不同程度頸動脈狹窄患者動脈粥樣硬化斑塊中牙周致病菌的分布研究

唐 路,薛 棟,楊文文,張獻麗,陸 夏,趙 穎

腦卒中是多種腦血管疾病的嚴重表現形式,具有極高的致殘率和較高的死亡率,是當今世界危害人類生命健康最主要的疾病之一[1]。頸動脈狹窄與腦血管事件的出現存在明顯相關性,更是缺血性腦卒中發生的重要原因,約占所有缺血性腦卒中的30%[2]。頸動脈粥樣硬化是引起頸動脈狹窄的主要病因,近年來,越來越多的研究表明牙周炎是頸動脈粥樣硬化的重要危險因素[3-6]。前期研究顯示,頸動脈粥樣硬化斑塊內可檢測出牙周致病菌基因,并且與齦下菌斑中牙周致病菌具有相關性[7-9]。本課題組進一步研究證實,牙周致病菌可以通過誘導血管平滑肌細胞鈣化從而促進頸動脈粥樣硬化的進展[10]。因此,牙周致病菌可能在頸動脈粥樣硬化的發生發展中起重要作用。

然而對于牙周致病菌在不同程度頸動脈狹窄患者中的分布以及作用機制未見報道。本研究擬通過對不同程度頸動脈狹窄患者斑塊和齦下菌斑中牙周致病菌進行檢測,探討牙周致病菌與頸動脈狹窄程度的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2016年1月至2017年12月在首都醫科大學宣武醫院神經外科進行頸動脈內膜剝脫術的動脈粥樣硬化并同時伴有牙周炎患者50例,所有患者知情同意。本研究通過首都醫科大學宣武醫院倫理委員會批準(項目編號:臨研審[2018]090號)。

納入標準:①頸動脈粥樣硬化需行頸動脈內膜剝脫術;②確診為牙周炎。排除標準:①吸煙;②口呼吸;③妊娠期或哺乳期;④惡性腫瘤;⑤全身系統性疾病;⑥6個月內服用過抗生素;⑦6個月內接受過牙周治療的患者。

根據北美有癥狀頸動脈內膜剝脫術試驗(NASCET)及歐洲頸動脈手術試驗(ECST)對頸動脈狹窄程度的分級標準,按照術前的影像檢查,將50例患者分為重度狹窄組(狹窄率70%～99%)和完全閉塞組(狹窄率100%)。

1.2 樣本收集

收集術中分離的頸動脈粥樣硬化斑塊標本,立刻置于含0.9%氯化鈉溶液的無菌Eppendorf管中,-20 ℃保存備用。因病房環境和患者身體情況條件所限,術后1周內在患者口腔選擇1顆探診深度大于3 mm的牙齒進行菌斑采集。患者漱口后清除口內的食物殘渣。用探針清除要采集牙的齦上軟垢和菌斑,在采集前用無菌棉球隔離唾液,然后在頰側和近中部位用無菌齦下刮治器刮取齦下菌斑并置于含0.9%氯化鈉溶液的無菌Eppendorf管中,-20 ℃保存備用。

1.3 DNA提取

取100 mg頸動脈粥樣硬化斑塊樣本,用消毒剪刀剪碎勻漿,4 ℃、13 000 r/min離心15 min,去上清液,用500 μL TE緩沖液(含10 mmol/L HCl、1 mmol/L EDTA,pH=7.6)重懸。根據廠家說明書,用DNA提取和純化試劑盒(Promega Corporation,美國)提取頸動脈粥樣硬化斑塊和齦下菌斑中的細菌DNA。

1.4 牙周致病菌16SrRNA PCR 鑒定

本研究所使用的細菌引物以伴放線聚集桿菌(Actinobacillusactinomycetemcomitans,A.actinomycetemcomitans)、福賽坦納菌(Tanerellaforsythia,T.forsythia)、齒垢密螺旋體(Treponemadenticola,T.denticola)、具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum,F.nucleatum)和牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)16S rRNA為模板(表1)。采用Takara TaqTM系統(寶生物工程有限公司,中國)進行擴增,25 μL反應體系包含2.5 μL 10×PCR緩沖液,2.5 μL 25 mmol/L MgCl2,2.0 μL dNTP混合物,0.3 μL 5 U/μL Taq聚合酶,上、下游引物各1.0 μmol/L,模板DNA液4 μL,滅菌水補足。PCR擴增反應液在ENH熱循環儀(Eppendorf-Netheler-Hinz Gmbh 22331,德國)中反應,反應條件為:95 ℃預變性5 min,95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,最后一步延伸7 min,共30個循環。

表1 牙周致病菌引物

1.5 瓊脂糖凝膠電泳

PCR反應產物在20%的瓊脂糖凝膠、TAE緩沖液中電泳40 min,5.0 mg/L溴乙錠溶液中染色30 min,302 nm紫外光下觀察并記錄。100 bp DNA ladder(Omega Bio-tec,美國)作為判斷反應產物長度的標準參照物。

1.6 統計學分析

用GraphPad Prism 5.0進行數據處理,采用卡方檢驗比較性別和牙周致病菌的檢出率,采用獨立樣本t檢驗比較年齡差異,檢驗水準α=0.05,P<0.05表示有顯著性差異。

2 結 果

2.1 一般資料比較

入組的50例頸動脈內膜剝脫術患者中,重度狹窄組共36例,其中男32例,女4例,年齡(62.1±7.6)歲;完全閉塞組共14例,其中男12例,女2例,平均年齡(61.1±6.7)歲。兩組間性別、年齡差異無統計學意義(P>0.05)。

2.2 頸動脈粥樣硬化斑塊中牙周致病菌的檢測結果

牙周致病菌16S rRNA PCR產物電泳圖如圖1所示。重度狹窄組患者中,可檢出P.gingivalis、A.actinomycetemcomitans、F.nucleatum、T.denticola、T.forsythia5種牙周致病菌;在完全閉塞組患者中,僅可檢出P.gingivalis、F.nucleatum、T.denticola、T.forsythia4種牙周致病菌,A.actinomycetemcomitans未檢出(表2)。P.gingivalis、F.nucleatum、T.denticola、T.forsythia在頸動脈完全閉塞組中的檢出率均高于重度狹窄組,其中兩組間P.gingivalis、T.denticola的檢出率差異具有統計學意義(P<0.05)。此外,P.gingivalis、T.denticola、T.forsythia在頸動脈粥樣硬化斑塊中的檢出率顯著高于A.actinomycetemcomitans和F.nucleatum(P<0.05)。

M:Marker 1000;lane 1:P.gingivalis(陽性,197 bp);lane 2:A.actinomycetemcomitans(陽性,593 bp);lane 3:F.nucleatum(陽性,183 bp);lane 4:T.denticola(陽性,860 bp);lane 5:T.forsythia(陽性,641 bp)。

表2 牙周致病菌在不同程度頸動脈狹窄患者動脈粥樣硬化斑塊中的檢出率

2.3 齦下菌斑中牙周致病菌的檢測結果

兩組患者的齦下菌斑中均可檢出P.gingivalis、A.actinomycetemcomitans、F.nucleatum、T.denticola、T.forsythia5種牙周致病菌(表3)。與重度狹窄組相比,P.gingivalis、T.denticola、T.forsythia在完全閉塞組患者齦下菌斑中的檢出率較高,A.actinomycetemcomitans、F.nucleatum檢出率較低,但均不具有統計學差異(P>0.05)。此外,在齦下菌斑中P.gingivalis、T.denticola、T.forsythia的檢出率顯著高于A.actinomycetemcomitans和F.nucleatum(P<0.05)。

表3 牙周致病菌在不同程度頸動脈狹窄患者齦下菌斑中的檢出率

3 討 論

缺血性腦卒中主要是由于腦供血動脈狹窄導致血栓形成和栓子脫落,引起腦動脈栓塞和缺血性腦卒中[11]。顱外段頸動脈狹窄是缺血性腦卒中的主要病因之一,約90%的頸動脈狹窄是由動脈粥樣硬化所致[12]。根據NASCET試驗將頸動脈狹窄分為5級:無狹窄(0%)、輕度狹窄(0%～49%)、中度狹窄(50%～69%)、重度狹窄(70%～99%)、完全閉塞(100%)[13]。影像學檢查證實頸動脈狹窄率達到70%需要進行頸動脈內膜剝脫術,為研究動脈粥樣硬化斑塊中牙周致病菌分布,本實驗選擇重度狹窄和完全閉塞患者作為研究對象。

牙周炎被認為是心腦血管疾病的獨立危險因素,牙周致病菌參與動脈粥樣硬化的發生和發展[14]。本研究檢測的P.gingivalis、T.denticola和T.forsythia屬紅色復合體,與牙周炎緊密相關[15]。紅色復合體細菌可直接破壞機體組織,并誘發機體固有免疫和適應性免疫反應,產生免疫損傷,從而促進機體的炎癥反應[16]。Chukkapalli等[17]在動物實驗中發現,T.forsythia通過增加小鼠血清淀粉酶A和血清脂蛋白的表達,改變膽固醇代謝水平,增加動脈粥樣硬化斑塊的面積,促進高脂血癥小鼠動脈粥樣硬化的發展。此外,在ApoE缺陷小鼠模型中,紅色復合體P.gingivalis、T.forsythia和T.denticola聯合感染小鼠,細菌侵入血管壁,可誘導血管炎癥反應,促進主動脈斑塊面積的增加,從而影響動脈粥樣硬化的發生發展[18]。本研究結果顯示,頸動脈完全閉塞患者動脈粥樣硬化斑塊中紅色復合體細菌檢出率較重度狹窄患者高,特別是P.gingivalis、T.denticola,可能與紅色復合體細菌通過促進動脈粥樣硬化斑塊面積增加進而影響血管狹窄的嚴重程度有關。本課題組前期研究表明,P.gingivalis還會促進血管平滑肌細胞及主動脈鈣化[10],通過外膜囊泡誘導血管平滑肌細胞鈣化[19],并可在高糖、高脂、高磷酸鹽環境下促進[20-22]。血管鈣化是動脈粥樣硬化的形成原因,也是動脈粥樣硬化的必然結果,本研究中頸動脈完全閉塞患者動脈粥樣硬化斑塊中P.gingivalis檢出率較高可能也與此相關。

本研究在比較頸動脈重度狹窄和完全閉塞患者齦下菌斑發現,紅色復合體細菌的檢出趨勢與動脈粥樣硬化斑塊一致。以往研究也證實齦下菌斑和動脈粥樣硬化斑塊內的牙周致病菌組間分布趨勢一致[23-25]。這可能與牙周致病菌通過日常活動(刷牙、咀嚼和使用牙線)由破損的牙周上皮進入血液循環,并駐留在遠處動脈粥樣硬化血管壁中有關。牙周致病菌可侵入血管內皮細胞內生長繁殖,產生各種細胞因子、黏附分子,引起全身炎癥狀態、脂質異常和凝血狀態異常,最終形成或加重動脈粥樣硬化[26-29]。

同時本研究發現,在頸動脈粥樣硬化斑塊和齦下菌斑中紅色復合體P.gingivalis、T.forsythia和T.denticola的檢出率高于A.actinomycetemcomitans和F.nucleatum。Devarieux等[30]研究中,A.actinomycetemcomitans和F.nucleatum在頸動脈粥樣硬化斑塊中的檢出率低于P.gingivalis和T.denticola;Haraszthy等[31]在頸動脈粥樣硬化斑塊中發現T.forsythia和P.gingivalis的檢出率高于A.actinomycetemcomitans。以上研究與本研究結果一致,這可能與A.actinomycetemcomitans和F.nucleatum侵入血管和定植斑塊的能力較紅色復合體細菌弱有關,但具體機制需進一步研究。

紅色復合體細菌可促進血管鈣化,加速動脈粥樣硬化斑塊形成,但之間是否有協同作用,通過何種機制加重血管的狹窄程度目前尚不清楚,未來還需進一步研究,為頸動脈粥樣硬化的防治提供理論基礎。