建立HPLC-RID測定枸杞子中枸杞多糖含量研究

岳玲燕 蒲小彥 何桂英 付明華 鄧竹君 涂雨佳

太極集團四川綿陽制藥有限公司，四川綿陽 621000

枸杞子來源于茄科植物寧夏枸杞（Lycium barbarum L.）干燥成熟果實，具滋補肝腎，益精明目功效[1-2]。始載于《神龍本草經》，是藥食同源類中藥材[3-4]。寧夏、甘肅、河北均有栽培[5-7]，主含枸杞多糖，另有甜菜堿、玉蜀黍黃素、酸漿紅素、胡蘿卜素、核黃素、維生素C等成分[8-9]。現(xiàn)收載于《中華人民共和國藥典》2020年版，測定枸杞多糖用苯酚-硫酸法，檢測儀器為紫外-可見分光光度計，此法用乙醚、乙醇、水依次回流提取，步驟繁瑣，持續(xù)4 h，且對照品溶液標準曲線易出現(xiàn)較大誤差。故探索一種簡便易行、重復性好、準確可靠的方法，測定枸杞子多糖的含量。

1 儀器與試藥試劑

1.1 儀器

Agilent1260Ⅱ型色譜工作站和G7162A 1260RID示差折光檢測器（美國安捷倫科技有限公司），MSA6.6S-CE型微量電子天平和BSA224S型電子天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司，精度分別為0.001、0.1 mg），CRT-1500B型高速粉碎機（永康市超然電器有限公司）。

1.2 試藥試劑

D-無水葡萄糖對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110833-202109，純度99.9%）；乙腈色譜純（科威化學有限責任公司）；苯酚、硫酸、乙醚（成都科隆化學品有限公司）；藥材枸杞子主要從寧夏、甘肅產地收集而得，編號1～6（表1），由主任中藥師魏云（綿陽市食品藥品檢驗所）鑒定，符合《中華人民共和國藥典》規(guī)定。

表1 枸杞子藥材信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱填料Prevail Carbohyrate ES（250 mm×4.6 mm，5 μm），編 號LC026；流 動 相 乙 腈-水（70∶30）；柱溫40℃；示差折光檢測器溫度40℃；進樣量10 μl，流速1 ml/min。理論板數(shù)以無水葡萄糖峰計應不低于3000。

2.2 供試品溶液提取方式及確定

2.2.1 提取方式 取3號枸杞子樣品粉碎成粗粉，采取三種提取方式進行樣品處理。

方式一：《中華人民共和國藥典》枸杞子含量測定苯酚-硫酸法。

方式二：加水超聲提取法。取枸杞子粗粉約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加水50 ml，超聲處理（功率250 W、頻率50 kHz）30 min，濾過，取續(xù)濾液即得。

方式三：加水回流提取法。取枸杞子粗粉約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加水50 ml，稱定重量，回流2 h，放冷再稱定重量，用水補足減失重量，搖勻濾過，取續(xù)濾液即得。

2.2.2 提取方式的確定 取上述三種溶液按2.1項下測定，記錄色譜圖并比較，結果表明方式一只出現(xiàn)溶劑峰未檢出目標峰；方式二主要成分未充分溶出，使測得值偏小；方式三供試品溶液測得色譜峰最符合系統(tǒng)適用性試驗，所得枸杞多糖含量高，效果最佳。故擇優(yōu)選取加水回流提取的方法。見圖1～3。

圖1 方式一色譜圖

圖2 方式二色譜圖

圖3 方式三色譜圖

2.3 溶液制備

對照品溶液：精密稱取D-無水葡萄糖對照品30.06 mg，置10 ml量瓶中，加水溶解定容至10 ml，搖勻，制成每毫升含3.006 mg的對照品溶液。

供試品溶液：精密稱取枸杞子粗粉1.0004 g，置具塞錐形瓶，精密加水50 ml，稱定重量，回流2 h，取出放冷，稱定重量，用水補足減失重量，搖勻濾過，即得。

陰性樣品溶液：按供試品溶液制備項下方法，制成陰性樣品溶液。

2.4 方法學考察

系統(tǒng)適用性試驗：取2.3項下3種溶液按2.1色譜條件測定，記錄色譜圖，結果顯示對照品溶液與供試品溶液色譜主成分峰保留時間基本一致，分離度＞1.5，表明陰性樣品溶液對待測成分無干擾。見圖4～6。

圖4 對照品溶液色譜圖

圖5 供試品溶液色譜圖

圖6 陰性樣品溶液色譜圖

線性關系考察：精密稱取D-無水葡萄糖對照品200.28 mg，置20 ml量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，即得10.0040 mg/ml對照品貯備液。精密吸取該溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 ml分別置10 ml量瓶中，加水稀釋并定容至刻度，搖勻，制得濃度為0.5002、1.0004、1.5006、2.0008、2.5010、3.0012、4.0016 mg/ml對照品溶液，按2.1色譜條件分別進樣，記錄色譜圖。以對照品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，得線性方程Y=80671X+1326.5，線性范圍0.5～4.0 mg/ml，相關系數(shù)R2=0.9999，結果表明對照品溶液在濃度范圍內與其色譜峰面積線性關系良好。見圖7。

圖7 色譜峰面積與對照品溶液濃度的線性標準曲線

精密度試驗：精密吸取2.3項下對照品溶液按2.1項下條件依次測定6次，記錄色譜圖和峰面積，計算結果RSD為0.20%，表明儀器的精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.3項下供試品溶液，室溫放置0、3、6、9、12、15、18 h，按2.1色譜條件測定，記錄峰面積，結果RSD為0.50%（n=7），表明供試品溶液室溫放置18 h內穩(wěn)定性較好。

重復性試驗：取編號2號枸杞子樣品，按2.3項下方法平行制備供試品溶液6份，再按2.1色譜條件分別測定，記錄峰面積并計算含量，平均含量278.5 mg/g，RSD為1.60%，表明該方法重復性較好。

加樣回收率試驗：精密稱取已知含量的1號枸杞子9份，含枸杞多糖327.488 mg，精密加入適量D-無水葡萄糖對照品，按2.3項下制得供試品溶液，再按2.1色譜條件進樣測定，計算加樣回收率，得出D-無水葡萄糖的平均回收率為104.81%，RSD為1.10%。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果

2.5 樣品含量測定

取10批待測枸杞子樣品，按2.3項下方法制備供試品溶液，按2.1色譜條件進樣測定，記錄峰面積計算含量，結果見表3。通過下表數(shù)據驗證，此方法能有效測定枸杞多糖的含量，控制枸杞子質量，指導該品入庫檢驗。

表3 不同批次枸杞子中枸杞多糖的含量（mg/g）

3 討論

3.1 枸杞多糖的提取溶劑

枸杞多糖是從枸杞子中提取而得，為白色略帶棕色纖維狀疏松固體，主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖等6種單糖組成[10-11]，含多種微量元素和氨基酸蛋白多糖，不溶于乙醇、丙酮等有機溶劑[12]，是一種水溶性多糖[13]，故以水為提取溶劑，使有效成分更易溶出。

3.2 枸杞多糖的提取時間

試驗對回流提取時間進行摸索，設置1、1.5、2、2.5 h，通過比較發(fā)現(xiàn)，隨提取時間增長，所測得多糖含量也增加，得出2、2.5 h加水回流提取所測得枸杞多糖含量最高且數(shù)據接近，所以確定最佳提取時間為2 h。

3.3 儀器設備的色譜條件

通過查閱參考蜂蜜、乳糖、麥芽糖漿[14-15]、蔗糖等品種的含量測定項，對色譜柱、流動相、柱溫、示差檢測器溫度等條件進行以下試驗。

試驗中選取氨基鍵合硅膠柱（250 mm×4.6 mm）和Prevail Carbohyrate ES色譜柱進行對比分析，后者分析出的色譜圖理論塔板數(shù)、分離度、拖尾因子等均優(yōu)于前者，故選用Prevail Carbohyrate ES色譜柱。

試驗中對流動相乙腈-水（75∶25）和乙腈-水（70∶30）兩種進行對比考察，前者出峰時間較快，且色譜峰不能完全分離，于是對此流動相進行優(yōu)化，結果表明后者流動相檢測出的目標色譜峰與雜質峰的分離度＞1.5，故選擇乙腈-水（70∶30）為含量測定用流動相。

試驗中對柱溫和示差檢測器溫度條件進行了考察，分別設置柱溫40℃、35℃、30℃，示差檢測器溫度40℃、35℃、30℃，結果表明當柱溫為40℃、示差檢測器溫度40℃時色譜峰的分離度最大。

綜上所述，通過HPLC-RlD的方法成功摸索出枸杞子中枸杞多糖的提取方式和含量測定方法，具有操作簡單快捷、靈敏度高、重復性好、準確可靠、所用試劑種類少、分離效果好等特點，可用于檢測藥材枸杞子中枸杞多糖的含量，并有效控制枸杞子質量。因該方法采取用水直接回流提取，未進行脫色處理，所以影響色譜柱的性能，降低其使用壽命。