白酒中健康因子2,3,5,6-四甲基吡嗪形成機理的研究進展

胡智慧，陳 方，郭雪峰，趙騰飛，羅貞標，吳德光*

（1.茅臺學(xué)院 釀酒工程系，貴州 遵義 564500；2.貴州習(xí)酒投資控股集團有限責(zé)任公司，貴州 遵義 564622；3.貴州茅臺酒股份有限公司，貴州 遵義 564500）

白酒作為我國的傳統(tǒng)飲品，是老百姓餐飲文化的重要組成部分，具有悠久的歷史。隨著人民生活水平的提高，人們越來越重視“健康飲酒”[1-2]，在追求健康飲用習(xí)慣、滿足精神愉悅的同時，對這一特殊飲品提出了更高的要求：低酒精度、低醉酒度、不上頭、醒的快、人體代謝壓力小、高健康功能因子和低有害成分[3]。

2,3,5,6-四甲基吡嗪（2,3,5,6-tetramethylpyrazine，TTMP）又名川芎嗪，屬于生物體單堿，白色針狀晶體，具有活血化瘀[4]、疏風(fēng)止痛[5]、理氣、治療心腦血管疾病等多種藥理作用[6-11]，同時還是國際公認的、安全的一種食品風(fēng)味添加劑[12]，具有令人愉悅的、特殊的烤肉和炒堅果香氣。TTMP在白酒中呈現(xiàn)甜香、堅果香及花香等香氣，對其他香味物質(zhì)有顯著的的疊加效應(yīng)，進而起到了豐滿白酒香氣的作用。吳建峰[13]在2006年率先提出不同香型白酒中TTMP普遍存在，其是白酒中主要功能性成分之一，引起了行業(yè)的廣泛關(guān)注。本文主要回顧了近幾年TTMP形成機理，總結(jié)了微生物合成TTMP主要分為微生物合成中間代謝產(chǎn)物，后經(jīng)化學(xué)反應(yīng)合成TTMP兩個階段，其中限制TTMP合成量主要以化學(xué)合成為主，針對其存在合成效率低等問題，闡述了微生物高產(chǎn)菌株篩選、改造代謝通路、優(yōu)化發(fā)酵條件等解決措施，并提出以高效的“酶法合成”替換低效的“化學(xué)合成”的想法，異源構(gòu)建微生物從頭合成TTMP的策略，為進一步完善TTMP形成機理提供支持，進而對白酒提質(zhì)增效及引領(lǐng)“健康白酒”的理念具有重要的意義。

1 TTMP形成機理

1.1 美拉德反應(yīng)

美拉德反應(yīng)（Maillard reaction，MR）機制從1953年開始逐漸被科研工作者解析，由于其反應(yīng)的復(fù)雜性，目前常采用碳模塊標記（carbon module labeling，COMLA）技術(shù)識別其中間產(chǎn)物的種類和結(jié)構(gòu)[14]。該技術(shù)使用13C/15N同位素標記氨基源或13C標記還原糖作為反應(yīng)底物成功解析吡嗪類化合物生成過程[15-16]。此外，多響應(yīng)動力學(xué)模型已經(jīng)成功地解析了吡嗪類化合物形成過程中美拉德中間反應(yīng)產(chǎn)物動力學(xué)參數(shù)及反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)[17]。吡嗪類化合物廣泛存在于烘焙食品中[18-21]，其可由氨基酸和糖分別提供氮源和碳源，在高溫烘焙過程中經(jīng)過美拉德反應(yīng)生成[22-24]；而在發(fā)酵食品中，吡嗪類化合物多種合成機制己經(jīng)被提出，其中多數(shù)學(xué)者認為是美拉德反應(yīng)和Strecker降解的結(jié)果，首先氨基源和還原糖之間發(fā)生縮合反應(yīng)，其縮合反應(yīng)通常是由氮的親核攻擊引起的，將一個未共享的電子對給羰基的親電碳原子。由于氨基的親核性質(zhì)，這種親核攻擊高度依賴于pH，當(dāng)反應(yīng)條件為堿性時更利于MR的初始階段，而酸性時氨基酸的質(zhì)子化致使MR減慢。醛糖中N-糖基胺發(fā)生Amadori重排生成1-脫氧-2-酮糖，即Amadori產(chǎn)物；如果以酮糖代替醛糖參與反應(yīng)，則合成2-氨基-2-脫氧-1-醛糖，即Hyens產(chǎn)物。這兩種重新排列的產(chǎn)物都是無色的，非揮發(fā)的，尤其是熱不穩(wěn)定的，因此其會進一步迅速發(fā)生脫氨脫水反應(yīng)產(chǎn)生大量的降解產(chǎn)物。在酸性條件下，Amadori和Hyens產(chǎn)物均優(yōu)選進行1,2-烯醇化生成3-脫氧己酮；在堿性條件下，2,3-烯醇化傾向于生成1-脫氧己酮，這些脫氧己酮進一步裂解成α-二羰基化合物。α-氨基酮通常由Streker降解形成的，主要發(fā)生氨基酸的氧化脫胺和脫羧反應(yīng)，釋放二氧化碳和醛類物質(zhì)，隨后這些化合物重新排列形成α-氨基酮[25]。簡而言之，即α-氨基酸與還原糖形成Amadori重排產(chǎn)物，隨后發(fā)生重排形成α-二羰基化合物等還原酮，經(jīng)Strecker降解為α-氨基化合物，最后縮合成形成吡嗪類化合物（圖1）[26]；除此之外，GUERRA P V等[27]提出吡嗪類化合物其他合成路徑，即甘氨酸-乙醛酸美拉德模型體系，該體系生成的中間產(chǎn)物不參與α-二羰基化合物的形成（圖2a），而是生成哌嗪-2,5-二羧酸，然后進行氧化脫羧形成二氫吡嗪，最終通過氧化生成吡嗪類化合物；YU H等[28]提出吡嗪化合物也可以通過高壓加成反應(yīng)生成（圖2b），在堿性條件下該反應(yīng)由吡嗪甲基電離引起。該反應(yīng)是吡嗪側(cè)鏈生成的重要途徑，可以生產(chǎn)出更多類型的、氣味閾值更低的吡嗪類化合物。

圖1 美拉德反應(yīng)生成吡嗪類化合物的經(jīng)典途徑Fig.1 Classical pathway for the generation of pyrazine compounds by Maillard reaction

圖2 吡嗪類化合物其他生成途徑Fig.2 Alternative pathways for the generation of pyrazine compounds

美拉德反應(yīng)是羰基化合物與氨基化合物在常溫或加熱時發(fā)生的聚合、縮合等復(fù)雜化學(xué)反應(yīng)，其反應(yīng)過程形成了多種醛類、酮類等中間產(chǎn)物，理論上有可能產(chǎn)生一些可作為TTMP前體的羰基化合物，但KOEHLER P E等[29-30]從還原糖與銨或氨基酸之間反應(yīng)的美拉德反應(yīng)模型中發(fā)現(xiàn)有甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪等多種烷基吡嗪的合成，但卻沒有檢測到TTMP的生成，這可能與TTMP相對其他烷基吡嗪有獨特的對稱結(jié)構(gòu)有關(guān)。人們普遍認為美拉德反應(yīng)是非酶促的化學(xué)反應(yīng)，其反應(yīng)條件一般是溫度高于100 ℃、pH≥7，含水量不超過25%，這一反應(yīng)條件在中國白酒釀造過程中很難實現(xiàn)，但張溫清[12]研究芝麻香型白酒中TTMP變化時，提出中國白酒中TTMP形成主要存在于溫度較高的制曲、高溫堆積、蒸餾等階段。雖然酸堿性對美拉德反應(yīng)的整體路徑有一定影響，但乙偶姻與銨的反應(yīng)動力學(xué)證實了在酸性條件下TTMP也能夠生成[31-32]。目前研究表明，關(guān)于吡嗪類化合物的產(chǎn)生途徑已經(jīng)非常清楚，微生物的作用占70%以上，而美拉德反應(yīng)的作用不到30%[26]。吳建峰[33]研究發(fā)現(xiàn)，白酒中TTMP主要來源于制曲和堆積發(fā)酵過程中的美拉德反應(yīng)，后經(jīng)蒸餾帶入酒中，因此美拉德反應(yīng)和微生物代謝是白酒中TTMP的重要來源。

1.2 微生物代謝作用

1962年，KOSUGE T等[34]在日本的發(fā)酵豆制品“納豆”中分離得到一株產(chǎn)TTMP的菌株（枯草芽孢桿菌（Bacillus natto））。隨著TTMP在越來越多的發(fā)酵食品中被發(fā)現(xiàn)，研究人員提出TTMP合成路徑是基于微生物代謝的乙偶姻合成途徑。1967年，DEMAIN A L等[35]提出枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）培養(yǎng)體系中TTMP生物合成途徑——由糖的代謝產(chǎn)物3-羥基丁酮和氨基酸的氨基反應(yīng)生成，這是最早的關(guān)于微生物合成TTMP機制的報道，同時該研究也表明了3-羥基丁酮和氨基酸在TTMP合成中的重要性。TTMP微生物的合成途徑（圖3）：以枯草芽孢桿菌為例，首先體內(nèi)合成TTMP的前體物——乙偶姻[36-40]（圖3a），具體路徑為葡萄糖經(jīng)EMP途徑生成丙酮酸，隨后在α-乙酰乳酸合酶及α-乙酰乳酸脫羧酶分別催化作用下合成乙偶姻；乙偶姻經(jīng)體外化學(xué)反應(yīng)合成TTMP，具體路徑為乙偶姻與氨/銨鹽通過非酶促反應(yīng)生成3-氨基-2-丁酮，隨后兩分子的3-氨基-2-丁酮脫水縮合生成2,5-二氫四甲基吡嗪，最后非酶氧化生成TTMP[41-42]（圖3b）。

圖3 2,3,5,6-四甲基吡嗪前體物乙偶姻合成途徑（a）及其形成機理（b）Fig.3 Synthesis pathway of 2,3,5,6-tetramethylpyrazine precursor acetoin (a) and its formation mechanism (b)

由圖3a可知，微生物合成TTMP主要分為微生物合成中間代謝產(chǎn)物——乙偶姻，后經(jīng)化學(xué)反應(yīng)合成TTMP兩個階段，基于此，微生物體內(nèi)是否有TTMP從頭合成途徑及相關(guān)的功能酶，目前這方面的研究還是非常有限的。黃曉潤[43]通過對高溫（45 ℃）和中溫（37 ℃）不同發(fā)酵溫度下菌株轉(zhuǎn)錄組進行差異性比對，篩選得到15個差異顯著的候選基因，最后通過生物信息學(xué)分析得到3個可能與醬香相關(guān)的基因（cdoA（半胱氨酸雙加氧酶）、panE（酮泛解酸還原酶）、lspA（脂蛋白信號肽酶Ⅱ）），并采取敲除策略驗證其醬香功能，結(jié)果研究發(fā)現(xiàn)分別敲除cdoA、panE、lspA基因后，發(fā)酵的豆豉醬香味減弱，尤其是BJ3-2△lspA醬香味顯著減弱，TTMP含量較對照分別降低了0.768%、0.025%和4.063%，表明cdoA、panE和lspA基因分別通過調(diào)控半胱氨酸和蛋氨酸代謝中半胱氨酸-亞磺酸鹽、泛酸生物的生成、蛋白質(zhì)、糖類和脂肪等物質(zhì)的運輸進而影響丙酮酸的代謝對醬香風(fēng)味起到正調(diào)控。貢獻[44]對枯草芽孢桿菌產(chǎn)醬香風(fēng)味代謝通路研究時發(fā)現(xiàn)，pckA基因通過調(diào)控三羧酸循環(huán)中磷酸烯醇式丙酮酸的生成對醬香風(fēng)味起負調(diào)控，pckA基因敲除菌株發(fā)酵的豆豉中乙偶姻的含量從8.618%降至7.721%，TTMP含量從12.444%增至15.394%；而msmE基因通過調(diào)控細胞內(nèi)外低聚糖的轉(zhuǎn)運影響糖酵解中丙酮酸的代謝對醬香風(fēng)味起正調(diào)，msmE基因敲除菌株發(fā)酵的豆豉中乙偶姻含量從8.618%增至28.122%，TTMP含量從12.444%降至9.124%。黃璐等[45]研究發(fā)現(xiàn)，磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶基因（pckA）對TTMP合成有顯著的調(diào)控作用，其被敲除基因（BJ3-2ΔpckA）后導(dǎo)致發(fā)酵的豆豉中TTMP含量比BJ3-2中增加23.71%，醬香更濃郁，氨味明顯降低，風(fēng)味品質(zhì)顯著提升。LIU Z L等[46]在研究大豆發(fā)酵食品中風(fēng)味化合物發(fā)現(xiàn)精氨酸酶基因（rocF）對TTMP合成具有調(diào)控作用，敲除rocF基因抑制了精氨酸酶活性，造成精氨酸無法通過尿素循環(huán)分解為尿素和鳥氨酸，導(dǎo)致尿素含量降低，進而增加了NH4+和TTMP的含量。馮國楊[47]對枯草芽孢桿菌產(chǎn)TTMP生成機制進行研究，通過菌株發(fā)酵過程中相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，篩選到15個與TTMP合成相關(guān)基因，其中包括編碼蛋白質(zhì)與多肽降解的基因（8個）、與氨基酸降解生產(chǎn)NH3相關(guān)酶的基因（4個）、轉(zhuǎn)氨酶的基因（3個）等，這些基因在TTMP快速合成階段都具有較高的表達水平且呈協(xié)同作用趨勢。總之，目前關(guān)于微生物TTMP合成路徑關(guān)鍵基因挖掘的研究較少，多數(shù)以枯草芽孢桿菌的報道為主，而枯草芽孢桿菌中相關(guān)功能基因的研究對微生物從頭合成TTMP具有有一定的借鑒意義和參考價值。

2 微生物合成TTMP增加產(chǎn)量的措施

2.1 優(yōu)良菌種篩選

菌株生長和發(fā)酵性能對于提高TTMP產(chǎn)量至關(guān)重要。張溫清[12]以蛋白酶和乙偶姻作為雙篩選標記結(jié)合高溫處理技術(shù)，在芝麻香型白酒高溫大曲中篩選得到一株高產(chǎn)TTMP解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）XJB-104，通過單因素和響應(yīng)面等優(yōu)化發(fā)酵條件，XJB-104功能麩曲TTMP產(chǎn)量為1.28×103mg/kg，是優(yōu)化前的6.3倍。郭春生等[48]采用傳統(tǒng)培養(yǎng)分離結(jié)合高效液相色譜法從高溫大曲中分離篩選到高產(chǎn)TTMP解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens），并通過單因素試驗和響應(yīng)面法對發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，最終TTMP產(chǎn)量可達（166.19±2.79）mg/L，較優(yōu)化前（112.26 mg/L）提高48%。王慶等[49]采用細胞形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗及分子生物學(xué)技術(shù)從高溫大曲中分離篩選到高產(chǎn)TTMP貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis），菌株發(fā)酵條件優(yōu)化后TTMP產(chǎn)量為728.38 mg/L，比優(yōu)化前提高了167%。萬雨薇等[50]以醬醪中篩選的貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）CS1.11作為出發(fā)菌株，為獲得高產(chǎn)TTMP發(fā)酵菌株，采用紫外誘變的方法，以酪素平板水解圈直徑及乙偶姻顯色反應(yīng)作為突變菌株初篩指標，突變株CS1.11-33經(jīng)響應(yīng)面試驗優(yōu)化發(fā)酵后TTMP最大積累量達到1 895.08 mg/kg，是其優(yōu)化前的2.6倍。

2.2 增加TTMP前體物合成量

由圖3可知，乙偶姻和銨合成TTMP的過程為非酶促的化學(xué)反應(yīng)，而TTMP合成代謝途徑關(guān)鍵基因的調(diào)控主要集中在乙偶姻的合成代謝上。目前針對增加乙偶姻合成量主要是圍繞其合成路徑的改造和優(yōu)化展開的，上游路徑主要是通過引入外源基因改造和強化原有的丙酮酸代謝路徑，從而提高丙酮酸的供應(yīng)量；中游路徑主要是通過過量表達或者組合表達乙偶姻合成途徑中的關(guān)鍵酶、定向改造關(guān)鍵酶等措施強化乙偶姻的代謝通量；下游路徑主要是敲除乙偶姻競爭路徑，減少底物的流失。

XU Y Q等[40]針對白酒釀造微氧環(huán)境探究了其對芽孢桿菌產(chǎn)TTMP的影響，通過強化乙偶姻合成代謝路徑（過表達葡萄糖攝入蛋白（GlcU）、α-乙酰乳酸合成酶（AlsS）、α-乙酰乳酸脫羧酶（AlsD）、丙酮酸激酶（PYK）、6-磷酸果糖激酶（PFKA））、弱化競爭路徑（敲除乙偶姻還原酶（BdhA）、乙偶姻脫氫酶體系（acoABC）），結(jié)合補充銨鹽和紅豆粉等發(fā)酵條件優(yōu)化，重組芽孢桿菌產(chǎn)TTMP為2.37 g/L。MENG W等[51]通過過量表達α-乙酰乳酸脫羧酶強化乙偶姻合成代謝流量，結(jié)合補加碳源乙醛強化乙酰-輔酶A（coenzyme A，CoA）合成代謝，進而提高丙酮酸流向乙偶姻代謝流，最終重組枯草芽孢菌株產(chǎn)TTMP為43.75 g/L，比初始菌株提高了15.47%。CUI D Y等[52]采取組合過量表達α-乙酰乳酸合成酶基因（ILV2）、敲除2,3-丁二醇脫氫酶基因（BDH1）、構(gòu)建二倍體釀酒酵母等措施，最終重組酵母菌株產(chǎn)TTMP為10.55 mg/L，比初始菌株提高了2.6倍。為了讓α-乙酰乳酸合成酶更好地適應(yīng)白酒釀造過程中的酸性環(huán)境。ZHAO T等[53]采取定點突變的策略，篩選出耐酸性更強的α-乙酰乳酸合成酶突變體（ALSN210D-H399D），其半衰期在pH 4.0條件下延長了2.2 h（野生型ALS為0.8 h），使其更適合白酒釀造的環(huán)境。陳詩佳[54]采取敲除BDH1基因和過表達BDH2基因，結(jié)合酵母單倍體融合的策略，構(gòu)建了高產(chǎn)乙偶姻和TTMP的雙倍體釀酒酵母工程菌，并將其應(yīng)用到麩曲白酒固態(tài)發(fā)酵實驗中，結(jié)果顯示酒醅中乙偶姻含量提高了320.38%，TTMP提高了74.66%。總之，這些合成策略將為增加乙偶姻、TTMP的合成量提供參考。

2.3 優(yōu)化發(fā)酵條件

調(diào)控菌株發(fā)酵過程中的各項參數(shù)，如溫度、pH和溶氧量等，在一定程度上對于提高TTMP產(chǎn)量同樣重要，發(fā)酵條件優(yōu)化主要集中在碳源分批補料、最佳銨鹽種類篩選、外源添加物調(diào)控、發(fā)酵參數(shù)控制等。乙偶姻是TTMP的前體物，其在發(fā)酵前期過量積累有利于TTMP的生成。HAO F等[55]首先采取分批補加碳源葡萄糖，過量積累TTMP前體物—乙偶姻，隨后補加3%磷酸氫二銨的策略，最終TTMP的產(chǎn)量為3.01 g/kg，比優(yōu)化之前提高了6.8倍；為了探究銨鹽種類和濃度對TTMP合成的影響，ZHU B F等[22]從磷酸氫二銨、檸檬酸銨、硫酸銨、碳酸氫銨、硝酸銨、乙酸銨和草酸銨七不同銨鹽種類中篩選最佳銨鹽及濃度，結(jié)果表明磷酸氫二銨為最佳銨鹽，采用分批補加銨鹽的方式，隨著其質(zhì)量濃度增加（＜40 g/L）TTMP的產(chǎn)量也隨之增加，TTMP的最高質(zhì)量濃度達到7.46 g/L，比未分批添加銨鹽提高了55.1%；外源添加物可以直接或間接影響TTMP中間代謝產(chǎn)物的生成或相關(guān)酶的酶活。MENG W等[51]研究發(fā)現(xiàn)，外源添加乙醛有助于提高地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）合成TTMP的能力，與未添加乙醛相比，TTMP產(chǎn)量從43.75 g/L提高到47.26 g/L。此外，劉蕾[56]研究發(fā)現(xiàn)，外源添加維生素B2可以提高多粘芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）CJX518煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）脫氫酶活性進而影響胞內(nèi)NADH和NAD+水平，同時也可以提高多粘芽孢桿菌CJX518胞內(nèi)的2,3-丁二醇脫氫酶和乙偶姻還原酶活性，從而提高乙偶姻的生成量，為此采用與產(chǎn)維生素B2的基因工程大腸桿菌LS02T共培養(yǎng)，TTMP的最大產(chǎn)量達到227 mg/L，與純培養(yǎng)相比產(chǎn)量提高了。吳建峰[33]提出較高的反應(yīng)溫度有利于乙偶姻和銨離子合成TTMP。XIAO Z J等[39]提出兩步控溫法的生產(chǎn)策略：第一階段，枯草芽孢桿菌（B.subtilis）CICC 10211在37 ℃發(fā)酵使中間代謝產(chǎn)物乙偶姻過量積累；第二階段，反應(yīng)體系溫度升高至95 ℃添加磷酸氫二銨，加快TTMP合成速度，最終實現(xiàn)高產(chǎn)TTMP的預(yù)期目標，其產(chǎn)量達到8.34 g/L。除溫度外，ZHU B F等[57]研究發(fā)現(xiàn)，弱酸性條件（pH 5.5）有利于細胞生長和前體物乙偶姻的過量積累，而pH 7.0有利于TTMP的合成，最終通過調(diào)控發(fā)酵體系中的pH使TTMP的產(chǎn)量達到7.43 g/L，較恒定pH發(fā)酵提高了22.20%。

2.4 異源構(gòu)建微生物從頭合成TTMP路徑

根據(jù)吡嗪類化合物的合成機制可知，微生物主要為其合成前體物，前體物經(jīng)一系列的自發(fā)化學(xué)反應(yīng)合成吡嗪類化合物，這就限制了吡嗪類化合物高效合成，如何實現(xiàn)將低效的化學(xué)合成轉(zhuǎn)換成更高效的酶法合成將是今后發(fā)展的方向。隨著基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)的發(fā)展以及生物信息學(xué)的廣泛應(yīng)用，使得在微生物體內(nèi)挖掘出具有與TTMP化學(xué)合成路徑中催化相同官能團的同工酶或者相似的酶法合成路徑成為可能。合成生物學(xué)技術(shù)的興起，誕生了以微生物生物合成法生產(chǎn)具有應(yīng)用價值化合物的新方法，該方法具有能耗低、綠色環(huán)保、可持續(xù)等優(yōu)勢。

2020年，曹艷麗等[58-60]解析了枯草芽孢桿菌（B.subtilis）中2,5-二甲基吡嗪（2,5-dimethylpyrazine，DMP）的生物合成路徑（圖4），其以L-蘇氨酸作為底物，在蘇氨酸脫氫酶（threonine dehydrogenase，TDH）催化下合成α-氨基乙酰乙酸，經(jīng)非酶促脫羧生成氨基丙酮，隨后兩分子的氨基丙酮脫水縮合生成3,6-二氫-2,5-二甲基吡嗪，最后非酶氧化為2,5-二甲基吡嗪（2,5-DMP）；也揭示了2,3,5-三甲基吡嗪（2,3,5-trimethylpyrazine，TMP）的生物合成路徑（圖4），其以L-蘇氨酸和D-葡萄糖為底物，產(chǎn)物1分子氨基丙酮與1分子3-氨基-2-丁酮脫水縮合生成2,5-二氫-2,3,6-三甲基吡嗪，隨后非酶氧化為2,3,5-TMP；還揭示了2-乙基-3,5-二甲基吡嗪和3-乙基-2,5-二甲基吡嗪的生物合成路徑（圖4），其以L-蘇氨酸和D-葡萄糖為底物，產(chǎn)物1分子氨基丙酮與1分子3-氨基-2-戊酮、1分子2-氨基-3-戊酮分別脫水縮合生成2-乙基-3,6-二甲基-2,5-二氫吡嗪和3-乙基-2,6-二甲基-2,5-二氫吡嗪，隨后分別被氧化為2-乙基-3,5-二甲基吡嗪和3-乙基-2,5-二甲基吡嗪。

圖4 吡嗪類化合物的微生物合成途徑Fig.4 Microbial synthesis pathways of pyrazine compounds

2020年，XU J Z等[61]在大腸桿菌（E.coli）中異源表達蘇氨酸脫氫酶和外源的氨基丙酮氧化酶實現(xiàn)從頭合成2,5-DMP，產(chǎn)量為1.43 g/L，以上研究表明設(shè)計構(gòu)建一條新的、效率更高的酶法合成TTMP路徑可行。總之，目前尚未在微生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)更高效的酶法合成TTMP路徑。為了提高其合成效率，可設(shè)計構(gòu)建一條以乙偶姻作為底物，經(jīng)ω-轉(zhuǎn)氨酶、二氫四甲基吡嗪聚合酶及二氫四甲基吡嗪氧化酶逐步催化合成TTMP的新路徑，利用合成生物學(xué)和代謝工程的手段構(gòu)建高效的異源合成TTMP的微生物細胞工廠，進而實現(xiàn)TTMP合成由低效的“化學(xué)合成”到高效的“酶法合成”轉(zhuǎn)變（圖5），具有重要的理論意義及應(yīng)用價值。

圖5 2,3,5,6-四甲基吡嗪化學(xué)合成及酶法合成途徑Fig.5 Chemical and enzymatic synthesis pathway of 2,3,5,6-tetramethylpyrazine

3 增加白酒中TTMP含量的策略

在解析微生物合成TTMP機理后，更多研究人員把精力集中到如何提高白酒中TTMP含量上，首先篩選高產(chǎn)TTMP的功能性菌株，通過采取優(yōu)化發(fā)酵條件制備液態(tài)增香菌劑串蒸酒醅；制備固態(tài)強化大曲，應(yīng)用于醬香型大曲模擬生產(chǎn)中；制備強化麩曲與傳統(tǒng)大曲協(xié)同參與窖面糟發(fā)酵結(jié)合尾酒浸提麩曲后串蒸等措施，使白酒中TTMP的含量達到最大，進而起到提質(zhì)增效的目的。近年來增加白酒中TTMP含量的策略見表1。

表1 近年來增加白酒中2,3,5,6-四甲基吡嗪含量的策略Table 1 Strategies on increasing 2,3,5,6-tetramethylpyrazine content in Baijiu in recent years

4 小結(jié)與展望

TTMP在白酒中作為健康功能因子已被人們所熟知，“健康白酒”理念的引領(lǐng)對整個白酒界具有重要的現(xiàn)實意義。微生物合成TTMP主要分為微生物合成中間代謝產(chǎn)物，后經(jīng)化學(xué)反應(yīng)合成TTMP兩個階段。隨著合成生物學(xué)技術(shù)的高速發(fā)展，利用合成生物學(xué)和代謝工程手段構(gòu)建一條TTMP從頭合成的酶法合成路徑，該路徑起始于乙偶姻，依次在ω-轉(zhuǎn)氨酶、二氫四甲基吡嗪聚合酶、二氫四甲基吡嗪氧化酶作用下合成TTMP，實現(xiàn)TTMP由低效的“化學(xué)反應(yīng)合成”到高效的“酶法合成”的轉(zhuǎn)變，為在微生物體內(nèi)異源構(gòu)建TTMP從頭合成路徑及其他吡嗪類化合物的機制研究奠定基礎(chǔ)，具有重要的理論意義及應(yīng)用價值。異源構(gòu)建微生物從頭合成TTMP途徑強化其合成量，結(jié)合工藝優(yōu)化，進一步提高酒體中TTMP含量，進而為醬香型白酒基酒提質(zhì)增效提供一種新的、可被企業(yè)實際應(yīng)用的方法。總之，可以從多角度、多方式探究白酒中TTMP對白酒風(fēng)味及功能的影響，對提升白酒的功能性及推動整個白酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有舉足輕重的作用。