傳統發酵乳品中產廣譜細菌素乳酸菌選育

劉彩云，麻和平，張文齊，王 潔，彭章普，邵建寧*

（1.甘肅省科學院生物研究所 甘肅省微生物資源開發利用重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省科學院，甘肅 蘭州 730000）

乳酸菌是世界上公認安全的食品級微生物，廣泛應用于食品、醫藥、工業、農業等與人類生活密切相關的領域[1]。乳酸菌能抑制食品中腐敗菌的生長繁殖，抑菌物質主要是其代謝產物如細菌素、過氧化氫、有機酸等[2-4]。其中細菌素是乳酸菌代謝過程中合成并分泌到環境中的具有殺菌作用的多肽類物質，具有安全、高效、無抗藥性、無殘留等優點[5-8]。由于細菌素具有潛在的可作為食品生物防腐劑的開發前景，因此成為生物防腐劑研究領域中的研究熱點[9-11]。乳酸鏈球菌素（Nisin）是目前已商品化且被用于食品防腐的細菌素[12]，但由于乳酸鏈球菌素的抑菌譜較窄，其應用受到了一定的限制[13-15]，因此選育產廣譜細菌素乳酸菌菌株對乳酸菌細菌素的研究開發和應用具有重要意義。

瓊脂擴散法操作簡單易行、結果直觀準確可靠，是抑菌試驗的經典方法，被廣泛應用于抗生素效價測定以及抑菌物質的廣譜抑菌性能檢測[16-18]。但是，傳統瓊脂擴散法在進行抑菌試驗時，每個培養皿中僅能檢測待檢品對一種指示菌的抑菌性能，導致對待檢品進行廣譜抑菌試驗時，檢測工作量大、效率低，因此亟需進行廣譜抑菌試驗方法改進的研究。

本研究以甘肅牧區傳統發酵乳品中分離純化的96株乳酸菌為研究對象[19]，采用瓊脂擴散法進行了產細菌素乳酸菌篩選[20]，并以篩選的1株產細菌素乳桿菌Lp1為出發菌株，經重離子束12C6+輻照誘變[21-22]，采用培養皿分區法篩選廣譜抑菌性能優于出發菌株的突變株。本研究采用的培養皿分區法是作者采用自主設計制作的培養皿分區器[23]，在瓊脂擴散法基礎上進行改良的一種廣譜抑菌試驗方法，以期為產廣譜細菌素乳酸菌高效篩選提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

乳酸菌：96株乳酸菌分離自甘肅牧區傳統發酵乳品采集樣品。

指示菌：大腸埃希氏菌（Escherichia coli）ATCC25922、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC26003、單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）CMCC54004、沙門氏菌（Salmonella）ATCC14028、志賀氏菌（Shigella）CICC10865、克羅諾桿菌（Cronobacter）ATCC29544，由甘肅省微生物菌種保藏中心提供。

1.1.2 培養基

MRS肉湯培養基、MRS瓊脂培養基、M17肉湯培養基、M17瓊脂培養基、營養肉湯（nutrient broth，NB）培養基、營養瓊脂（nutrient agar，NA）培養基：青島海博生物技術有限公司；素瓊脂培養基：1 g瓊脂粉溶于100 mL蒸餾水中。

1.2 儀器與設備

DELTA 320 pH計：梅特勒-托利多集團；JA2003N電子天平：上海精密儀器有限公司；LDZF-75L-II立式高壓蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；DG-1多功能培養箱：上海醫療器械修造廠；BH-2顯微鏡：日本奧林巴斯（中國）有限公司；SW-CJ-2D超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；電子數顯卡尺-II型：哈爾濱量具刃具集團有限責任公司；牛津杯：上海兢翀電子科技發展有限公司；一次性使用培養皿：江蘇新康醫療器械有限公司；6區分區器（分區圈直徑85mm，高度8 mm，6個分區板）：自制。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳酸菌培養上清液制備

將受試乳酸菌菌株按5%接種量，接入盛有10 mL MRS或M17肉湯培養基的試管中，37 ℃恒溫靜置培養24 h后，培養液在4 ℃、8 000 r/min條件下離心10 min，收集上清液，立即做抑菌檢測或4 ℃保存備用。

1.3.2 含指示菌營養瓊脂制備

大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、沙門氏菌、志賀氏菌、克羅諾桿菌按5%接種量分別接種于營養肉湯培養基中，37 ℃恒溫培養20 h。抑菌檢測時，指示菌培養菌液按照1%的添加量加入50 ℃左右營養瓊脂培養基，混合均勻，50 ℃保溫待用，營養瓊脂中指示菌活菌數保持在106～107CFU/mL。

1.3.3 抑菌試驗

瓊脂擴散法：在無菌培養皿中先加入10 mL滅菌后冷卻至50 ℃左右的素瓊脂培養基，平鋪于皿底中，置于水平臺面上待其自然凝固，作為底層；垂直均勻放置無菌牛津杯3個，再加入10 mL含指示菌營養瓊脂，均勻平鋪于底層之上，作為菌層。待菌層完全凝固后取出牛津杯，在形成的3個瓊脂孔洞中分別入100 μL乳酸菌培養上清液，將培養皿水平正置，37 ℃恒溫培養20 h后，觀察有無抑菌圈出現，以抑菌圈直徑大小表示乳酸菌菌株抑制指示菌能力的強弱。

培養皿分區法：在無菌培養皿中先放入培養皿分區器的分區圈，再加入滅菌后冷卻至50 ℃左右的素瓊脂培養基，平鋪于皿底中，置于水平臺面上待其自然凝固，作為底層；在分區圈中心放入牛津杯后，在培養皿的各個分區中分別加入1 mL含指示菌營養瓊脂，平鋪于培養皿分區底層上，待培養皿各個分區中含不同指示菌營養瓊脂完全凝固后，取出牛津杯，在形成的中心瓊脂孔洞中加入100 μL乳酸菌培養上清液，將培養皿水平正置，37 ℃恒溫培養20 h后，采用電子數顯卡尺測量各個分區出現的抑菌扇環的半徑，抑菌扇環半徑為從中心瓊脂孔洞邊緣到指示菌生長邊緣的徑向長度，以抑菌扇環半徑大小表示產細菌素乳酸菌株抑制指示菌能力的強弱。

1.3.4 產細菌素乳酸菌篩選

（1）瓊脂擴散法篩選菌株

將受試乳酸菌菌株培養上清液，分別以大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌為指示菌，采用瓊脂擴散法進行抑菌試驗，篩選出對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌均有抑菌性能的乳酸菌菌株。

（2）有機酸和過氧化氫排除試驗

將初篩乳酸菌菌株培養上清液，用1 mol/L NaOH調pH值至5.0，排除有機酸干擾；再在80 ℃條件下加熱10 min，排除過氧化氫干擾[24]；上清液再經0.22 μm濾膜過濾后，分別以大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌為指示菌，采用瓊脂擴散法進行抑菌試驗，篩選出對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌有較好抑菌效果的乳酸菌菌株。

（3）蛋白酶敏感試驗

將復篩乳酸菌菌株培養上清液分別用胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K在各自作用的最適pH值下處理，各種酶的最終質量濃度為1 g/L，37 ℃水浴3 h后，再調回pH值5.0，以原培養上清液為對照，采用瓊脂擴散法進行抑菌試驗，比較抑菌圈直徑變化，判斷復篩乳酸菌培養上清液對蛋白酶敏感性[25]。

1.3.5 產廣譜細菌素乳酸菌誘變育種

將出發菌株接種于MRS肉湯培養基中，37 ℃恒溫靜置培養24 h后，在無菌條件下，將1.5 mL待輻照菌懸液置于35 mm無菌平皿中，利用中科院近物所重離子加速器淺層輻照終端提供的80 MeV/u，劑量率20 Gy/min的12C6+重離子束進行輻照處理，輻照劑量300 Gy[26]。將輻照后的菌懸液10倍系列稀釋后，選擇適宜稀釋度的稀釋液涂布平板，在MRS瓊脂平板37 ℃恒溫倒置培養24～48 h，挑選所有單菌落，分別接入盛有10 mL MRS肉湯培養基的試管中，37 ℃恒溫靜置培養24 h后，收集上清液（見1.3.1），以大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、沙門氏菌、志賀氏菌和克羅諾桿菌為指示菌采用培養皿分區法進行抑菌試驗，測量抑菌扇環半徑，選出對上述6種指示菌均大于出發菌株抑菌扇環半徑的突變株。

1.3.6 數據處理

試驗數據采用Microsoft Excel 2019軟件進行整理和分析，結果用“平均值±標準偏差”表示。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 產細菌素乳酸菌篩選

將甘肅牧區傳統發酵乳品采集樣品中分離得到的革蘭氏染色陽性、過氧化氫酶陰性96株乳酸菌菌株，桿菌轉接到MRS液體培養基試管中，球菌轉接到M17液體培養基試管中，37 ℃條件下培養24 h，采用瓊脂擴散法，以大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌為指示菌進行抑菌試驗，初步篩選出對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌均具有抑制作用的菌株12株，結果見表1。

表1 篩選的產細菌素乳酸菌的抑菌試驗結果Table 1 Results of bacteriostatic test on screened bacteriocinproducing lactic acid bacteria

2.2 產細菌素菌株的確定

2.2.1 有機酸和過氧化氫排除試驗

對篩選出的12株菌株培養上清液進行排除有機酸、過氧化氫干擾，再采用瓊脂擴散法，以大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌為指示菌進行抑菌試驗，結果見表2。由表2可知，排除有機酸、過氧化氫干擾，12株菌株培養上清液對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌2種指示菌均有抑制作用，由此可以說明，篩選出的菌株培養上清液中有其他抑菌物質對指示菌起抑制作用。菌株Lp1抑菌效果最好，因此選擇該菌株作進一步研究，菌株Lp1對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌的抑菌效果見圖1，其培養上清液對2種指示菌均產生了清晰的抑菌圈。

圖1 菌株Lp1上清液對大腸埃希氏菌（A）及金黃色葡萄球菌（B）的抑菌效果Fig.1 Inhibitory effect of strain Lp1 supernatant on Escherichia coli(A) and Staphylococcus aureus (B)

表2 經過排除試驗的12株菌株對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌試驗結果Table 2 Results of bacteriostatic test on Staphylococcus aureus and Escherichia coli of 12 strains after exclusion test

2.2.2 蛋白酶敏感試驗

菌株Lp1培養上清液排除有機酸和過氧化氫干擾后，經1 g/L的胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K分別處理，其抑菌結果見表3。由表3可知，經胰蛋白酶處理后菌株對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌指示菌的抑菌圈直徑均減小，抑菌能力出現降低趨勢，木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K處理后抑菌活性全部喪失，說明抑菌物質對蛋白酶敏感，結合有機酸和過氧化氫排除試驗，可以確定菌株Lp1培養上清液中主要抑菌活性物質為細菌素類物質。

表3 菌株Lp1的蛋白酶敏感性試驗Table 3 Protease sensitivity tests of strain LP1

2.3 產廣譜細菌素乳酸菌誘變育種

將菌株Lp1作為出發菌株，應用重離子束輻照微生物育種技術，選育產廣譜產細菌素乳酸菌。對重離子束12C6+300 Gy劑量輻照菌株Lp1誘變得到98株突變菌株，采用培養皿分區法測定這些菌株對6種指示菌的抑菌性能，篩選出5株突變株L088、L087、L063、L049、L010對6種指示菌的抑菌效果都優于出發菌株Lp1，5株突變菌株與出發菌株Lp1對6種指示菌抑菌效果見圖2，抑菌扇環半徑測定結果見表4。

圖2 培養皿分區法突變菌株與出發菌株廣譜抑菌效果Fig.2 Broad-spectrum antibacterial effect of mutant and original strains by Petri dish partitioning method

表4 廣譜抑菌突變株抑菌試驗結果Table 4 Antibacterial tests results of broad-spectrum antimicrobial mutants

由圖2可知，圍繞平皿中心瓊脂孔洞各分區都產生了大小不一的抑菌扇環，菌株L088、L087、L063、L049、L010對6種指示菌的抑菌扇環半徑均大于出發菌株Lp1對6種指示菌的抑菌扇環半徑。由表4可知，篩選的5株廣譜抑菌乳酸菌對6種指示菌的抑制作用均優于出發菌株Lp1，其中，對大腸埃希氏菌抑菌性能提高了11.20%～54.27%，金黃色葡萄球菌提高了8.04%～33.28%，單核細胞增生李斯特氏菌提高了14.48%～25.76%，沙門氏菌提高了11.54%～57.92%，志賀氏菌提高了7.80%～21.39%，克羅諾桿菌提高了15.56%～42.13%。其中，菌株L088對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、單核細胞增生李斯特氏菌、沙門氏菌、志賀氏菌、克羅諾桿菌6種指示菌的抑菌扇環半徑比出發菌株Lp1抑菌扇環半徑分別提高了47.81%、33.28%、22.97%、45.25%、21.39%、40.21%；L063對6種指示菌的抑菌扇環半徑比出發菌株Lp1抑菌扇環半徑分別提高了54.27%、29.18%、25.37%、58.03%、17.85%、42.13%，因此菌株L088和L063為廣譜抑菌性能較好菌株。

2.4 抑制特定指示菌性能優良突變株篩選

采用培養皿分區法對重離子束輻照Lp1菌株的98株突變菌株進行廣譜抑菌試驗時，發現有些突變菌株針對6種指示菌中某一種指示菌有良好的抑菌性能，與出發菌株Lp1的抑菌能力相比有明顯提高，從98株突變菌株中篩選出了分別對6種指示菌抑菌效果最強的5株菌株，試驗結果見表5。

表5 抑制特定指示菌突變株抑菌試驗結果Table 5 Antibacterial tests results for specific indicator bacterial mutant strains

由表5可知，與出發菌株Lp1相比，菌株L092對大腸埃希氏菌抑菌扇環半徑提高了60.58%，菌株L084對金黃色葡萄球菌抑菌扇環半徑提高了50.53%，菌株L043對李斯特氏菌和沙門氏菌的抑菌扇環半徑分別提高了53.78%和42.44%，菌株L002對志賀氏菌抑菌扇環半徑提高了148.32%，菌株L072 對克羅諾桿菌抑菌扇環半徑提高了67.47%。

3 結論

本研究先采用瓊脂擴散法對甘肅牧區傳統發酵乳品中分離純化的96株乳酸菌進行了產細菌素菌株篩選，在排除有機酸、過氧化氫干擾和蛋白酶敏感性試驗后，初步判斷篩選的菌株Lp1培養上清液中有細菌素類抑菌物質。采用培養皿分區法，對篩選出的菌株Lp1重離子束12C6+輻照誘變后獲得的98株突變菌株，進行了6種指示菌廣譜抑菌性能比選，選育出對6種指示菌的抑制性能均明顯優于出發菌株Lp1的5株突變菌株，其中L088、L063在5株廣譜抑菌突變菌株中具有較好的廣譜抑菌性。相較于傳統瓊脂擴散法，培養皿分區法通過在培養皿各分區中加入不同指示菌，可以比較在相同條件下對不同指示菌的抑菌性能，抑菌扇環半徑大小可以直觀反映對不同指示菌抑菌能力，在1個培養皿中可同時完成檢測6種指示菌的抑菌試驗，可用于產廣譜細菌素乳酸菌高效篩選。