不同規格細管對冷凍豬精復蘇質量的比較研究

周 健 ，劉聞一 ，付小青 ，朱 琳 ，趙云翔 ，2

（1.河南秀博科技有限公司，河南 許昌 461000；2.廣西大學動物科學技術學院，廣西 南寧 530000）

1 前言

當前，人工授精技術在養豬行業中得到普遍使用，優秀個體間的基因交流通過豬精來實現，豬精作為基因的載體，在種豬育種和商品化生產中占據重要的地位。豬精保存方式共分為三種，常溫液態保存、低溫液態保存和超低溫固態保存。常溫液態保存的豬精行業使用率已達到90%以上，而超低溫固態保存的豬精使用率只有1%左右，這主要與豬精對溫度的敏感性以及凍精操作方法的復雜性等因素有關。豬精超低溫固態保存通常使用細管進行，以0.25 mL和0.5 mL細管居多，小容量細管凍精在批量配種時會暴露出諸多的問題，需要多次解凍數支凍精細管來進行輸精，延長輸精時間的同時增加了勞動強度，使用大容量細管冷凍豬精是推廣凍精配種技術的重要措施之一。本研究比較了0.5 mL和5 mL細管凍精解凍后的冷凍效果，在此基礎上對解凍后精子處在38℃環境下的耐受性做進一步比較，為大容量細管凍精研究提供試驗依據。

2 材料與方法

2.1 試驗動物及精液收集

選取身體健壯的杜洛克公豬作為試驗動物，在揚翔股份旗下公豬站收集精液樣本，均使用自動采精系統采集公豬精液，精液量達到100 mL以上時作為試驗樣本并且檢測合格后運輸到揚翔育種中心北方凍精實驗室進行冷凍試驗。

2.2 主要試驗儀器及試劑

TurboFreezerM程序冷凍儀（米尼圖），HH-6數顯恒溫水浴鍋（常州澳華），EasyCoder2.0色帶打印機（米尼圖），KDC-2046低速冷凍離心機（安徽中科），冷凍精子平衡柜（米尼圖），精子檢測分析儀（IVOS-II,IMV），單頭灌裝機MPPUno（米尼圖），SQS2精液分析儀，SQS TEST染色試劑，Leja 8 腔玻片，0.5 mL凍精細管（米尼圖），5 mL凍精細管（米尼圖）。甘油（Sigma），乳化劑Equex-Paste（米尼圖），Androstar?CryoPlus，新鮮卵黃。

2.3 試驗方法

2.3.1 精液冷凍處理

將每頭公豬精液平均分成2份，經過1倍稀釋后17℃梯度降溫2 h，在此溫度下進行900 g離心20 min，離心后棄掉精漿保留精子沉淀，添加冷卻液充分混勻懸浮后置于5℃平衡柜中降溫150 min，之后添加冷凍液調整精液終密度為8×109/mL，灌裝成0.5 mL/支和5 mL/支細管進行程序化冷凍，凍存3 d后按照50℃水浴16 s進行解凍。

2.3.2 解凍后精子運動性檢測

凍精解凍后使用解凍液進行適當稀釋，取稀釋后的精液2 μL加入到Leja檢測玻片中，利用計算機輔助精液分析系統（computer assisted spermatozoa analysis system—CASA）（IVOS II，IMV精子分析儀）進行精子運動性能評估，主要檢測參數包括精子活力（MOT，%）、前向運動精子（PM，%）、VCL（曲線速度，μm/s）、VSL（直線速度，μm/s）、VAP（平均路徑速度，μm/s）。

2.3.3 解凍后頂體完整性檢測

本試驗采用SQS2精子分析儀（Seminal Quality System）評估解凍后精子頂體完整性（acrosomal membrane integrity, AMI），具體方法如下：1）染色。解凍后使用解凍液10倍稀釋，用移液器將20 μL稀釋好的精子樣品放入染料試管并重復抽打，避免氣泡產生，待細胞懸液變為橙紅色之后，處理完成。2）涂片并檢測。用移液槍吸取5 μL精子細胞懸液添加到檢測玻片腔室內，并放置到SQS2精子分析儀中檢測。

2.3.4 解凍后38℃恒溫孵育實驗

為了驗證解凍后精子體外存活時間以及凍后精子對體外環境的耐受性，特進行體外38℃恒溫孵育實驗。具體操作如下：解凍后14倍稀釋于解凍液中，樣品儲存在離心管內密封并38℃±0.5℃恒溫水浴孵育，檢測孵育后2 h內的精子運動參數（MOT、PM、VAP、VSL、VCL），檢測間隔為0.5 h。

2.4 數據統計與分析

數據先使用Excel處理，再使用SAS 9.2軟件進行單因素方差檢驗，結果以平均值±標準差表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

3 試驗結果與分析

3.1 解凍后精子運動性及膜完整性檢測

解凍后0.5 mL組冷凍效果優于5 mL組的冷凍效果，詳見表1。解凍后精子活力（MOT，%）、前向運動精子（PM，%）、平均路徑速度（VAP，μm/s）、直線速度（VSL，μm/s）0.5 mL組極顯著高于5 mL組（P＜0.01）； 0.5 mL組曲線速度（VCL，μm/s）、頂體完整性（AMI，%）顯著高于5 mL組（P＜0.05）。

表1 解凍后精子運動參數及頂體完整性對比

3.2 38℃恒溫孵育精子活力及運動指標檢測

0.5 mL和5 mL凍精38℃恒溫孵育后活力和運動指標呈現出相似的變化趨勢，但0.5 mL組凍精在4個檢測節點上的各項指標均優于5 mL組，詳見表2。橫向對比發現，兩組在孵育1.5 h后MOT、PM、VAP、VSL、VCL均呈顯著性下降趨勢（P＜0.05），而孵育2 h后各項指標與1.5 h間差異不顯著（P＞0.05）?？v向對比發現，在各個檢測節點上，0.5 mL組MOT、PM、VAP、VSL、VCL均顯著高于5 mL組（P＜0.05）。

表2 0.5 mL組和5 mL組凍精38℃恒溫孵育實驗

4 討論

目前，學者們普便認為使用大容量規格的細管冷凍精液比小容量細管冷凍效果差。除冷凍保護液不同因素外，其最主要的原因是細管容量影響精液的溫變速率，從而導致在冷凍和復蘇過程中損傷較多的精子。

4.1 不同組凍精解凍后精子運動參數比較

本試驗使用0.5 mL和5 mL細管冷凍豬精，解凍后復蘇效果表現出很大不同，精子活力、前向運動精子、運動速度以及頂體完整性兩組之間均有顯著差異（P＜0.05）。眾所周知，精液冷凍保存通常要經歷精子降溫、液氮冷凍，解凍復蘇三個過程，溫度從生理溫度（35℃）降到液氮（-196℃）溫度需要經歷巨大的溫差，在這過程中降溫速率對精子冷凍效果至關重要。溫度降至10℃以內時，豬精細胞極易出現冷休克，這是由豬精子特定的質膜結構決定的，豬精子膜上膽固醇與磷脂比值較低增加了其對溫度的敏感性。另一方面，精液冷凍過程中需要一定的冷凍速率，保證精子內水分子通過滲透作用離開精子，防止精子內殘留的水分子形成冰晶，從而減少對精子的機械損傷，0.5 mL和5 mL容量的凍精其冷凍速率有所不同，這也是造成不同冷凍效果的原因之一。有的學者認為精子冷凍過程中冰晶還會使溶液滲透壓改變，造成精子滲透性損傷，滲透壓不均和冰晶化狀態還會使細胞質斷裂，對細胞骨架和基因組相關結構產生不利的影響。

此外，解凍過程對精子復蘇也十分重要，對精子在冰晶化階段的危險溫度要做好預防措施，盡可能讓精子順利通過危險溫度區間，以保證精子不受損傷，不同類型的凍精解凍溫度也有所差異，升溫速率過快或過慢都將造成精子死亡。如顆粒型凍精多以干解凍法為主，溫度一般在50～55℃解凍效果最佳，白雪等使用38℃水浴解凍0.25 mL凍精細管得到較高的精子活力，如戴建軍等研究5 mL細管凍精52℃水浴解凍25 s得到了最佳的精子活力。本研究使用相同的解凍程序，0.5 mL和5 mL細管解凍時的升溫速率也不盡相同，這可能也是冷凍效果差異顯著的原因之一。不同類型的凍精細管相同溫度下升溫速率差異較大，對精子復蘇過程中受到的損傷仍不可避免，適合不同類型細管的解凍程序仍需進一步來研究。眾所周知，精子的運動性和頂體完整性常常用來預測家畜的生育能力，本試驗中解凍后頂體完整性0.5 mL組顯著高于5 mL組（P＜0.05），說明0.5 mL組凍精具有更高的受精能力。這與Kang等人的研究很相似，小容量細管的凍精具有更加突出的冷凍效果。在精子凍融過程中，冰晶、高滲透壓以及ROS等均可使頂體的完整性缺失，還有可能使精子提前獲能，有研究表明酪氨酸磷酸化水平顯著升高是精子提前獲能的主要表現，但與正常的酪氨酸磷酸化有所不同。本試驗未進行凍精解凍后酪氨酸磷酸化水平檢測，有待驗證0.5 mL和5 mL細管凍精的獲能狀態。

4.2 解凍后38℃恒溫孵育精子耐性對比

凍精解凍后其運動性會隨著時間的延長而降低，在38℃環境下孵育不同規格的凍精，用來預測解凍后的精子在母畜體內的存活時間，由本試驗可知，0.5 mL組和5 mL組孵育1.5 h時精子活力（MOT，%）、前向運動精子（PM，%）、平均路徑速度（VAP，μm/s）、直線速度（VSL，μm/s）、曲線速度（VCL，μm/s）均顯著性下降（P＜0.05），這說明冷凍損傷導致精子對外界的耐受性下降。有研究認為冷凍解凍過程所引起的精子膜脂質相變和聚集，質膜中脂質-脂質和脂質-蛋白間相互作用會發生改變，導致精子膜的流動性發生改變引起損傷。Anzar等人的研究結果也表明凍精解凍2 h后0.25 mL細管中精子的PM、VSL和VAP高于0.5 mL細管中的精子，說明較小規格的細管可以獲得更高質量的凍精。在38℃環境下更容易受到脂質氧化損傷，處于此溫度下的精子新陳代謝旺盛，活性氧的過度產生和抗氧化清除系統的失調，導致精子細胞的多層次結構組織（基因組、表觀基因組、蛋白質組、脂質組）可能受到ROS的威脅，同時有毒代謝產物聚集也可加速精子死亡。

5 結論

使用本試驗中特定的冷凍-解凍程序，0.5 mL細管凍精解凍后精子活力、前向運動精子、精子運動速度以及頂體完整性顯著高于5 mL細管凍精；解凍后精子處于38℃環境1.5 h后其活力、前向運動精子和運動速度均出現顯著性下降。綜合而言，本試驗條件下公豬0.5 mL細管凍精冷凍效果優于5 mL細管凍精。