后的高復發率（5 年復發率＞60%）使得預后并不理想［2］。影響肝癌術后復發的因素眾多，如臨床病理學特征、伴發的肝病背景、宿主炎癥免疫反應狀態等［3］。近年來提出，細胞穩態的破壞及遺傳信息的不穩定性是腫瘤復發的重要誘因。隨著細胞生物學、遺傳與表觀遺傳學，特別是組學技術的進步與發展，對肝癌復發的分子機制認識也逐漸加深，但仍不明確［4］。本研究應用蛋白質組學標記定量分析技術對肝癌復發相關差異蛋白進行檢測和注釋分析，以期進一步對遺傳信息穩定性遺傳機制進行探討。

1 材料與方法

1.1 材料 來源于西部戰區總醫院2013—2020年凍存的肝癌組織樣本。確診HCC 且行肝切除術后5 年預后良好的肝癌組織10 例作為HCC 未復發組；確診HCC 且行肝切除術后2 年內復發的肝癌組織10 例為HCC 復發組。20 例樣本pTNM 分期均為Ⅱb 期，中低分化。排除糖尿病、冠心病、高血脂、高血壓、腎病、遺傳病和自身免疫系統疾病。采用樣本為患者首次肝癌切除術中所切除的組織，并置于保護液中液氮保存，備用。

1.2 藥物及試劑 十二烷基硫酸鈉-SDS（中國索萊寶）、甲酸鈉（美國Sigma-Aldrich 公司）；蛋白酶抑制劑（瑞士Roche公司）；尿素、二硫蘇糖醇、四乙基溴化銨（美國Sigma-Aldrich 公司）；BCA 蛋白檢測試劑盒（美國Millipore 公司），胰蛋白酶（美國Promega 公司）；甲酸銨（美國Sigma-Aldrich公司）；乙腈（美國Supelco公司）。

1.3 方法

1.3.1 總蛋白提取 將7 mol/L 尿素，1 mg/mL 蛋白酶抑制劑和2% SDS 充分混合配置樣本裂解緩沖液，加入待測樣本后于冰面上進行超聲破碎，5 min 后進行冷凍高速離心，15 000 r/min，20 min，吸取上清液待用。

1.3.2 蛋白消化與標記 使用BCA 蛋白檢測試劑盒測定上清液中的總蛋白濃度。將每100 μg 蛋白移至新的試管中，并用8 mol/L 尿素稀釋至100 μL。樣本中加入11 μL二硫蘇糖醇（濃度為1 mol/L），37 ℃孵育1 h。將樣品置于10 K 超濾管，14 000 r/min 離心10 min。取120 μL 碘乙酰胺（濃度為55 mmol/L）加入樣品中，避光孵育20 min，8 mol/L尿素被10 mmol/L三乙基碳酸氫銨替換3次。測序級別改良的胰蛋白酶于37 °C 孵育12 h。消化后的樣品13 500 r/min 離心15 min。真空干燥機干燥后在0.5 mol/L三乙基碳酸氫銨中溶解。取等量蛋白進行Trypsin酶切，得到相應樣品的多肽；分別用不同的串聯質量標簽（TMT）對樣品進行標記，室溫下放置2 h。標記樣本在真空中混合并干燥。

1.3.3 高pH 反相分離 配置緩沖液A：20 mmol/L 甲酸銨溶液，使用氫氧化銨滴定至pH 為10.0；配置緩沖液B：20 mmol/L 甲酸鈉，溶劑為80%乙腈，使用氫氧化銨滴定至pH為10.0。使用緩沖液A對肽混合物進行溶解，使用Thermo Fisher Scientific Ultimate 3000 高效液相色譜系統對樣本進行分離，反向分離柱為美國Waters 公司C18反相柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。高pH分離用線性梯度方式進行，緩沖液B 從5%起始至45%，時長40 min，柱溫30 ℃，流速1 mL/min。分離12個餾分用于下一步檢測。

1.3.4 低pH nano-HPLC-MS/MS 檢測 肽段分餾組分用溶劑C（含0.1%甲酸的超純水）分別溶解，液相色譜分離，串聯質譜分析。10 μL樣品上樣過色譜柱（Thermo Scientific Acclaim PepMap C18，100 μm×2 cm），流速10 μL/min，3 min。隨后將線性梯度為2%～40%的D 液（含0.1%甲酸的乙腈）分別流經分析柱（Acclaim PepMapC18，75 μm×15 cm）70 min，流速300 nL/min，電壓2 kV。

1.4 數據處理

1.4.1 蛋白鑒定與定量 在所有樣本的蛋白中光譜值≥2的樣品定義為特定蛋白并進行蛋白定量。蛋白相對定量是基于報告離子比率，其反映了肽的相對豐度。使用medians 對Mascot 搜索結果進行平均和量化。蛋白的倍比差異＞1.2或＜0.83，且P＜0.05認為具有差異表達［5］。

1.4.2 蛋白功能注釋與富集分析 用GO、KEGG 和COG/KOG數據庫對蛋白進行注釋，以獲得其功能。在P≤0.05差異表達蛋白中篩選關鍵信號通路［6］。

1.4.3 統計學方法 應用SPSS 24.0 軟件對數據結果進行統計分析。正態分布的計量資料以±s表示，2組間比較采用成組t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

20世紀60年代已經開始利用近紅外光譜對谷物的蛋白質及其他成分進行檢測。同時研究人員還采用近紅外光譜技術對小麥的蛋白質、脂肪、淀粉等多種檢測指標進行檢測與分析。近紅外光譜技術有效地提高了小麥的檢測，對小麥的檢測具有重要意義。近年來，近紅外光譜技術在脫氧萎鐮菌醇與小麥優良品種篩選檢測中有了新的發展。

1.5 差異蛋白驗證分析 應用差異蛋白ELISA 試劑盒對差異蛋白進行驗證分析，ELISA 試劑及抗體購于成都元極生物科技有限公司，使用分光光度儀對熒光值進行判讀分析。

2 結果

2.1 HCC復發組與未復發組表達量差異蛋白富集 經全蛋白質組學定量分析后，共鑒定得到唯一肽段數38 575個，蛋白14 578 個，通過對信號通路的分析確定蛋白參與的最主要生化代謝途徑和信號轉導途徑，結果表明排名第一位的為癌癥通路（ko05200），共有476 個蛋白參與。HCC 復發組與未復發組富集結果顯示，富集因子排名前5 位分別是：DNA 復制（0.414）、錯配修復（0.409）、鞘脂信號通路（0.250）、堿基切除修復（0.172）、核苷酸切除修復（0.171）（圖1）。其中DNA 復制、錯配修復、堿基切除修復、核苷酸切除修復均屬于復制與修復層級，表明在肝癌復發的進程中，DNA修復具有重要作用。

在富集蛋白數量中，18個蛋白富集在DNA復制、17個蛋白富集在錯配修復、6 個蛋白富集在堿基切除修復、9個蛋白富集在核苷酸切除修復。結合差異蛋白數量和Q值繪制評分前10 位通路富集氣泡圖（圖2），DNA 修復相關的4 個通路在蛋白數量、相關性和富集因子三個參數中均位居前列。

圖2 京都基因和基因組百科全書的本體論（KO）富集氣泡圖Figure 2 Bubble maps of Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes ontology

2.2 肝癌復發進程中復制復合體調控通路的蛋白表達本研究在真核生物復制復合體通路中共檢出13 個蛋白（圖3）：小染色體維持復雜組件2～7（minichromosome maintenance complex component，MCM2～7）、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、復制因子C 亞基1（replication factor C subunit 1，RFC1）、復制因子C 亞基4（replication factor C subunit 4，RFC4）、復制因子C 亞基5（replication factor C subunit 5，RFC5）、皮瓣結構特異性內切酶1（flap structure-specific endonuclease1，FEN1）、DNA連接酶1（DNA ligase 1，LIG1）、復制蛋白A3（replication protein A3，RPA3）。其中10 個蛋白在肝癌復發組織中顯著減少，分別是MCM2（P=0.018）、MCM3（P=0.047）、MCM4（P=0.014）、MCM5（P=0.008）、MCM6（P=0.006）、MCM7（P=0.007）、PCNA（P=0.019）、RFC4（P=0.002）、RFC5（P＜0.001）、LIG1（P=0.042）。

圖3 復制復合體（真核生物）富集通路蛋白表達差異Figure 3 Differential protein expression of replication complex （eukaryotic） enriched pathways

2.3 肝癌復發進程中核苷酸切除修復通路的蛋白表達核苷酸切除修復通路中共檢出6個蛋白。其中PCNA（P=0.019）、RFC4（P=0.002）、RFC5（P＜0.001）、LIG1（P=0.042）共4 個蛋白表達水平顯著減少。DNA 聚合酶δ（DNA polymerase delta，POLD）和RFC1 在該研究中檢出，但差異無統計學意義（圖4）。

圖4 核苷酸切除修復富集通路蛋白表達差異Figure 4 Differential protein expression of nucleotide excision repair-enriched pathway proteins

2.4 肝癌復發進程中堿基切除修復通路的蛋白表達全蛋白質組學定量分析共檢出7個蛋白富集在堿基切除修復通路中，分別是PCNA、FEN1、LIG1、DNA 聚合酶β（DNA polymerase beta，POLB）、無嘌呤/無嘧啶內脫氧核糖核酸酶（apurinic/apyrimidinic endodeoxyribonuclease，APEX）、聚（ADP- 核糖）聚合酶［poly（ADP-ribose）polymerase，PARP］、POLD。其中PCNA（P=0.019）和LIG1（P=0.042）在HCC 復發組中顯著降低。FEN1、POLB、APEX、PARP和POLD在該研究中有檢出，但差異無統計學意義（圖5）。

圖5 堿基切除修復富集通路蛋白表達差異Figure 5 Differential protein expression of base excision repair-enriched pathways

2.5 肝癌復發進程中錯配修復富集通路的蛋白表達該研究中，在錯配修復富集通路中共檢出9 個蛋白：MSH2、MSH6、RFC1、RFC4、RFC5、PCNA、PRA、POLD、LIG1。其中6 個蛋白在肝癌復發組織中顯著減少，分別是MSH2（P=0.026）、MSH6（P=0.006）、RFC4（P=0.002）、RFC5（P＜0.001）、PCNA（P=0.019）、LIG1（P=0.042），其他蛋白（RFC1、RPA、POLD）的表達差異無統計學意義（圖6）。

圖6 錯配修復富集通路蛋白表達差異Figure 6 Differential protein expression of mismatch repairenriched pathways

2.6 差異蛋白在不同組織間的差異表達 將HCC 復發進程中發現的DNA 修復通路差異蛋白進行生物信息學組織表達分析。比較4 個維度中倍比差異（log2FC），包括：（1）HCC/全部癌旁組織（TCGA數據）；（2）HCC/癌旁組織（HCCDB數據）；（3）HCC/全部腫瘤（TCGA數據）；（4）正常肝組織/其他正常組織（GTEx 和TCGA 數據）。HCC/癌旁組織中差異最大的為MCM2（log2FC=1.16），其次為RFC4（log2FC=1.07）；正常肝組織MCM2、MCM3、MCM4、MCM6、MCM7和MSH2明顯低于其他正常組織（圖7）。

2.7 肝癌復發進程中DNA 修復通路差異蛋白富集分析在生物體內，不同蛋白相互協調行使其生物學行為，基于KEGG pathway 分析DNA 修復相關表達差異蛋白在肝癌復發進程中的生物學功能。在真核生物復制復合體通路中，MCM 復合體中7 個組分蛋白表達減少，致使解旋酶能力下降。PCNA、RCF4 和RCF5 的蛋白表達減少使DNA 聚合酶復合體ε 的固定能力減弱。同時LIG1 減少也使連接酶能力降低。這些都可能降低生物體遺傳復制能力，并增加突變風險。在肝癌復發進程中，復制蛋白A（RPA）復合體、RNA 酶（HⅠ和HⅡ）和解旋酶Dna2并未發現其蛋白表達變化（圖8a）。

圖8 HCC復發組與未復發組差異蛋白富集通路圖（差異分析基于KEGG pathway數據庫）Figure 8 Differential protein enrichment pathway map in the HCC recurrent and unrecurrent groups（Differential analysis was based on the KEGG pathway database）

核苷酸切除修復主要包括DNA 剪切合成和連接兩個部分。在肝癌復發進程中，主要通過減少PCNA、RCF4 和RCF5 蛋白表達降低DNA 聚合酶復合體ε 固定能力，并通過降低LIG1 影響連接酶功能。RPA、XPA、XPG 和轉錄因子TFⅡH 復合體的蛋白組分不受影響（圖8b）。

堿基剪切修復通路中影響腫瘤復發的作用可能是通過降低PCNA 和LIG1 蛋白表達影響長補丁堿基剪切修復復合體（long patch Base excision repair，long patch BER）功能（圖8c）。短補丁堿基剪切修復復合體（short patch Base excision repair，short patch BER）功能不受影響。

真核生物錯配修復通路中，肝癌復發組織中主要復合體中的DNA 錯配修復蛋白MSH2 和MSH6 蛋白減少，DNA 錯配修復系統中三大復合體功能減弱，影響錯配DNA 的正確剪切及連接，降低了錯配DNA 修復能力（圖8d）。

2.8 肝癌復發進程差異蛋白驗證分析 結合log2FC（T/C）值和P值對上述差異蛋白進行綜合分析后，篩選出對DNA 修復調節存在顯著差異（P＜0.01）的蛋白MCM5、MCM6、MCM7、RCF4、RCF5和MSH6進行臨床樣本重新采集驗證分析（每組10例）。結果表明復發組中除MCM6表現出下降趨勢外，MCM5、MCM7、RCF4、RCF5 和MSH6蛋白相對表達量均顯著降低（P值均＜0.001）（圖9）。

圖9 HCC復發組與未復發組差異蛋白驗證分析Figure 9 Differential protein validation analysis between HCC recurrence and unrecurrence groups

3 討論

HCC 復發與DNA 結構/表達差異關系密切［7-8］，然而是何種原因導致這一現象的發生卻鮮有報道。本研究基于TMT標記的定量蛋白質組學方法，就能夠導致上述現象的調控通路進行宏觀分析，以求精確定位到關鍵信號通路進行重點剖析。

細胞穩態的破壞及遺傳信息的不穩定性是腫瘤及腫瘤復發的重要誘因，由于其分子機制尚不明確，導致缺乏有效的治療靶點和手段［9-10］。DNA 損傷應答是保障基因組穩定性的關鍵，能確保將遺傳信息準確無誤地傳給子代細胞［11］。當損傷發生時，細胞啟動一系列損傷監控和修復機制，主要包括損傷信號激活和傳導［12］、損傷修復和基因轉錄等生物學過程［13］。本研究應用蛋白質組學標記定量分析技術對HCC 復發相關差異蛋白進行檢測和注釋聚類分析，發現聚類分值最高且具有重要作用的是DNA 修復相關途徑，包括DNA 復制、錯配修復、堿基切除修復、核苷酸切除修復通路。

該研究共發現DNA 修復相關差異蛋白12 個，在復發組中MCM2、MCM3、MCM4、MCM5、MCM6、MCM7、PCNA、RFC4、RFC5、LIG1、MSH2 和MSH6 的蛋白表達量顯著降低。對DNA 修復相關蛋白進行組織表達譜分析表明：正常肝細胞中上述蛋白的基因表達量均低于其他正常組織；肝癌細胞中的基因表達量均高于癌旁組織。Liu等［14］發現高表達MSH 基因是HCC復發的高危因素；Marshall 等［15］和Liao 等［16］也證明MCM 基因的高表達與腫瘤復發密切相關。然而在本研究中復發組的MSH2等DNA 修復相關蛋白表達顯著降低，通過HPA 數據庫分析表明MCM2 等DNA 修復相關基因在腫瘤細胞中具有較高的基因表達量，但蛋白的表達量并不高［17］。說明在DNA 修復相關基因的翻譯過程中還可能存在其他因素影響其蛋白翻譯。

分別對DNA復制、錯配修復、堿基切除修復、核苷酸切除修復4 條通路進行注釋和蛋白表達分析發現：（1）DNA 復制通路中主要是MCM 復合體和夾子裝置主要成分蛋白減少；（2）錯配修復通路中主要是夾子裝置主要成分蛋白減少；（3）堿基切除修復通路中主要是BER 主要成分蛋白減少；（4）核苷酸切除修復通路中主要是MutS 同聚物主要蛋白減少。表明DNA 修復進程中功能蛋白的顯著減少或缺失在HCC 復發進程中具有至關重要的作用。然而其與HCC 復發的因果關系及其具體機制有待進一步研究。

倫理學聲明：本研究方案經由西部戰區總醫院醫學倫理委員會批準，批號為2023xjsxxm-3。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：常凱、王艷艷、劉媛、陳敏負責課題設計，資料分析，撰寫論文；江忠勇、孫巍、劉晨霞、那琬琳、許宏宣、謝靜參與收集數據，修改論文；常凱、王艷艷、江忠勇、劉媛、陳敏負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。