基于GC-IMS對不同品種咖啡豆揮發(fā)性有機(jī)物指紋圖譜分析

楊 莉，楊衛(wèi)星，李 茜，樊竹青，李華健，李學(xué)玲*

（1.普洱學(xué)院 生物與化學(xué)學(xué)院，云南 普洱 665000；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650100；3.文山州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，云南 文山 663000）

咖啡屬于茜草科植物，原產(chǎn)地為埃塞俄比亞，生于熱帶或亞熱帶，我國云南和海南為主要栽培地區(qū)[1-2]。阿拉比卡、羅布斯特和利比里亞是咖啡豆的三大品種，其中阿拉比卡和羅布斯特咖啡種植最廣泛，也最具有經(jīng)濟(jì)價值[3]。目前咖啡的生產(chǎn)量和消費(fèi)量在世界三大飲料作物中位居首位，成為石油之后，世界第二的原料型產(chǎn)品[4-6]。咖啡揮發(fā)性組分的類型及含量直接決定了咖啡特征性香氣的表型，咖啡香氣是判斷咖啡等級的一個重要指標(biāo)[7-10]。生咖啡豆風(fēng)味較差，需要經(jīng)過適當(dāng)?shù)暮姹禾幚恚偈癸L(fēng)味前體物質(zhì)發(fā)生系列化學(xué)反應(yīng)，生成醇類、酯類、醛酮類、呋喃類、吡啶類、吡嗪類、吡咯類、酚酸類及硫化物等揮發(fā)性香氣化合物，形成咖啡的特征風(fēng)味[11-13]。弘子姍等[14]采用頂空氣相色譜-離子遷移譜法（headspace gas chromatography-ion mobility spectrometry，HS-GC-IMS）技術(shù)證實了生咖啡豆粉、烘焙咖啡豆粉及熟咖啡豆粉之間揮發(fā)性物質(zhì)差異成分，區(qū)分生、熟咖啡豆粉品種及地理來源差異。周斌等[15]對不同產(chǎn)地咖啡豆香氣成分組成進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)的咖啡揮發(fā)性香氣成分基本相似，含量有差別。王瑩等[16]研究了興隆咖啡烘焙過程中香氣物質(zhì)變化規(guī)律，根據(jù)揮發(fā)性成分的不同可區(qū)分不同烘焙度咖啡。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)影響咖啡風(fēng)味的可揮發(fā)物質(zhì)成分約有400多種，其中約50%是醛類物質(zhì)，約20%是酮類物質(zhì)，約8%酯類物質(zhì)，約7%是雜環(huán)化合物，約2%是二甲基硫化物，還有少量其他類有機(jī)物以及有特殊氣味的硫化物[17-19]。

目前，對咖啡風(fēng)味評價大多依賴于感官評價，難以作為可靠的數(shù)據(jù)分析基礎(chǔ)，因此需要借助電子鼻、電子舌、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用、氣相色譜-嗅聞等儀器進(jìn)行分析[20-22]。氣相色譜-離子遷移譜法（gas chromatography-ion mobility spectrometry，GC-IMS）是一種分辨率高、靈敏度強(qiáng)、分析高效、操作簡便的快速檢測技術(shù)，樣品無需復(fù)雜預(yù)處理，在常壓電場作用下可直接進(jìn)行檢測[23-25]，已廣泛應(yīng)用于果蔬、肉類、乳品飲料等的產(chǎn)地溯源、品質(zhì)評價、食品摻假[26-27]等領(lǐng)域，而將GC-IMS用于咖啡揮發(fā)性有機(jī)物的分析研究報道較少。

該研究利用頂空氣相色譜（HS-GC）-離子遷移譜（GCIMS）技術(shù)對4個不同品種咖啡生豆樣品（A1、B1、C1、D1）及其經(jīng)烘焙后熟豆樣品（A2、B2、C2、D2）揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測和分析，并對其進(jìn)行主成分分析（principal componentanalysis，PCA）。以期比較不同品種咖啡豆揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)之間的差異，為咖啡品種篩選、品質(zhì)評價等方面提供理論依據(jù)，為咖啡烘焙加工工藝改進(jìn)及產(chǎn)品研發(fā)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

咖啡豆（78667、卡蒂姆、耶加卡杜拉、哥倫比亞波邦）樣品：來自于普洱市思茅區(qū)木乃河工業(yè)園區(qū)咖啡莊園，均為水洗豆，其中，生咖啡豆打粉（80目）樣品分別編號為A1、B1、C1、D1；生咖啡豆烘焙后打粉（80目）樣品分別編號為A2、B2、C2、D2）。每個樣品平行2次。

無水乙醇、乙腈（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；丙酮、2-丁酮、2-戊酮、2-己酮、2-庚酮、2-辛酮、2-壬酮（均為分析純）：北京國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Flavour Spec1H1-00053型GC-IMS聯(lián)用儀：德國G.A.S公司；SANTOKER R500E烘焙機(jī)：北京三豆客科技有限公司；CTC-PAL自動進(jìn)樣裝置：瑞士CTC Analytics AG公司；AL204型電子分析天平：梅特勒托利多儀器有限公司；FW-80型高速萬能粉碎機(jī)：北京市醫(yī)療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 咖啡豆烘焙條件

氣源為液化石油氣，火力為0.5 kPa，風(fēng)門為4，轉(zhuǎn)速為60 r/min。烘焙生豆質(zhì)量約1 kg，入豆溫度180～190 ℃，烘焙時間15～20 min，中深度烘焙。烘焙日期2022年12月23日，咖啡豆粉碎過80目篩。

1.3.2 HS-GC-IMS測定條件

HS條件：稱取1 g咖啡豆粉末樣品，置于20 mL頂空瓶中，40 ℃孵育20 min后進(jìn)樣。采用自動頂空進(jìn)樣方式，頂空孵化溫度40 ℃；孵化時間20 min；孵化轉(zhuǎn)速500 r/min；頂空進(jìn)樣針溫度85 ℃；進(jìn)樣量200 μL[14]。

GC條件：MXT-5色譜柱（15 m×0.53 mm，1 μm）；柱溫60 ℃；分析時間30 min；載氣為高純氮氣（N2）（純度≥99.999%）；柱流速初始為2 mL/min，保持2 min，2～10 min柱流速線性增加至100 mL/min，10～20 min柱流速線性增加至150 mL/min。

IMS條件：漂移管長度98 mm；管內(nèi)線性電壓500 V/cm；漂移管溫度45 ℃；漂移氣為高純氮氣（N2）（純度≥99.999%）飄移氣體流速150 mL/min[15]。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

采用LAV軟件與GC-IMS Library Search軟件內(nèi)置的美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（national institute of standards and technology，NIST）和IMS數(shù)據(jù)，根據(jù)保留時間/遷移時間進(jìn)行二維譜圖物質(zhì)定性分析。采用Reporter和Gallery插件程序構(gòu)建揮發(fā)性有機(jī)物的差異圖譜和指紋圖譜，比較不同樣品間揮發(fā)性有機(jī)物差異進(jìn)行相對定量。采用Dynamic PCA plug-ins插件程序進(jìn)行主成分分析（PCA）。采用Excel 2019對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 咖啡揮發(fā)性有機(jī)物差異對比

采用GC-IMS儀器LAV分析軟件中的Reporter 插件程序?qū)Σ煌Х榷箵]發(fā)性成分進(jìn)行三維對比，橫坐標(biāo)左側(cè)紅色豎線為反應(yīng)離子峰（reaction ion peak，RIP）。RIP峰兩側(cè)的每一個點代表一種揮發(fā)性有機(jī)物。顏色代表物質(zhì)的濃度，白色表示濃度較低，紅色表示濃度較高，顏色越深表示濃度越大。不同咖啡揮發(fā)性有機(jī)物GC-IMS分析譜圖見圖1。由圖1可知，生豆與熟豆揮發(fā)性有機(jī)物差異較大。

圖1 不同咖啡豆揮發(fā)性有機(jī)物GC-IMS二維譜圖Fig.1 GC-IMS two-dimensional spectrumof volatile organic compounds in different coffeebeans

為了更清晰地展現(xiàn)樣品間揮發(fā)性香氣成分的差異，通過GC-IMS方法進(jìn)行檢測，采用差異模式對比，結(jié)果見圖2。

圖2 不同咖啡豆揮發(fā)性有機(jī)物GC-IMS譜圖Fig.2 GC-IMS spectra of volatile organic compounds in different coffeebeans

由圖2可知，以樣品A1為參照，樣品B1、C1、D1中揮發(fā)性化合物相對含量與參照樣品相當(dāng)，樣品A2、B2、C2、D2中揮發(fā)性化合物相對含量高于參照樣品，說明咖啡豆樣品經(jīng)過烘焙熟制后，產(chǎn)生了新物質(zhì)。為了明確對比咖啡豆樣品中具體的差異物質(zhì)，選取所有反應(yīng)離子峰進(jìn)行指紋圖譜對比。

2.2 不同咖啡揮發(fā)性有機(jī)物GC-IMS定性分析

從GC-IMS分析譜圖和差異圖，可以明顯看出，不同品種咖啡的揮發(fā)性香氣成分存在明顯差異，但依舊無法明確各信號峰所具體對應(yīng)的揮發(fā)性物質(zhì)，因此需要對圖譜中的特征性物質(zhì)進(jìn)行定性分析。

GC-IMS從不同品種咖啡豆樣品共檢測出104種揮發(fā)性有機(jī)物，根據(jù)NIST數(shù)據(jù)庫和IMS數(shù)據(jù)庫比對后，結(jié)果見表1。由表1可知，定性檢測出81種揮發(fā)性有機(jī)物，其中，酯類21種，醇類13種，酮類11種，醛類11種，酸類7種，醚類3種，烯類3種，呋喃類3種，吡啶類3種，吡嗪類2種，其他化合物4種。

表1 不同咖啡豆揮發(fā)性有機(jī)物GC-IMS定性分析結(jié)果Table 1 Results of GC-IMS qualitative analysis of volatile organic compounds in different coffeebeans

2.3 不同咖啡樣品的HS-GC-IMS指紋圖譜

為進(jìn)一步分析比較咖啡樣品之間揮發(fā)性有機(jī)物差異，用LAV軟件中GalleryPlot插件生成不同咖啡樣品特征揮發(fā)性成分的指紋圖譜，以識別不同咖啡樣品的特征峰區(qū)域。每一行代表一個樣品中不同揮發(fā)性有機(jī)物的信號峰；每一列代表同一揮發(fā)性有機(jī)物在不同樣品中的信號峰，每個特征峰的顏色代表強(qiáng)度，藍(lán)色為背景，紅色代表物質(zhì)成分，紅色越深表示含量越高。不同咖啡樣品揮發(fā)性有機(jī)物的指紋圖譜見圖3。

圖3 不同咖啡豆揮發(fā)性有機(jī)物指紋圖譜Fig.3 Fingerprint of volatile organic compounds in different coffeebeans

由于咖啡豆樣品揮發(fā)性有機(jī)物種類及含量差距較大，將明顯差異的物質(zhì)從左往右依次分為A、B、C、D、E、F、G、H、I、J十個區(qū)域，由圖3可知，A區(qū)域中標(biāo)出的揮發(fā)性有機(jī)物在8個咖啡豆樣品中均有檢出且含量相對較高，共有的風(fēng)味物質(zhì)有丙酮、3-呋喃甲醇、丙烯酸乙酯，其中丙烯酸乙酯具有強(qiáng)烈的果香味，奠定了咖啡豆樣品總體的香氣基調(diào)；B區(qū)域中標(biāo)出的揮發(fā)性有機(jī)物為咖啡豆樣品A1、B1、C1、D1中共有的香氣化合物，主要為醛類物質(zhì)、酯類物質(zhì)，還含有部分醇類物質(zhì)、酸類物質(zhì)，其中丁酸甲酯呈現(xiàn)干酪香氣；烯丙基腈、丙醛呈現(xiàn)刺激性氣味；乙酸乙酯呈現(xiàn)水果香味；C區(qū)域中標(biāo)出的物質(zhì)在咖啡豆樣品A2、B1、B2、D2中含量較高的物質(zhì)，主要包括3-羥基-2-丁酮、正戊醛，賦予咖啡奶油的香氣和特殊的香味；D區(qū)域中標(biāo)出的物質(zhì)丁酸甲酯、乙酸甲酯為咖啡豆樣品D1特征物質(zhì)，分別呈現(xiàn)干酪的香氣及芳香氣味；E區(qū)域中標(biāo)出的物質(zhì)為咖啡豆樣品A2、B2、C2、D2中含量較高的物質(zhì)，其中乙酸蘇合香酯具有強(qiáng)烈的梔子花香；丁位己內(nèi)酯、2-乙酰吡咯、2,6-二甲基吡啶、2,3-戊二酮、2-甲基吡嗪呈現(xiàn)焦香的氣味；檸檬烯呈現(xiàn)檸檬的香氣；庚酸、1-庚醇、1-丁醇呈現(xiàn)油脂的香氣；丁酸丁酯、甲酸丁酯、乙酸乙酯、丙酸異戊酯呈現(xiàn)水果的香味；甲酸乙酯呈現(xiàn)芳香氣味；F區(qū)域中標(biāo)出的物質(zhì)為咖啡豆樣品A2、C2、D2中含量較高的物質(zhì)，四氫噻吩-3-酮、正己醇、1-丁醇、2,3-丁二酮呈現(xiàn)脂香氣味；丙酸丙酯呈現(xiàn)果香氣味；G區(qū)域中標(biāo)出的物質(zhì)為咖啡豆樣品A2、C2中含量較高的物質(zhì)，當(dāng)歸內(nèi)酯呈現(xiàn)煙草的氣味；丁酸乙酯、3-甲基丁醛等呈現(xiàn)果香氣味；樣品H區(qū)域中標(biāo)出的物質(zhì)為咖啡豆樣品B2的特征物質(zhì)，為2-甲基丙烯醛、3-甲基-2-丁烯醛；I區(qū)域中標(biāo)出的物質(zhì)為咖啡豆樣品B2、D2中含量較高的物質(zhì)，2-庚酮等具有脂香的味道；丙酸異丁酯、丁酸異戊酯呈現(xiàn)果香味道；2-乙基呋喃、2-庚基呋喃、2-乙酰基呋喃、2-呋喃甲醇等呋喃類化合物呈現(xiàn)焦香氣味；丁二酸二乙酯有愉快的香味；J區(qū)域中標(biāo)出的物質(zhì)為咖啡豆樣品D2特征物質(zhì)，糠（基）硫醇、2,6-二甲基吡啶呈現(xiàn)焦香氣味；丁酸具有難聞的氣味。咖啡豆在烘焙過程中發(fā)生化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生了咖啡特有的香氣成分物質(zhì)，烘焙過的咖啡豆樣品中含有強(qiáng)烈焦香氣味的物質(zhì)，多為呋喃類化合物和含氮含硫類化合物，為美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物，個別樣品具有水果的香氣、脂香以及花香，豐富咖啡豆樣品的整體風(fēng)味。

2.4 不同咖啡樣品GC-MIS主成分分析

用LAV軟件中的Dynamic PCA插件進(jìn)行不同咖啡樣品的主成分分析結(jié)果見圖4。由圖4可知，PC1和PC2的方差貢獻(xiàn)率分別為93%、2%，累計方差貢獻(xiàn)率為95%，說明主成分可基本完全反映咖啡豆樣品組間的所有特征，可以反映不同品種咖啡豆之間揮發(fā)性物質(zhì)差異的因素。其中咖啡豆樣品B2和D2組，樣品A2和C2組間差距較小，聚在一起，表明不同種類咖啡之間的風(fēng)味物質(zhì)相似。而樣品A1和D2組間相差甚遠(yuǎn)，表明咖啡豆之間的風(fēng)味存在較大差異。這一結(jié)果說明采用HS-GC-IMS方法結(jié)合PCA，能較好判別和區(qū)分不同品種咖啡豆樣品。

圖4 不同咖啡豆樣品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主成分分析結(jié)果Fig.4 Principal component analysis results of volatile flavor components of different coffeebeans samples

3 結(jié)論

該研究利用HS-GC-GC-IMS技術(shù)對4個不同品種咖啡生豆樣品（A1、B1、C1、D1）及其經(jīng)烘焙后熟豆樣品（A2、B2、C2、D2）揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行檢測和分析，結(jié)果表明，可定性檢出81種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。GC-IMS指紋圖譜表明，樣品D1特征風(fēng)味物質(zhì)為丁酸甲酯、乙酸甲酯；樣品A2、C2特征風(fēng)味物質(zhì)為當(dāng)歸內(nèi)酯，丁酸乙酯、3-甲基丁醛；樣品B2特征風(fēng)味物質(zhì)為2-甲基丙烯醛、3-甲基-2-丁烯醛；樣品D2特征風(fēng)味物質(zhì)為2-呋喃甲硫醇、2,6-二甲基吡啶。PCA結(jié)果表明，樣品B2、D2及A2、C2距離接近，樣品A1、D2距離較遠(yuǎn)。GC-IMS技術(shù)具有簡單、快速、無損等特點，該技術(shù)為咖啡豆的品種識別、產(chǎn)地追溯、品質(zhì)控制等方面的判別提供支撐。