產蛋白酶芽孢桿菌的篩選、耐酸性馴化及蛋白酶酶學性質分析

張 璋，趙騰飛，李紅霞，宋露露

（茅臺學院 釀酒工程系，貴州 遵義 564507）

白酒是我國特有的蒸餾酒，具有悠久的歷史和獨有的特點，在世界蒸餾酒中別樹一幟。白酒釀造原料中的蛋白質經過蛋白酶降解可以形成氨基酸和多肽類物質。這些水解產物為釀酒功能微生物提供有機氮源促進生長繁殖及代謝，有益于發酵進程；同時，也是形成白酒風味的重要前體物質[1-2]，白酒生產中蛋白酶的存在對白酒的產量和風味有著重要意義。蛋白酶在自然界中廣泛存在，因其在食品、化學品、農業和醫藥等不同行業領域的普遍應用而得到廣泛認可[3]。據估計，至2020年全球工業酶市場總額達到近62億美元[4]，其中蛋白酶占全球工業酶市場的60%以上[5]。

芽孢桿菌屬（Bacillussp.）屬于便于培養的革蘭氏陽性菌，易于進行基因操作和表達性質各異的多種酶類，適合于實驗室研究及工業生產中多個方面的應用[5]。參與蛋白酶生產的芽孢桿菌包括蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、嗜熱芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus）、莫哈韋芽孢桿菌（Bacillus mojavensis）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）等[5-6]，它們具有豐富的水解酶系統，可分泌大量淀粉酶和蛋白酶，在白酒釀造中有著舉足輕重的地位，也是不同香型大曲中共有的優勢細菌種[7-8]。有研究表明，酒醅中的枯草芽孢桿菌產淀粉酶的能力最強，巨大芽孢桿菌產蛋白酶的能力最強[9]。芽孢桿菌在白酒發酵過程中主要的優勢代謝產物是乙偶姻（3-羥基-2-丁酮）、2,3-丁二醇和酯類等芳香化合物，為醬香型白酒的復雜風味體系提供了前體物質，對白酒質量的穩定起到關鍵的作用[10]。

醬香型白酒傳統窖池發酵過程中，窖池內的酸性物質隨發酵的進行不斷產生和積累，使pH值呈現不斷下降的趨勢。在窖池酸度下降到一定程度后，微生物的生理活動會受到嚴重抑制，發酵能力逐漸下降，從而對原料轉化利用的效率顯著降低，乃至停止[11-12]。因此，針對白酒發酵后期高酸度環境下、仍有旺盛的生理代謝活動及較高的原料轉化利用率的典型功能微生物的深入研究，不僅對提升白酒的質與量有關的工藝優化有著至關重要的意義，也是對此類釀造功能微生物后續深度開發和利用的必要環節。

本研究采用福林酚-酪蛋白透明圈法對貴州仁懷茅臺鎮當地的醬香型白酒大曲中的芽孢桿菌進行分離篩選，結合菌株形態學觀察以及16S rDNA序列測定對菌株進行鑒定，對所得菌株進行耐酸性馴化，并以蛋白酶活力為評價指標，針對耐酸性馴化前后菌株所產蛋白酶的酶學性質進行探討，同時探索了馴化后菌種對乙醇、葡萄糖、NaCl和乳酸的耐受性，以研究耐酸性馴化對菌株所產蛋白酶的影響以及在白酒發酵酒糟降解中的應用潛能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

醬香型白酒大曲樣品：貴州省仁懷市茅臺鎮某酒廠。

1.1.2 試劑

酵母提取物、胰蛋白胨、干酪素：北京奧博星生物技術有限責任公司；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）引物、PCR預混液：生工生物工程（上海）股份有限公司；氫氧化鈉、碳酸鈉、三氯乙酸、鹽酸、乳酸、L-酪氨酸、福林酚、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、無水乙醇等試劑（均為分析純）：國藥集團藥業股份有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

LB固體培養基：酵母浸粉0.5 g、蛋白胨1 g、氯化鈉1 g、瓊脂2 g，加入100 mL超純水后混勻，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

LB奶粉培養基[13]：酵母浸粉0.5 g、蛋白胨1 g、氯化鈉1 g、瓊脂2 g、奶粉1 g，加入100 mL超純水后混勻，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

液體發酵培養基[14]：葡萄糖1 g，硫酸銨0.15 g，磷酸氫二鉀0.15 g、磷酸二氫鉀0.5 g，硫酸鎂0.02 g，氯化鈉0.05 g，脫脂奶粉1 g，加入100 mL超純水后充分溶解，115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺：浙江孚夏醫療科技有限公司；DHP-9402型恒溫培養箱：上海森信實驗儀器有限公司；BSD-YX3200型立式智能精密搖床、YXQ-100A型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實業有限公司；DHG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱：常州潤華電器有限公司；JNOEC XS-212-202型電子顯微鏡：上海圓派科學儀器有限公司；HH-2型恒溫水浴鍋：上海力辰邦西儀器科技公司；FA2004N型電子天平：上海菁海儀器有限公司；UV-5100型紫外可見分光光度計：上海棱光技術有限公司；PHS-3E型pH校對儀：上海儀電科學儀器股份有限公司；SIGMA-1-14型低溫離心機：美國Sigma-Aldrich公司；DYY-6C型瓊脂糖凝膠電泳儀：北京六一生物科技有限公司；S1000TM型PCR擴增儀：美國Bio-Rad公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 產蛋白酶菌株的分離及初篩[15]

稱取1 g曲樣置于15 mL離心管中，加入10 mL生理鹽水混勻，然后將其置于80 ℃恒溫水浴鍋中水浴10 min，期間每隔2 min振蕩混勻。水浴結束后取上清液用生理鹽水進行梯度稀釋。選取稀釋度分別為10-5、10-6、10-7、10-8的上清液，以四區劃線法接種至LB奶粉培養基上，30 ℃倒置培養24 h。觀察篩選平板上單菌落的透明水解圈，并比較透明圈（D）和菌落（d）直徑之間的比值（D/d），挑取比值大的菌落進行復篩。

1.3.2 高產蛋白酶芽孢桿菌的復篩

將挑取的菌落接種于液體發酵培養基，30 ℃、200 r/min條件下振蕩培養16 h，作為種子液。將種子液稀釋到OD600nm值為0.6，按照2%（V/V）的接種量轉接至含有100 mL液體發酵培養基的搖瓶中，30 ℃、200 r/min條件下振蕩培養24 h。發酵結束后12 000 r/min離心10 min，收集發酵上清液。測定發酵上清液中蛋白酶的活力，對產高活性蛋白酶菌株進行篩選。

1.3.3 蛋白酶活力測定

采用福林酚法測定蛋白酶活性[16]。蛋白酶活定義：1 mL蛋白酶液在40 ℃、pH 7.2的條件下，1 min水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸所需的酶量為1個蛋白酶活力單位（U/mL）。

1.3.4 高產蛋白酶芽孢桿菌菌株的鑒定

形態觀察：將產蛋白酶菌株接種至LB固體培養基上，在30 ℃條件下培養2 d后，挑取單菌落觀察菌落形態，并將其接種至液體發酵培養基中，30 ℃、200 r/min條件下培養16 h后進行革蘭氏染色，顯微鏡觀察細胞形態特征。

分子生物學鑒定：采用苯酚氯仿抽提法[17]對目標菌株的基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）進行提取，以其為模板，采用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）和1492（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）進行16S rDNA的PCR擴增。PCR擴增體系：DNA 0.5 μL，rTaq聚合酶0.5 μL，10×buffer 5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）4 μL，引物27F和1492各2 μL，雙蒸水（ddH2O）補足50 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，共循環35次；72 ℃再延伸7 min。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，測序結果提交至美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中，采用基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）進行同源性比對，比對結果使用MEGA 11.0生物學軟件中的鄰接（neighborjoining，NJ）法構建系統發育樹[18-19]，確定菌株的種屬。

1.3.5 高產蛋白酶芽孢桿菌耐酸性馴化

馴化點的確定：將篩選得到的高產蛋白酶芽孢桿菌菌株接種至液體發酵培養基中，在30 ℃、200 r/min條件下振蕩培養16 h進行活化，以2%（V/V）的接種量轉接于pH值分別為7.0、6.0、5.0、4.0、3.0、2.0、1.0的液體發酵培養基擴大培養，在發酵3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、18 h、26 h、40 h、48 h、60 h、72 h時取樣，使用紫外分光光度計在波長600 nm處測定菌液的OD600nm值，并測定蛋白酶活力，每個時間點測定三次，繪制生長曲線及酶活力曲線。

耐酸性馴化：確定馴化點pH后，將篩選菌株從馴化點pH的液體培養基內培養至OD600nm值達到0.6時，以2%（V/V）的接種量轉接入低于馴化點pH 0.5的100 mL液體發酵培養基中，30 ℃、200 r/min條件下培養至OD600nm值達到0.6時，再以2%（V/V）的接種量轉接入低于馴化點pH 1.0的100 mL液體發酵培養基中，30 ℃、200 r/min條件下培養，使用紫外分光光度計測定培養3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、18 h、26 h、40 h、48 h、60 h、72 h時菌液的OD600nm值，并測定蛋白酶活力，每個時間點測定三次，繪制生長曲線及蛋白酶酶活力曲線。

1.3.6 耐酸性馴化菌株的耐受性分析

參照文獻[20-21]對馴化后的菌株進行乙醇耐受性、葡萄糖耐受性、NaCl耐受性和乳酸耐受性的測定。

1.3.7 蛋白酶粗酶的酶學性質研究[22-25]

pH對蛋白酶活力的影響：將底物用不同pH值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0）的緩沖液溶解配制，測定蛋白酶活力，考察pH對蛋白酶活力的影響。

蛋白酶的pH穩定性：將酶液用最適pH值緩沖液稀釋后，在不同的時間點進行取樣，然后在最適反應pH條件下測定殘余酶活。

溫度對酶活力的影響：分別在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃條件下測蛋白酶的活力，考察溫度對蛋白酶活力的影響。

蛋白酶的溫度穩定性：將酶液在最適溫度條件下保溫，在不同的時間點進行取樣，然后在最適反應溫度條件下測定殘余酶活。

2 結果與分析

2.1 高產蛋白酶菌株的分離及篩選

從醬香型白酒大曲中共分離得到純培養菌株350株，以菌落的透明圈為依據進行初篩，結果篩選到160株產蛋白酶水解透明圈的菌株，其中D/d較大的17株菌株見表1。由表1可知，17株菌株的D/d為1.39～2.13，其中菌株3#的D/d最高，為2.13，其次為5#和17#，D/d分別為1.90、1.86。因此，將菌株3#、5#及17#作為初篩菌株。

表1 產蛋白酶菌株的透明圈及菌落直徑比值Table 1 Transparent circle and colony diameter ratio of proteaseproducing strains

進一步對3株初篩菌株的產蛋白酶活力進行測定，篩選高產蛋白酶活力菌株，結果見圖1。

圖1 初篩菌株產蛋白酶活力測定結果Fig.1 Determination results of protease activity produced by primary screening strains

由圖1可知，菌株3#的的蛋白酶活力較高，其次為菌株5#，與初篩結果一致。菌株3#在培養前6 h時蛋白酶活力上升較為迅速，在培養6～10 h時酶活力上升變得平緩，在培養14 h時具有最高酶活力，達到516.0 U/mL。菌株5#在培養前6 h活性有明顯上升，之后活性變化趨于平緩，在培養10 h時達到最高酶活，為201.8 U/mL。菌株17#在培養過程中蛋白酶活性總體較低，在培養24 h時達到峰值，為55.6 U/mL。因此，選菌株3#為高產蛋白酶活力的目標菌株進行研究，并命名為菌株Cy3。

2.2 菌株Cy3的鑒定

2.2.1 形態觀察

菌株Cy3的菌落及細胞形態特征見圖2。由圖2可知，菌株Cy3在LB奶粉培養基上的菌落呈現白色至乳白色的不透明狀態，表面有褶皺，邊緣無規則不平滑，菌落內部濕潤且不易被挑起。菌株Cy3經革蘭氏染色后結果呈陽性，細胞形態為桿狀，單細胞或多細胞，可形成橢圓形或兩端鈍圓的芽孢。根據菌株Cy3的菌落形態和細胞形態，初步判定菌株Cy3為芽孢桿菌屬（Bacillussp.）。

圖2 菌株Cy3的菌落（A）和細胞（B）形態特征Fig.2 Colony (A) and cell (B) morphological characteristics of strain Cy3

2.2.2 分子生物學鑒定

基于16S rDNA基因序列構建菌株Cy3的系統發育樹，結果見圖3。由圖3可知，菌株Cy3與蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）YHNG19聚于同一分支，具有最高的序列同源性。結合形態特征，最終鑒定菌株Cy3為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）。

圖3 基于16S rDNA基因序列菌株Cy3的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain Cy3 based on 16S rDNA gene sequences

2.3 菌株Cy3的耐酸性馴化

2.3.1 菌株Cy3在不同pH環境下的生長情況及蛋白酶活力變化

環境pH值對菌株的生長代謝有較大的影響[26]，在白酒發酵過程中，由于原料在分解過程中產生酸性的代謝產物，導致釀造環境隨著發酵的進行pH趨于下降的趨勢，這就要求菌株具有一定的耐酸性，從而適應發酵過程中pH的不斷降低[27]。菌株Cy3在不同pH條件下的生長曲線及酶活力曲線見圖4。由圖4A可知，菌株Cy3在pH 1～4范圍內生長困難，在pH值為5時，生長活力有一定的提高，在pH值為6時具有最高的生長活力，而在pH為7時，OD600nm值又有所下降，但下降幅度不大。菌株Cy3所產蛋白酶酶活力和其生長活力具有相同的趨勢，由圖4B可知，在pH為1～4時，菌株Cy3所產蛋白酶酶活力極低，在pH值為5時，酶活力有一定的提升，在pH值為6時酶活力有顯著的提升，在培養至15 h時可達到最高酶活505.0 U/mL。因此，選擇將菌株Cy3的最適生長pH從pH 6馴化至pH 5，以期獲得在較低pH環境下具有較高生長活力的馴化菌株。

圖4 不同pH下菌株Cy3的生長情況（A）及蛋白酶活力（B）變化Fig.4 Changes of growth (A) and protease activity (B) of strain Cy3 under different pH conditions

2.3.2 菌株Cy3耐酸性馴化后的生長情況及蛋白酶活力變化

微生物的生長離不開合適的pH環境，pH會嚴重影響微生物生長過程中機體內發生的酶促反應。培養環境pH的急劇改變，容易引起菌種的快速死亡。因此，可使用pH緩慢改變的策略，幫助微生物逐漸適應新的生長環境。利用梯度pH降低的逐步馴化方式，將菌株Cy3從pH 6培養環境馴化至pH 5培養環境，其在馴化前后的生長曲線及酶活力曲線見圖5。

圖5 耐酸性馴化前后菌株Cy3的生長情況（A）及蛋白酶活力（B）變化Fig.5 Changes of growth (A) and protease activity (B) of strain Cy3 before and after acid tolerance acclimation

由圖5可知，經過馴化，成功提高了菌株Cy3在pH 5環境下的生長活性，生物量有了顯著的增加。在培養15 h時達到最大生物量，OD600nm值為1.764±0.042，是馴化前的2.54倍。然而，所產蛋白酶活力有一定程度的降低，在15 h出現最大酶活，為232.9 U/mL，是馴化前最高酶活的85.5%。酶促反應的效率和pH條件有極大的關系，較低的pH環境不僅可能導致酶促反應的速率降低，甚至可能導致酶這一蛋白質類物質發生不可逆轉的變性從而完全喪失活性。馴化后菌株Cy3所產蛋白酶酶活相比馴化前有所降低，極有可能是由于長期處于較低的pH環境所引起的。生長量的顯著增加雖然導致酶活力微略下降，但對于促進低pH環境下菌種對原料的利用和轉化，仍舊具有一定的積極意義。將馴化后的菌株Cy3命名為菌株Cy3-馴。

2.4 菌株Cy3及Cy3-馴產蛋白酶粗酶液的酶學性質分析

在白酒發酵過程，尤其是醬香型白酒發酵工藝中，高溫制曲、高溫堆積、高溫發酵是整個工藝中的獨特點及關鍵點[28]。而溫度、pH等環境因素的改變對于酶的酶學性質也起著決定性的影響[29-30]。菌株Cy3、Cy3-馴產蛋白酶粗酶液的酶學性質見圖6。

圖6 菌株Cy3及Cy3-馴所產蛋白酶粗酶酶學性質Fig.6 Enzymatic characteristics of crude protease produced by strain Cy3 and Cy3-acclimation

由圖6A可知，菌株Cy3-馴所產蛋白酶的最適反應溫度從60 ℃提高至70 ℃，在60～80 ℃范圍內仍保留有60%以上的活性。由圖6B可知，菌株Cy3-馴所產蛋白酶為中性蛋白酶，且所產蛋白酶的最適反應pH在馴化前后沒有發生明顯改變，但在較低pH（pH 5）下的酶活提高了約4倍。有研究表明，pH能夠驅動蛋白在不同狀態之間切換[31]。因此可能是因為較低的培養pH在一定程度上導致Cy3-馴菌株所產蛋白酶在酸性環境培養條件下酶的構象上產生微弱的改變，從而導致酶活性有較為明顯的提高。由圖6C和圖6D可知，雖然菌株Cy3-馴所產蛋白酶的最適反應溫度有一定的提高，但是該酶的溫度穩定性及pH穩定性都有一定的下降。菌株Cy3所產蛋白酶在60 ℃保溫20 h仍保留60%左右的活性，但菌株Cy3-馴在1 h內活性就基本喪失，可能是因為在70 ℃的最適溫度下長時間的保溫后，較高的溫度對酶的空間結構有較嚴重的破壞，從而導致活性快速的喪失。pH穩定性也出現了同樣的趨勢，菌株Cy3-馴所產蛋白酶在pH 7條件下保溫1 h內活性基本喪失，與pH 6條件下保溫60 h仍能保留20%以上活性相比，有了明顯的差異。造成這種現象的原因可能是長時間的低pH培養條件，對蛋白酶產生了不可逆轉的損傷[31]。但是結合菌株Cy3-馴在較低pH下能夠有較高的生長活力來看，雖然損失了部分穩定性，但較高的生長活性對原料的利用，乃至后期在酸性較大的酒糟的降解應用上，仍舊具有一定的價值。

2.5 菌株Cy3-馴的生物學特性分析

在白酒發酵過程中，菌株對于滲透壓、乙醇、有機酸和葡萄糖的耐受性，直接影響了菌株對原料的利用和轉化。鹽濃度越高，對細胞產生的滲透壓越大，越容易引起細胞水分甚至結構的變化，從而影響菌株的生物活性[32]。淀粉質原料在發酵過程中，經過淀粉酶的水解會生成較高濃度的糖，而過高的糖類也會產生較高的滲透壓，從而對菌株產生危害[32]。乙醇是白酒發酵過程中非常重要的代謝產物，過高的乙醇體積分數會抑制細胞活性，甚至導致菌株的死亡[33]。同時，在白酒發酵過程中，有機酸類物質會大量累積。有機酸是酯類等風味物質的前體物質，但是有機酸含量過高又會對細胞產生嚴重毒害[34]。因此，白酒發酵過程中菌株對于滲透壓、乙醇以及有機酸的耐受性，對發酵的效率和質量有著直接的影響。而且有研究發現，醬香型白酒酒糟中乳酸的含量高達1.84%[35]。因此以乳酸為代表考查菌株Cy3-馴對有機酸的耐受性，更有利于拓展其后期在酒糟降解中的應用。菌株Cy3-馴對NaCl、葡萄糖、乙醇及乳酸的耐受性見圖7。

圖7 菌株Cy3-馴對NaCl（A）、葡萄糖（B）、乙醇（C）及乳酸（D）的耐受性Fig.7 Tolerance of strain Cy3-acclimation to NaCl (A), glucose (B), ethanol (C) and lactic acid (D)

由圖7A可知，隨著NaCl含量的逐漸增大，菌株Cy3-馴生長所受到的抑制也逐漸增加，但其可耐受的NaCl含量可達15%，說明菌株Cy3-馴具有較好的耐鹽性。由圖7B可知，隨著葡萄糖含量的不斷增大，菌株Cy3-馴的生長受到一定的抑制，說明高滲透壓對其生物活性產生了負面的影響，但其在葡萄糖含量達到60%～80%時，仍具有一定的生命活動，說明菌株Cy3-馴具有良好的葡萄糖耐受性，可耐受60%的葡萄糖，有利于快速適應白酒釀造復雜的釀造環境，具有良好的應用前景。由圖7C可知，隨著乙醇體積分數的增加，菌株Cy3-馴的生長速度逐漸下降，尤其在乙醇體積分數達到4%以后，下降的速率明顯增加，但菌株Cy3-馴在乙醇體積分數12%內能夠生長，在乙醇體積分數8%內具有較好的生長，這說明該菌株具有較好的乙醇耐受性，可耐受乙醇體積分數8%，能夠在釀造環境中發揮較好的作用。由圖7D可知，菌株Cy3-馴在乳酸體積分數4%以內，隨著乳酸體積分數的增加，生長速率呈下降趨勢，但在乳酸體積分數3%之內具有較好的生命活力，在3%～4%仍能生長，可見該菌株具有一定的乳酸耐受性，可耐受3%的乳酸，在白酒釀造及副產物降解利用中具有潛在的應用價值。

3 結論

該研究利用透明圈法及蛋白酶活力測定從醬香型高溫大曲中分離篩選到一株高產蛋白酶活力的菌株Cy3，通過形態學觀察以及分子生物學鑒定，確定該菌株為蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）。菌株Cy3的最適生長pH為6，在此條件下所產蛋白酶活性為505.0 U/mL。通過對菌株Cy3進行耐酸性馴化后，得到菌株Cy3-馴，其在pH 5環境下生長活力相比馴化前有了較大幅度的提升，培養15 h時OD600nm值提高了2.54倍；其所產蛋白酶最適反應pH為pH 6，最適反應溫度從60 ℃提高至70 ℃，但酶活及穩定性受到酸性培養環境的影響有一定的降低。菌株Cy3-馴具有較好的NaCl耐受性及葡萄糖耐受性，最高耐受含量分別為15%和60%，同時在乙醇體積分數8%及乳酸體積分數3%下仍能生長。本研究對挖掘該菌株在白酒發酵乃至酒糟降解等工業應用方面奠定了一定的科學依據及理論基礎。