醬油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與鮮味和咸味跨模態(tài)感知交互作用

王 昊，李 旭，王文君，張淑妤，何 靜，趙國忠*

（1.天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院 食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.中糧油脂研發(fā)中心，天津 300452）

隨著人們對健康的重視，低鹽、低糖、零添加、綠色有機(jī)等食品的需求與日俱增，營養(yǎng)與美味并重成為食品工業(yè)發(fā)展的新主題[1]。因此，在低鹽、低糖的“健康紅線”下實(shí)現(xiàn)“減鹽不減鮮”成為食品研究的熱點(diǎn)[2]。跨模態(tài)感知交互作用是指一種刺激（感覺）對另一種感覺起到增強(qiáng)或者補(bǔ)充作用[3]，如氣味誘導(dǎo)滋味增強(qiáng)[4]。草莓和檸檬香氣可以增強(qiáng)人們對蔗糖溶液的甜度感知[5]，2-糠基硫醇、2,3-二甲基吡嗪可以增強(qiáng)牛骨蛋白的咸味強(qiáng)度[6]，具有青草氣味的順-3-己烯醇可以顯著增強(qiáng)初榨橄欖油的苦味強(qiáng)度[7]，3-甲基丁酸、2-丁酮、二乙酰以及2-庚酮等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)均可以明顯地提升切達(dá)奶酪的鮮味[8]。因此，氣味與味覺之間跨模態(tài)感知交互作用是提高食品的品質(zhì)重要手段之一。同時(shí)，有研究指出，香草香精可使牛乳甜點(diǎn)產(chǎn)生相同甜味強(qiáng)度的基礎(chǔ)上減少30%～40%的蔗糖用量，含有醬油香氣化合物的鹽在保持油炸花生咸味感知的基礎(chǔ)上降低NaCl的用量[9]。因此，利用氣味與滋味之間的跨模態(tài)感知交互作用是實(shí)現(xiàn)淡鹽增咸[10]、減糖增甜[11]的有效方法。

醬油是我國傳統(tǒng)的增咸提鮮的調(diào)味品，香氣馥郁、滋味獨(dú)特，被廣泛用于各類鹵制品、腌漬食品和食物烹飪中。研究指出，醬油中的3-甲硫基丙醛、1-辛烯-3-醇等揮發(fā)性氣味化合物可以增強(qiáng)人們對鮮味和咸味的感知。然而，不同種類醬油中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及其含量差異距大，香氣屬性復(fù)雜，其他氣味物質(zhì)與滋味是否存在跨模態(tài)感知交互作用尚不明確[12-14]。因此，該研究利用溶劑輔助風(fēng)味物質(zhì)提取法（solvent-assisted flavor evaporation，SAFE）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）和氣相色譜/嗅聞-與滋味相關(guān)（gas chromatography/olfactometryassociated taste，GC/O-AT）技術(shù)篩選鑒定與滋味有關(guān)的揮發(fā)性風(fēng)味化合物；選擇其中與鮮味、咸味相關(guān)的揮發(fā)性物質(zhì)，將其加入0.3%NaCl和0.3%谷氨酸鈉（monosodium glutamate，MSG）的標(biāo)準(zhǔn)溶液中，探究醬油中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)氣味與鮮味、咸味之間的相互作用；利用同源建模，對人體鮮味受體T1R1/T1R3的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行構(gòu)建，使用分子對接研究氣味分子與鮮味受體蛋白的結(jié)合作用，探究氣味與滋味跨模態(tài)感知交互作用的機(jī)制，為利用跨模態(tài)感知交互作用實(shí)現(xiàn)食品風(fēng)味和營養(yǎng)的雙重調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

廣式醬油（NaCl 16 g/100 mL）、日式醬油（NaCl 16 g/100 mL）、商業(yè)輕鹽醬油（NaCl 10 g/100 mL）分別編號為SS1、SS2、SS3：市售。

2-甲基吡嗪、二甲基三硫、3-甲硫基丙醛、3-甲硫基丙醇、4-乙基愈創(chuàng)木酚、糠醛、2-乙酰基呋喃、2-甲氧基-4-乙烯苯酚（均為色譜純）：上海阿拉丁試劑公司；二氯甲烷、乙酸乙酯、2,6-二甲基吡嗪、2-乙基-3,6-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪（均為色譜純）：天津泰艾瑞科技有限公司；2-辛醇、1-辛烯-3-醇、2-乙基-4-羥基-5-甲基-3（2H）-呋喃酮（4-hy droxy-5-methyl-2-propyl-3（2H）-furanone，HEMF）、麥芽酚（均為色譜純）、氯化鈉、無水硫酸鈉、谷氨酸鈉（均為分析純）、烷烴標(biāo)準(zhǔn)品（C6～C35，純度≥99%）：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SAFE蝶形反應(yīng)器：德國Glasbl?sereiBahr公司；EXT75DX復(fù)合分子渦輪真空泵：英國Edwards公司；CS501超級恒溫水浴：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ME3002E電子分析天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；7890 B-5977 A氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS），DB-5毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）：美國Agilent公司；7890B-ODP3氣相色譜嗅聞儀：德國Gerstel公司；DCY-12S水浴式氮吹儀：金壇區(qū)華城譽(yù)仁實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)濃縮液的制備

取80.0 g醬油加入120 mL水中，分別加入1 g亞硫酸鈉、0.5 mL乙酸乙酯，100 μL 2-辛醇（內(nèi)標(biāo)，200 mg/L），再加入50.0 mL二氯甲烷。在20 ℃、250 r/min恒溫?fù)u床上提取60 min，4 ℃、8 000 r/min條件下離心5 min，收集有機(jī)相。加入無水硫酸鈉放置于-20 ℃過夜。

醬油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)濃縮液使用溶劑輔助風(fēng)味蒸發(fā)法（SAFE）進(jìn)行提取分離，蒸餾液氮吹濃縮至250 μL，儲存于-20 ℃冰箱中，用于分析醬油中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。

1.3.2 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

GC條件：初始溫度40 ℃，保持3 min；以5 ℃/min的速率升溫至200 ℃；以10 ℃/min升至230 ℃，保持3 min；以5 ℃/min的速率升溫至250 ℃，保持3 min；氬氣流量為1.2 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃。

質(zhì)譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源；電離能量為70 eV；傳輸溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；溶劑延遲時(shí)間12 min；掃描范圍35～500 m/z。

1.3.3 氣相色譜嗅聞滋味分析

在配備了嗅覺檢測器的GC-MS系統(tǒng)上進(jìn)行了GC/O-AT分析。氣相色譜毛細(xì)管柱的末端與分流器相連，經(jīng)1∶1分流后，分別進(jìn)入MS檢測器和嗅聞端口。嗅聞探測器的接口溫度為150 ℃。感官評價(jià)小組記錄醬油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)味道屬性，同時(shí)記錄香氣強(qiáng)度。采用頻率修正法對GC-O-AT結(jié)果進(jìn)行分析，修正頻率按照式（1）計(jì)算。

式中：T為修正頻率，%；M為描述某種滋味的人員占比，%；

F為嗅聞強(qiáng)度與最強(qiáng)標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)度的比值。

選擇36名（18名男性和18名女性）年齡20～30歲、味覺嗅覺靈敏且無吸煙史的成員，在恒溫（25±2）℃的感官實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行感官評價(jià)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前，使用鮮味、咸味標(biāo)準(zhǔn)溶液（MSG和NaCl）進(jìn)行味覺輪廓和強(qiáng)度訓(xùn)練。

感官評價(jià)樣本使用3位隨機(jī)數(shù)編碼，滋味的評價(jià)采用啜食法，整個(gè)樣品置于舌面上，啜食3～5 s，隨后將樣液吐出。使用10 cm標(biāo)度法評估感知的咸味或鮮味強(qiáng)度。每次感官評價(jià)實(shí)驗(yàn)小組成員需使用去離子水進(jìn)行3次漱口，兩次實(shí)驗(yàn)間隔5 min。

1.3.4 嗅覺增強(qiáng)咸味感知

根據(jù)GC-O-AT的結(jié)果，選取醬油揮發(fā)性風(fēng)味化合物中與鮮味和咸味感知有關(guān)的物質(zhì)，且修正頻率＞70%，按照醬油中實(shí)際濃度（表1）添加到0.3%MSG和0.3%NaCl溶液中。感官評價(jià)結(jié)果記錄為嗅覺增強(qiáng)咸味感知（odorinduced salt enhancement，OISE）和嗅覺增強(qiáng)鮮味感知（odor induced umami enhancement，OIUE）。OISE是添加揮發(fā)性物質(zhì)后的咸度與相同濃度NaCl咸度的差值；OIUE為添加揮發(fā)性物質(zhì)后的鮮度與相同濃度NaCl鮮度的差值。

表1 氣味與滋味跨模態(tài)感知交互作用物質(zhì)的添加量Table 1 Amount of substances added to the cross-modal perception interaction between odor and taste

1.3.5 分子對接

將1.3.2中篩選得出氣味增強(qiáng)鮮味感知的物質(zhì)，與鮮味受體蛋白T1R1-T1R3進(jìn)行分子對接。分子對接模擬使用AutoDock Vina（ADT，version 1.5.6）軟件，移除受體文件中的水分子、并且對受體進(jìn)行質(zhì)子化、加電荷；對于分子對接，對接盒的大小被定義為60×60×60 ?（x，y，z），默認(rèn)的網(wǎng)格間隔被設(shè)置為0.375 ?，盒子中心x為22.468 920，y為4.735 254，z為28.631 797。

人鮮味受體蛋白T1R1（Q7RTX1）和T1R3（Q7RTX0）分別被選為模板，使用Modeller 10.2軟件進(jìn)行同源建模，利用代謝型谷氨酸受體5（6N52）進(jìn)行優(yōu)化。利用全原子對接來尋找最佳對接構(gòu)象。對接結(jié)果通過PyMOL軟件可視化，通過Ligplus軟件和蛋白質(zhì)-配體相互作用分析工具。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次及以上重復(fù)，使用SPSS Statistics 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析，使用Origin 2021進(jìn)行圖形樣本可視化。通過樣本t檢驗(yàn)評估氣味增強(qiáng)味覺的顯著性，P＜0.05表示效果顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC-O-AT結(jié)果分析

由表2可知，從3種醬油中篩選出17種與鮮味和咸味相關(guān)的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，修正頻率均＞60%，其中與咸味有關(guān)的有13種，大多數(shù)是呈現(xiàn)出烘烤香氣和堅(jiān)果香氣的含氮、氧、硫等雜環(huán)類物質(zhì)，如具有燒烤香氣的2,6-二甲基吡嗪、烤肉氣味的3-甲硫基丙醛、可可香氣的2-乙酰基呋喃、烤洋蔥氣味的二甲基三硫等，這些物質(zhì)的修正頻率均＞70%，與咸味的感知表現(xiàn)出強(qiáng)烈的相關(guān)性。麥芽酚、1-辛烯-3醇、4-乙基愈創(chuàng)木酚、2-甲氧基-4-乙烯苯酚與鮮味的感知具有同一性。值得關(guān)注的是，HEMF具有焦糖香氣和甜香，但其可以明顯降低甜味的感知[15]，增強(qiáng)0.3%MSG的鮮味感知[16]。

表2 醬油中與滋味有關(guān)的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)Table 2 Volatile flavor compounds related to taste in soy sauce

2.2 氣味誘導(dǎo)滋味增強(qiáng)

為了研究醬油氣味物質(zhì)與滋味之間的跨模態(tài)感知交互作用，將醬油中與咸味、鮮味有關(guān)且修正頻率＞70%的10種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)加入0.3%NaCl和0.3%MSG溶液中，感官評價(jià)小組成員記錄其香味強(qiáng)度和OIUE、OISE，結(jié)果見圖1。

圖1 添加揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)對0.3%氯化鈉溶液嗅覺增強(qiáng)咸味感知值（a）和0.3%谷氨酸鈉溶液嗅覺增強(qiáng)鮮味感知值（b）的影響Fig.1 Effect of volatile flavor substances addition on odor induced salt enhancement value of 0.3% NaCl (a) and the odor induced umami enhancement value of 0.3% monosodium glutamate (b)

由圖1a可知，2,6-二甲基吡嗪、二甲基三硫、3-甲硫基丙醛、3-甲硫基丙醇、4-乙基愈創(chuàng)木酚可以非常顯著增強(qiáng)0.3%NaCl的咸度（P＜0.001）；1-辛烯-3-醇、糠醛可以極顯著增強(qiáng)0.3%NaCl的咸度（P＜0.01）；HEMF、2-乙酰基呋喃、麥芽酚可以顯著增強(qiáng)0.3%NaCl的咸度（P＜0.05）；其中，3-甲硫基丙醛的OISE值最大，增咸效果最為明顯。以硫化物、吡嗪、愈創(chuàng)木酚為關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的鰹魚干蒸汽餾出物可以顯著性的增強(qiáng)低NaCl溶液的咸味強(qiáng)度和適口感[17]。這可能是醬油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中的3-甲硫基丙醛等物質(zhì)與滋味發(fā)生跨模態(tài)感知交互作用，實(shí)現(xiàn)了增咸作用[9]。由圖1b可知，二甲基三硫、3-甲硫基丙醛、1-辛烯-3-醇、2-乙酰基呋喃、麥芽酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、糠醛可以非常顯著增強(qiáng)0.3%MSG的鮮度（P＜0.001）；2,6-二甲基吡嗪、3-甲硫基丙醇可以極顯著增強(qiáng)0.3%MSG的鮮度（P＜0.01）；HEMF可以顯著增強(qiáng)0.3%MSG的鮮度（P＜0.05）。在模擬基質(zhì)中這些物質(zhì)在一定程度上也可以增強(qiáng)咸味的感知，這表明不同屬性的氣味分子與滋味的跨模態(tài)感知交互作用也可能與滋味[18]一樣存在協(xié)同作用。

2.3 受體蛋白T1R1/T1R3的同源構(gòu)建及構(gòu)象優(yōu)化

通過同源建模構(gòu)建的鮮味受體蛋白的三維結(jié)構(gòu)如圖2a所示。由圖2a可知，該蛋白由N端胞外結(jié)構(gòu)域（extracellulardomain，ECD）和七跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域（seven transmembrane domain，7-TM）形成的二聚體，ECD由包含配體結(jié)合區(qū)域的捕蠅草結(jié)構(gòu)區(qū)（venus flytrap domain，VFD）和富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)區(qū)（cysteine-rich domain，CRD）組成，VFT通過CRD與7-TM結(jié)構(gòu)域相連。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的拉曼分析結(jié)果如圖2b所示。由圖2b可知，氨基酸殘基位于可信區(qū)的比例為99.9%（87.4%位于最優(yōu)區(qū)、11.9%位于合理區(qū)、0.6%位于最大允許區(qū)），不合理區(qū)域的氨基酸殘基占比僅為0.1%，遠(yuǎn)小于5%[20]，因此，所構(gòu)建的人體鮮味受體構(gòu)像是合理的。此外，該蛋白與源模板在保守區(qū)域具有較高的相似性，其均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）=1.54＜2[19]，可以較為準(zhǔn)確的模擬配體和受體的結(jié)合作用。從而進(jìn)一步闡述揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與和味覺的跨模態(tài)感知交互作用的機(jī)理。

圖2 優(yōu)化后鮮味受體蛋白T1R1/T1R3的三級結(jié)構(gòu)模型及拉曼分析結(jié)果Fig.2 Tertiary structure model and ramachandran plot of the optimized taste receptor protein T1R1/T1R3

2.4 氣味與鮮味的跨模態(tài)感知交互作用的潛在機(jī)制

食品風(fēng)味的感知是一個(gè)復(fù)雜的過程，不僅依賴于大腦高級區(qū)域的島葉皮層[21]（insular cortex，IC）和眼窩前額皮質(zhì)（orbitofrontal cortex，OFC）[22]自上而下的認(rèn)知性神經(jīng)調(diào)節(jié)，同時(shí)也基于呈味物質(zhì)與味覺和嗅覺受體結(jié)合所產(chǎn)生的感覺信號。氣味和滋味跨模態(tài)感知交互作用是一個(gè)復(fù)雜的過程，其作用機(jī)理尚不明確，因此利用分子對接，對氣味分子和鮮味受體進(jìn)行模擬結(jié)合，探究氣味和滋味之間跨模態(tài)感知交互的機(jī)理。由表3可知，從醬油中篩選出的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)均與鮮味受體實(shí)現(xiàn)較好的結(jié)合，且結(jié)合能都大于陽性對照L-谷氨酸[23]，味覺的產(chǎn)生依賴味覺物質(zhì)與味覺受體的結(jié)合[24]，因此，醬油中的揮發(fā)性風(fēng)味可能是通過激活相應(yīng)的味覺受體，實(shí)現(xiàn)某些味覺感知的增強(qiáng)。此外，鮮味受體的VFD區(qū)域的Ser40、Lys402、Asp311、Lys334、Asp315、Ser158、Thr181是鮮味受體的關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)。

表3 鮮味增強(qiáng)劑與鮮味受體蛋白作用位點(diǎn)及結(jié)合能Table 3 Interaction sites and binding energies of umami enhancers and umami receptor proteins

氫鍵、疏水作用是氣味分子與鮮味受體蛋白結(jié)合的主要作用力，這與之前的研究表現(xiàn)出高度的一致性[25]。由圖3可知，3-甲硫基丙醛通過醛基和硫原子分別與Lys402、Ser401形成氫鍵，其結(jié)合能達(dá)到-32.6 kJ/mol。二甲基三硫通過與鮮味受體VFD區(qū)域的Ser401、Asp311、Lys402、Lys334結(jié)合，具有最小的結(jié)合能為-43.89 kJ/mol。有研究表明，3-甲硫基丙醛是鮮味受體蛋白T1R1/T1R3的正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑[26]，通過與鮮味受體蛋白ECD區(qū)域的VFD結(jié)合，迫使蛋白二聚體界面相互靠近，使下端富含半胱氨酸的區(qū)域接近，富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域和受體的第二個(gè)細(xì)胞外環(huán)之間的相互作用，使7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白亞基重新定位，它們相互接觸以啟動信號傳遞[27]，由此產(chǎn)生鮮味信號研究表明，咸味物質(zhì)可以與鮮味受體結(jié)合，從而與鮮味表現(xiàn)出協(xié)同作用。由此，氣味與鮮味和咸味之間的跨模態(tài)感知交互作用可能是基于氣味分子與味覺蛋白結(jié)合，改變味覺受體蛋白的構(gòu)象，從而產(chǎn)生味覺信號。

圖3 3-甲硫基丙醛與鮮味受體蛋白、關(guān)鍵氨基酸殘基結(jié)合作用分析Fig.3 Analysis of binding effect of 3-methylthiopropanal with umami receptor protein and key amino acid residues

3 結(jié)論

研究通過GC-O-AT以及GC-MS對醬油中與滋味有關(guān)的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行鑒定，共發(fā)現(xiàn)17種與咸味和鮮味有關(guān)的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。糠醛、2,6-二甲基吡嗪、二甲基三硫、3-甲硫基丙醛、3-甲硫基丙醇、1-辛烯-3-醇、4-乙基愈創(chuàng)木酚可以顯著提高0.3%NaCl溶液咸味感知；2,6-二甲基吡嗪、二甲基三硫、3-甲硫基丙醛、1-辛烯-3-醇、3-甲硫基丙醇、2-乙酰基呋喃、麥芽酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、糠醛可以誘導(dǎo)鮮味增強(qiáng)。醬油中的氣味物質(zhì)通過氫鍵可以通過疏水作用與鮮味受體結(jié)合，引起鮮味受體蛋白的構(gòu)象發(fā)生改變，從而引起鮮味的感知。本研究為利用氣味與滋味跨模態(tài)感知交互作用實(shí)現(xiàn)醬油的鮮味和咸味綜合評價(jià)和利用醬油實(shí)現(xiàn)“減鹽不減鮮、減鹽不減味”的風(fēng)味調(diào)控提供理論依據(jù)。