基于網絡藥理學探討赤芍抗腫瘤轉移的作用機制

費慶林 羅 琴 張 陽 韓 立

南陽理工學院張仲景國醫國藥學院 河南省張仲景方藥與免疫調節重點實驗室,河南南陽 473004

近年來，全球腫瘤發病率不斷增長。研究表明，癌癥的發病率隨年齡的增長而增加[1]。癌癥患者病死大多由腫瘤細胞轉移所導致[2]，腫瘤細胞轉移是人類在攻克癌癥的過程中所要面臨的巨大挑戰，研究腫瘤細胞轉移的相關機制和靶點有助于找到更有效的治療方法。赤芍是一味清熱涼血藥，味苦性微寒，歸肝經，是我國常用的傳統中藥材[3]。歷代醫籍文獻中均記載赤芍，赤芍具有清熱涼血、活血化瘀之功效，其含有芍藥內酯苷、芍藥醇、有機酸等成分，有廣泛的藥理作用[4]。赤芍抑制腫瘤生長的調控機制引發了研究者的廣泛關注，研究證實赤芍具有非常好的抗腫瘤作用[5]。

網絡藥理學能夠通過網絡對目標進行整體性、系統性的分析，融合藥理學、生物信息學等多門學科的內容和方法，因其可以對多成分、多靶點進行系統性地分析[6]，已被廣泛應用于中藥的科學研究中。通過網絡藥理學的研究方法從系統生物學的角度來探討赤芍的活性成分及作用靶點、信號通路和疾病通路之間的關聯性，解釋赤芍抗腫瘤細胞轉移的作用機制，為進一步深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 赤芍活性成分及其靶點的獲取

在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）數據庫中篩選赤芍的活性成分。設定其口服生物利用度≥30%，藥物相似性≥0.18[7]，下載對應化合物的結構文件并用OpenBable軟件轉換成MOL2格式。將文件上傳至PharmMapper數據庫[8]，進行靶標垂釣。獲得藥物各活性成分對應的靶點后，設定規范擬合度＞0.9，剔除不符合條件的數據。將藥物靶點數據上傳至UniPort數據庫[9]進行基因名稱轉換。

1.2 腫瘤轉移的相關靶點

分別在在線人類孟德爾遺傳（online Mendelian inheritance in man，OMIM）和GeneCards數據庫中，以“tumor and metastasis”為關鍵詞進行檢索，獲取2個數據庫中腫瘤轉移疾病相關數據[10]，合并去重后得到腫瘤轉移疾病相關靶點。

1.3 赤芍抗腫瘤轉移潛在靶點的獲取

分別將藥物和疾病的靶點上傳至Venny 2.1.0網站中，繪制韋恩圖[11]，獲取赤芍抗腫瘤轉移的潛在靶點。

1.4 藥物活性成分-潛在靶點網絡的構建

將赤芍活性成分-潛在靶點進行整理，并導入CytoScape 3.9.0軟件中，進行可視化網絡的構建。進行節點連接度的計算[12]，選出排名前五位的活性成分作為赤芍抗腫瘤轉移的核心成分。

1.5 靶點蛋白質互作（protein-protein interaction，PPI）網絡的構建

將潛在靶點上傳至STRING數據庫，進行PPI分析[13]，將最低交互分數更改為最高置信度（0.900），置信度越高則所得的交互結果越可信。隱藏網絡中未參與鏈接的節點，下載蛋白互作網絡的TSV格式并導入至CytoScape 3.9.0軟件[14]，進行最大集團中心度（maximal clique centrality，MCC）分析。MCC是關鍵節點的拓撲特征值之一，在PPI網絡預測必需蛋白質的精度上具有更好的性能，MCC值越大，表明該點在拓撲結構中越重要[11]。選取MCC值排名前五位的靶點作為核心靶點進行后續的在線分子對接。

1.6 基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

將1.3中的潛在靶點上傳至DIVID數據庫[15]，分別進行GO生物過程（biological process，BP）、細胞組成（cell component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和KEGG富集分析[16]。將富集分析的結果，按照P值由小到大進行排列，選取各分析中排名前十位的數據進行整理，并上傳至微生信網站[17]中，繪制氣泡圖。

1.7 分子對接

分別將選取的核心靶點與核心成分上傳至SWISS DOCK在線分子對接網站（http://www.swissdock.ch/），進行分子對接。下載對接結果的壓縮文件并解壓，用USCF Chimera軟件將對接結果進行可視化處理。

2 結果

2.1 赤芍活性成分及其靶點的獲取

共獲得赤芍有效成分119個，符合篩選條件的活性成分為29個。將PharmMapper數據庫中獲得的靶點數據進行篩選后，共得到1122個相關靶點，將得到的靶點上傳至UniPort數據庫中進行校準去重后，共得到132個相關靶點。

2.2 腫瘤轉移的相關靶點

在GeneCards和OMIM數據庫中分別獲得10 276和200個疾病靶點，合并去重后共得到10 299個與腫瘤轉移疾病相關的靶點。

2.3 赤芍抗腫瘤轉移潛在靶點的獲取

通過Venny 2.1.0網站分析，得到赤芍與腫瘤轉移相關的靶點115個，即赤芍抗腫瘤轉移疾病的潛在靶點。見圖1。

圖1 藥物化學成分與疾病靶點交集圖

2.4 藥物活性成分-潛在靶點網絡的構建

藥物活性成分-潛在靶點網絡圖中共有144個節點，其中有效成分和潛在靶點相互作用關系有971條邊，篩選出的藥物核心成分為異芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、4-乙基芍藥苷、4-鄰甲基芍藥苷。見圖2。

2.5 PPI網絡的構建

PPI網絡總共包括78個點、158條邊，大于平均自由度的有22個。MCC值排名前五位的靶點分別為SRC、HSP90AA1、MAPK1、ESR1、AKT1，認為這些靶點可能是赤芍抗腫瘤轉移的核心靶點。圓形直徑越大則說明該靶點評分越高。見圖3。

圖3 赤芍與腫瘤轉移交集靶點的PPI網絡圖

2.6 GO和KEGG分析

共得到GO富集結果499條，其中BP 339條、CC 51條、MF 109條，得到KEGG富集結果120條。根據P值從小到大排列進行氣泡圖的繪制。在氣泡圖中氣泡越大則說明該條目涉及的基因數目越多。由研究結果分析可知KEGG主要涉及癌癥信號通路、脂質和動脈粥樣硬化、前列腺癌等信號通路。見圖4～5。

圖4 GO富集分析

圖5 KEGG分析

2.7 分子對接

所選的核心成分為異芍藥苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、4-乙基芍藥苷、4-鄰甲基芍藥苷，核心靶點為SRC、HSP90AA1、MAPK1、ESR1、EGFR。受體與配體結合形成穩定構象時的能量越低，則說明兩者結合的可能性越大，從對接的結果上來看它們的分子結合能均＜-7 kcal/mol，這表明藥物核心成分與疾病核心靶點具有很好的結合活性。見表1、圖6。

表1 核心成分與核心靶點結合能

圖6 核心成分與核心靶點的分子對接圖

3 討論

近年來多項研究表明赤芍具有抗腫瘤的作用[5，18-20]。馬云飛等[5]分析發現芍藥苷可通過抑制人乳腺MDAMB-231和MCF-7細胞中的Notch-1信號通路，進而抑制細胞的侵襲性。吳楊崢[18]研究發現4-乙基芍藥苷能夠明顯地抑制人的口腔表皮樣癌κB細胞的增殖，且隨4-乙基芍藥苷濃度的增加，抑制作用增強。陳志偉等[19]以S180肉瘤小鼠為研究對象，發現赤芍總苷對腫瘤細胞有抑制增殖、誘導分化、促進凋亡的作用。赤芍總苷可以使線粒體膜電位降低，增加細胞液中細胞色素C和第二線粒體激活因子的含量，抑制腫瘤細胞增殖、分化和誘導細胞凋亡[20]。

選取的核心靶點是腫瘤轉移疾病中的重要靶點。當SRC蛋白表達升高時，會使E-鈣粘蛋白的表達降低，進而導致細胞間的黏附能力減弱，使細胞的遷移與侵襲能力發生改變[21]。MAPK1過表達可激活MAPK1/ERK2信號通路，促進腫瘤細胞的侵襲與遷移[22]。HSP90AA1在腫瘤中的表達水平上升，在臨床上和胃癌患者具有一定的相關性；HSP90AA1能促進胃惡性腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲以及上皮間質轉化[23]。ESR1屬于核激素受體家族的成員，能夠參與靶細胞的增殖、分化與穩態。孫嘉慧等[24]通過對人乳腺癌細胞MCF-7進行基因敲除后進行細胞侵襲等實驗，證實了ESR1低表達能夠明顯提高乳腺癌細胞侵襲能力。在腫瘤患者中，EGFR呈陽性高表達時，可激活磷脂酰肌醇3-激酶蛋白激酶B和細胞外信號調節激酶信號通路，進而促進腫瘤細胞的增殖和分化，使腫瘤侵襲和轉移的風險提高，進而影響臨床治療效果[25]。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學和分子對接的方法，初步闡述了赤芍抗腫瘤轉移的作用機制，通過對具有多成分、多靶點特點的赤芍與腫瘤轉移復雜網絡關系的研究，闡述了赤芍抗腫瘤轉移的有效成分、關鍵靶點以及所涉及的生物過程和通路，使“藥物-靶點”網絡可視化，為進一步研究赤芍抗腫瘤轉移提供了部分參考和理論依據。