煙草抗感南方根結線蟲品種根部差異表達mRNA的PPI網絡分析

陳小翔，張文軍，翟爭光，徐志強，劉化冰，鐘永健，江智敏*

(1.浙江中煙工業有限責任公司 技術開發分公司，浙江 杭州 310008；2.湖南省煙草公司 長沙市公司，湖南 長沙 410000)

煙草根結線蟲病是世界各國煙草生產中的主要病害之一，尤其以南方根結線蟲危害為重，給我國的煙草產業造成了巨大損失[1-3]，僅云南省發病面積就達到266.67 hm2，病毒造成煙葉減產達到30%～50%[4]。南方根結線蟲病不僅能直接對煙草造成危害，使煙株萎蔫黃化，整株死亡，還會導致煙草青枯病、黑脛病、根黑腐病、鐮孢根腐病等病害的發生，從而降低了煙草品種的抗病性[5]。

受環境和經濟因素的影響，我國大部分煙區無法采用水旱輪作的方式，選擇化學防治的方式，雖然見效快，但也導致了農藥的殘留，進而導致煙葉品質的下降。化學防治還會引起環境污染，不符合當代“綠色農業”的理念。不同煙草品種之間存在明顯的抗性差異，選育抗病品種是防治根結線蟲病最有效的方法[6]。

目前，關于南方根結線蟲病發病機制的相關研究有很多，一些植物中的抗性基因已經被鑒定和定位，例如：番茄中的Mi基因[7]和辣椒中的Me基因[8]。但是有關煙草相關的抗性基因并未有相關的報道，不同抗性煙草品種之間差異很大，探索抗南方根結線蟲的分子機制有利于加強抗性基因的育種工作。關于不同煙草品種抗根結線蟲感染機制的生物信息學研究甚少。轉錄組測序已經用于研究模型和非模型物種等相關方面，例如：數據表達的準確性、動態范圍的檢測能力、新基因的探索能力等，具有比微陣列分析更顯著的優勢[9]。因此，本研究以抗病品種K326與感病品種長脖黃為材料[10-11]，在前期轉錄組測序數據基礎上，進行相關生物信息學研究，通過對兩種不同煙草品種進行差異表達基因分析，以深入闡述抗根結線蟲煙草品種抗感染的分子調控機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本文所選用煙草(Nicotianatabacum)品種為K326(抗南方根結線蟲)和長脖黃(感南方根結線蟲)。

1.2 試驗方法

利用賽默飛RNA提取試劑盒提取煙苗葉片總RNA，樣品檢驗合格后，進行mRNA的富集及cDNA文庫的構建，利用Illumina測序技術進行轉錄組測序。

1.3 數據處理

1.3.1 轉錄組數據分析

利用Cytoscape version.3.5.0軟件對煙草生物學過程GO分類和KEGG 通路富集進行分析。

1.3.2 PPI網絡分析

利用最新的多功能在線軟件NetworkAnalyst對南方根結線蟲侵染后煙草品種根部的DEGs進行分析，構建可視化的PPI網絡，并通過該軟件來實現路徑和模塊之間的探索分析以及蛋白質—蛋白質相互作用。

1.3.3 PPI網絡與GO分類綜合分析

將PPI網絡中分析出的重要基因與GO分類分析出的重要基因進行綜合分析，找出引起抗南方根結線蟲煙草與感南方根結線蟲煙草品種差異表達的重要基因與通路。

2 結果與分析

2.1 差異表達基因的GO功能分類分析結果

通過對GO功能分類分析，共篩選出474個顯著富集的通路，表1是GO功能(BP)分類中的差異基因顯著富集前9的通路，分別是regulation of cellular metabolic process(細胞代謝)，endosomal transport(胞內體轉運)，jasmonic acid mediated signaling pathway(茉莉酸介導的信號通路)，heterocycle metabolic process(雜環代謝)，gene silencing by RNA (RNA介導的基因沉默)，innate immune response(固有免疫應答)，sugar mediated signaling pathway (糖介導的信號通路)，hormone mediated signaling pathway(激素介導的信號通路)，response to salt stress(鹽脅迫應答)等，其中重要基因有：Dcl1，Ago1，Cpl，Tor，Fab1b，Trn1，Ago4，Fab1c，Fab1d，Arf9，Smg7，Rs41，Ermo2，Spk1，Cul2，Pab2，Sizi，Xrn4，Ein3，Dcl2，Dcl4，Glu1，Trx2。

表1 GO功能(BP)分類中差異基因顯著富集通路Top9Table 1 Significant enrichment pathway of differential genes in GO function (BP) classification Top9

2.2 差異表達基因的PPI網絡分析結果

圖1是包含差異表達基因以及相互作用關系的PPI網絡中最主要的子網絡(subnetwork)，并將subnetwork1的蛋白互作網絡圖導出為功能模塊圖(圖2)，由圖1、圖2看出Fab1家族的Fab1b、Fab1c、Fab1d蛋白基因，Dcl家族的Dcl1、Dcl2、Dcl4蛋白基因，Glu1等基因是重要功能蛋白基因。

紅色節點代表上調蛋白，綠色節點代表下調蛋白；顏色間差異代表基因表達水平差異程度，其中顏色越深代表基因表達水平差異越大；面積的大小代表互作程度的高低，其中面積越大表示互作程度越高。圖1 PPI網絡中的subnetwork1Fig.1 Subnetwork1 in PPI network

2.3 PPI網絡中的關鍵基因

表2是Subnetwork中蛋白互作程度最高的5個Hub node，均來自于Subnerwork1且互作程度大于等于15的節點(Degree≥15)，這表明Acc1、Glt1、Shd、Glu1、Nrpe1這5個基因編碼蛋白與其他蛋白存在著較強相互作用，可能是與抗感染有關的關鍵蛋白。

表2 Subnetwork中蛋白互作程度最高的5個Hub nodeTable 2 The 5 Hub nodes with the highest degree of protein interaction in the subnetwork

2.4 篩選煙草抗南方根結線蟲生物過程的重要通路及相關的關鍵基因

結合PPI網絡分析，篩選出Fab1b、Fab1c、Fab1d、Glu1、Dcl1、Dcl2、Dcl4共7個基因與其他基因存在較高程度相互作用，并且也顯著富集在相關通路中，顯示為關鍵基因。其中基因Dcl1參與到100多個通路中，基因Dcl2、Dcl4參與到50個以上通路中，基因Fab1c、Glu1、Fab1b、Fab1d參與到10個以上通路中。在PPI網絡分析中，這些基因互作程度均大于5，且均在Subnetwork1中，所以這些基因極有可能是與煙草抗南方根結線蟲相關的關鍵基因。

3 結論與討論

3.1 討論

南方根結線蟲感染煙草是一個復雜的生物學過程，煙草根部被南方根結線蟲感染后，基因表達量及相應通路會發生變化，因此，研究引起抗病煙草與感病煙草功能差異的通路至關重要。細胞代謝是生物體一切生命活動的基礎[12]，當植物受到環境脅迫時，特別是在植物的抗病防御反應中，會發生次級代謝，產生次級代謝產物。這些產物在植物的機體防御、信號傳導和生長發育起著重要作用[13]。在本研究中，發現抗感染煙草品種根部上調基因顯著富集在細胞代謝過程調節(regulation of cellular metabolic process)通路中，其中參與光反應和氮同化[14]的基因Glu1(glutamate synthase 1)顯著上調，同時參與PPI網絡(subnetwork1，圖1)。基因Glu1被認為參與光反應為次生代謝提供能量促進次級代謝合成異戊二烯類化合物(如萜類)、酚類化合物和含氮化合物(如生物堿)[15]，在植物防御系統中發揮重要作用[16]。在抗南方根結線蟲煙草品種中，基因Glu1上調表達，細胞代謝功能加強，從而推測此煙草品種可以通過增強次級代謝作用產生次級代謝產物，從而間接加強煙草根部防御功能，達到抗南方根結線蟲的目的。

核內體在細胞內物質運輸過程中發揮重要作用[17-18]，而細胞的物質運輸對維持細胞正常代謝及其他生理功能具有重要意義[19]。研究過程中，發現抗感染煙草品種根部上調基因顯著富集在核內體轉運(endosomal transport)通路。對于抗感染的煙草品種，核內體功能加強，則說明其物質運輸功能增強，從而推測該煙草品種可通過增強物質運輸能力達到抵抗南方根結線蟲的目的。同時有研究報道，endosomal ptdlns(3) p 5-linaseFab1基因對核內體的功能具有重要的調控作用[20]。在本研究中，Fab1b、Fab1c和Fab1d這3個Fab1基因家族成員均在抗感染煙草品種根部顯著上調，并參與PPI網絡(subnetwork1，圖1)。因此，預測這些基因通過參與核內體轉運而增強煙草的抗感染能力。

在本研究中發現，抗感染煙草品種根部上調基因顯著富集在RNA介導的基因沉默(gene silencing by RNA)通路。RNA介導的基因沉默是生物體用來抵御外界核酸侵入的防御系統，可認為是一種有效的免疫系統[21]。據研究報道，南方根結線蟲誘導煙草基因沉默是一種轉錄后基因沉默，又稱為RNA干涉(RNA interference，RNAi)現象[22-23]。基因沉默時需要由小干擾RNA (small interferencing RNA，siRNA)來進行介導[24]，與一些復合物結合，降解mRNA[25]，或者結合在mRNA上作為引物[26]，從而阻斷外源基因進行表達。此外，Dcl是參與RNA介導的基因沉默和siRNA形成的關鍵基因[27-32]，本研究數據顯示，Dcl基因家族成員Dcl1、Dcl2、Dcl4均在抗感染煙草品種根部顯著上調，并參與PPI網絡(subnetwork1，圖1)。因此，可以推測出抗南方根結線蟲煙草品種通過增強RNA介導的基因沉默途徑來達到抗南方根結線蟲的效果。其中Dcl2基因編碼一種類似于dicer的蛋白質，能在被病毒感染的植物中發揮抗病毒的沉默反應，部分拮抗Dcl2產生的miRNAs，當Dcl4缺失或者受抑制時，可以作為Dcl4的替代物產生siRNA[33]。所以Dcl1、Dcl2、Dcl4在煙草抗南方根結線蟲反應中是一個共同作用體系。

3.2 結論

綜上所述，本研究通過生物信息學技術對前期獲得的轉錄組數據進行分析，解析抗南方根結線蟲煙草的抗感染機制。對抗南方根結線蟲煙草根部的差異表達基因進行PPI網絡分析，構建蛋白互作網絡，揭示這些基因的相互作用及其主要涉及的抗感染相關通路。初步鑒定了Fab1b、Fab1c、Fab1d、Glu1、Dcl1、Dcl2、Dcl4共7個基因均為煙草抗感染相關的關鍵基因，本研究為進一步在細胞和分子水平研究煙草根部南方根結線蟲病的病理發生、發展的分子機制提供理論指導。