白酒典型酯類物質在形成空杯香后的釋放過程分析

趙騰飛，張 璋，宋露露，胡智慧，唐佳代，龍亞飛

（茅臺學院 釀酒工程系，貴州 遵義 564507）

醬香型白酒是中國白酒的典型代表，因其獨特的生產工藝和復雜的發酵過程，使其具有“醬香突出，酒體醇厚、細膩優雅，空杯留香持久”的風格特點[1-4]，其中，空杯留香是醬香型白酒的一種重要風味特征。空杯留香是指裝盛過優質白酒的酒杯，酒的香氣會在杯中保留一段時間的現象[5-7]。GB/T 26760—2011《醬香型白酒》將空杯留香是否持久作為評判醬香型白酒品質的標準之一[5]。然而，目前對白酒空杯香的認知主要集中于感官品評描述階段，對空杯香香氣成分的研究較少[6-8]。

孫文佳等[6]應用靜態頂空結合氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀分析醬香型白酒空杯香氣成分，結果鑒定出34種空杯留香化合物，其中3-甲基丁醛、乙酸、3-甲基丁酸乙酯等11個化合物香氣活度值（odor activity value，OAV）＞1；DAN Q等[7]建立了真空輔助吸附筆提取（vacuum assisted sorbent extraction）結合GC-MS的方法分析8種醬香型白酒的空杯香，結果鑒定出27種共有的化合物，其中乳酸含量最高，且L-乳酸、D-乳酸、十六酸乙酯等7個化合物可作為區分不同醬香型白酒空杯香的標志物。這些研究都增加了人們對空杯香氣成分的認知，但是白酒中哪些風味物質更容易在空杯中駐留，以及它們的駐留時間存在哪些差異等有關空杯香形成機制的問題尚不清晰，仍需進一步研究。

頂空固相微萃取技術（headspace-solid-phase microextraction，HS-SPME）是目前應用非常廣泛的萃取香氣物質的方法[9-12]，該技術結合GC-MS等分析儀器可以檢測多種食品中的香氣成分[13-16]。因此，本研究擬建立一種以標準白酒品酒杯作為頂空瓶，結合SPME和GC-MS分析空杯香氣組分的方法。在驗證該方法的氣密性、準確性和精密度后，再以白酒中常見酯類物質標準品的乙醇水溶液為研究對象，模擬空杯香的形成過程，并應用該方法分析酯類物質在空杯中的釋放過程，以探索空杯香的形成機制，為深入理解白酒空杯香的成因奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酯類物質（表1）（純度均＞97%）、乙醇（色譜級）：上海安譜實驗科技股份有限公司；氯化鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。標準白酒品酒杯：宿遷市海全科技有限公司；硅膠塞（Φ38 mm）、橡膠塞（Φ38 mm）：鎮江杰島儀器科技有限公司；封口膜（parafilm M）：德國Sigma-Aldrich公司；鋁箔紙膠帶（0.06 mm厚×50 mm寬）：濟寧迅大管道防腐材料有限公司。

表1 本研究所用酯類物質及其相應沸點Table 1 Esters used in this study and their boiling point

1.2 儀器與設備

7890B-5977A氣相色譜-質譜聯用儀：美國Agilent公司；固相微萃取（SPME）手柄、DVB/CAR/PDMS三相SPME萃取頭：美國Supelco公司；LC-MSA-D磁力攪拌器：上海力辰儀器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酯類混合酒樣的制備

參考孫文佳等[6-7]有關白酒空杯香物質的研究以及酯類物質相關研究[17-19]選出24種白酒典型酯類物質，將24種酯類物質溶解至體積分數為50%的乙醇水溶液中制備成酯類混標酒樣，所有混標酒樣中，酯類物質的質量濃度均為10 mg/L，配制完成后置于-20 ℃冰箱備用。

1.3.2 酒杯頂空瓶結合HS-SPME/GC-MS分析空杯香方法的建立

以標準白酒品酒杯制作頂空瓶[20]，選擇適合標準白酒品酒杯尺寸的塞子（橡膠塞或硅膠塞）或封口膜進行密封。封口后，用鋁箔膠帶紙將瓶口密封（為了保證萃取過程能夠正常傳質，密封至酒杯的1/3處），再進行HS-SPME萃取，萃取完成后，迅速將萃取針插入溫度為250 ℃的GC-MS進樣口解吸附5 min，最后進行GC-MS分析。

為了驗證該方法的可行性，以空酒杯作為頂空瓶，結合HS-SPME/GC-MS完成以下實驗。

密封方式的確定：空酒杯中不添加酒樣，直接用硅膠塞和封口膜密封，然后進行HS-SPME/GC-MS分析；同時，與空白萃取針直接進樣進行HS-SPME/GC-MS分析對比，考察兩種密封方式制作的頂空瓶在HS-SPME過程中是否會引入雜質。每個樣品測試3次取平均值。

氣密性分析：空酒杯中添加酯類混標酒樣1 mL，加超純水定容至5 mL，加NaCl至飽和后分別用硅膠塞和封口膜密封，密封完成后，分別停留1 h、3 h、6 h、12 h，再進行HS-SPME/GC-MS分析。每個樣品測試3次取平均值。

加標回收率和精密度分析：加標前，空酒杯中添加混標酒樣1 mL，加超純水定容至5 mL，加NaCl至飽和后使用硅膠塞密封，進行HS-SPME/GC-MS分析。加標后，空酒杯中添加混標酒樣1 mL，加超純水定容至5 mL，加NaCl至飽和后使用硅膠塞密封，使用GC進樣針分別加入質量濃度為200 mg/L丁酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、癸酸乙酯、丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯、十五酸乙酯7種化合物（代表低、中、高沸點的酯類物質）10 μL，進行HS-SPME/GC-MS分析，并計算加標回收率。加標回收率=（加標后質量濃度-加標前質量濃度）/加標前質量濃度×100%。加標后樣品測試6次，以6次測試結果的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）表征測試精密度。

1.3.3 應用酒杯頂空瓶結合HS-SPME/GC-MS分析酯類混標酒樣形成的空杯香

取15 mL酯類混標酒樣加入標準白酒品酒杯中，不封口，輕搖酒杯讓酒體在杯壁上均勻旋轉，保持15 s，該過程中確保酒體不能外濺；然后在室溫靜置2 min后，將酒體倒出酒杯，并倒掛酒杯讓杯中殘留酒樣自然滴落，保持1 min后，反轉酒杯，停留10 s（為了分析空杯中駐留酯類物質的釋放過程，后續實驗在保持室溫的條件下分別停留5 min、10 min、15 min、30 min、60 min），使殘留酒樣自然滑落至杯中，之后使用硅膠塞塞住酒杯，并使用鋁箔紙膠帶封口，封口完成后平衡5 min，再應用HS-SPME/GC-MS分析空杯中的揮發性組分。每個時間點測試3次取平均值。以每個時間段測得的色譜峰面積（酯類物質的空杯頂空濃度）表征酯類物質在空杯中的駐留量。同時，計算各時間段的色譜峰面積與初始（10 s）色譜峰面積的比值以方便分析駐留量的變化趨勢。

1.3.4 HS-SPME/GC-MS測試條件[21]

HS-SPME條件：50 ℃預熱5 min后，萃取吸附50 min，萃取完成后，迅速將萃取針插入溫度為250 ℃的GC-MS進樣口解吸附5 min，最后進行GC-MS分析。在每次完成進樣分析后，需要對萃取頭清理10 min以避免風味物質在萃取頭上殘留。

氣相色譜條件：VF-WAX色譜柱（60m×250μm×0.5μm），進樣口溫度250 ℃，不分流進樣，載氣為高純度氦氣（He），流速1 mL/min，升溫程序為初始溫度50 ℃，保持2 min，以4 ℃/min速率升溫到180 ℃，然后以10 ℃/min升到240 ℃，保持5 min。

質譜條件：電子電離源（electronic ionization，EI），離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，電離能量70 eV，掃描范圍40～400 m/z，溶劑延遲時間5 min。

定性定量分析：根據保留時間進行定性，以各酯類物質色譜峰面積表征其相對含量。

1.3.5 數據分析

使用EPIWEB4.1軟件計算酯類物質的沸點（boiling point，BP），使用Microsoft Office Excel 2010對數據進行單因素顯著性差異分析（P＜0.05）；使用Origin 9.0作圖，并結合Adobe Illustrator CS4對圖進行文字添加與修飾。

2 結果與分析

2.1 酒杯頂空密封方式的確定

為了制作酒杯頂空瓶，需要使酒杯的密封滿足以下條件：密封材料材質柔軟，萃取針可以穿過塞子進行萃取；密封材料本身不引入雜質影響空杯組成；密封效果良好，萃取過程中風味物質不泄露。為了確定標準白酒品酒杯頂空的密封方式，本研究選擇橡膠塞、硅膠塞和封口膜密封酒杯，但發現橡膠塞材質比較硬，萃取針難以穿過橡膠塞，所以后續實驗主要考察硅膠塞和封口膜兩種密封方式，具體密封方式見圖1。

圖1 標準白酒品酒杯的密封及固相微萃取方式Fig.1 Sealing and solid phase microextraction type of standard tasting Baijiu cup

為了考察兩種密封方式制作的頂空瓶在HS-SPME過程中是否會引入雜質，采用HS-SPME/GC-MS比較萃取兩種密封方式空白酒品酒杯進樣和空白萃取針直接進樣3種條件下的色譜分析結果，結果見圖2。由圖2可知，3種分析條件所得色譜結果基本一致，并無信噪比＞3的色譜峰，說明硅膠塞和封口膜兩種密封方式均不會引入雜質干擾空杯香成分分析。

圖2 硅膠塞和封口膜密封空標準白酒品酒杯制作頂空瓶與空白萃取針的HS-SPME/GC-MS分析色譜圖Fig.2 HS-SPME/GC-MS chromatogram of blank headspace bottle made by standard tasting Baijiu cups sealed with silicone plug and parafilm and blank extraction needle

由于實驗要應用HS-SPME萃取空杯中的揮發性組分，而該萃取過程需要在50 ℃萃取50 min，長時間高溫萃取可能會影響酒杯頂空瓶的氣密性。因此，進一步考察以硅膠塞和封口膜密封標準白酒品酒杯進行HS-SPME實驗的氣密性效果，結果見圖3。由圖3可知，兩種密封方式在密封1 h和3 h，50 ℃萃取50 min后，所得的色譜峰總面積無顯著性差異（P＜0.05）；在密封6 h后，硅膠塞密封的色譜峰總面積較3 h有下降趨勢，但下降不顯著（P＞0.05），而封口膜密封的色譜峰總面積較3 h顯著下降（P＜0.05）；在密封12 h后，兩種密封方式的色譜峰總面積較3 h均有顯著性降低（P＜0.05）。結果表明，3 h內，硅膠塞與封口膜的密封效果無明顯差異，均有較好的氣密性，但超過3 h后，硅膠塞密封效果強于封口膜。綜上，選擇硅膠塞密封標準白酒品酒杯制作酒杯頂空瓶。

圖3 硅膠塞和封口膜密封標準白酒品酒杯作為頂空瓶的氣密性比較Fig.3 Comparison of airtightness between headspace bottles made with standard tasting Baijiu cups sealed with silicone plug and parafilm

2.2 酒杯頂空瓶結合HS-SPME/GC-MS分析方法的驗證

為了驗證以硅膠塞密封標準白酒品酒杯作為頂空瓶結合HS-SPME/GC-MS分析方法的準確性（回收率）和精密度（相對標準偏差），從24種酯類物質中挑選出7種沸點差異較大和具有特征官能團的化合物進行加標回收率和相對標準偏差分析，結果見表2。由表2可知，7種具有代表性的酯類物質的回收率在96.5%～103.5%之間，精密度試驗結果的相對標準偏差在4.2%～6.3%之間，表明這種酒杯頂空瓶結合HS-SPME/GC-MS分析方法的準確性較好，穩定性和精密度較高，可以用來進行空杯香的分析。

表2 硅膠塞密封標準白酒品酒杯作為頂空瓶結合HS-SPME/GC-MS分析方法的回收率和精密度試驗結果Table 2 Recovery and precision test results of the method of headspace bottles made with standard tasting Baijiu cups sealed with silicone plug combined with HS-SPME/GC-MS

2.3 酯類物質形成空杯香后的釋放過程分析

24種酯類物質在形成空杯香后，隨著釋放時間的延長，不同沸點酯類物質的釋放過程存在較大差異，可將它們分三類進行討論，24種酯類物質形成空杯香后的釋放過程見圖4。

圖4 酯類物質形成空杯香后的釋放過程Fig.4 Release process of esters after forming empty cup aroma

第一類物質是乙酸乙酯、異丁酸乙酯、己酸乙酯等11種沸點（BP=77～167 ℃）相對較低的酯類物質。由圖4①～1○可知，隨著釋放時間的延長，它們的空杯駐留量呈顯著下降趨勢（P＜0.05），在釋放時間為15 min時，駐留量降至初始（10 s）駐留量的1%～5%；在釋放時間為30～60 min時，未在空杯中檢測出，說明這些酯類物質在30 min時已基本揮發完。由于這類酯類物質沸點較低，在形成空杯香后，較快的揮發速度使它們的空杯駐留量顯著下降。同時，由于本實驗將酯類物質溶解至體積分數為50%的乙醇水溶液中，在酯類物質的釋放過程中，乙醇可能會通過馬蘭戈尼效應（Marangoni effect）促進酯類物質在空杯中的釋放[22]。根據馬蘭戈尼效應，在酒體與空杯頂空界面，乙醇的揮發會導致酒體表面張力的提高，為了維持體系平衡，酒體中的乙醇分子會移動至酒體與頂空界面來降低表面張力，而在乙醇移動的過程中，一些酯類物質也會隨乙醇移動至該界面，因此加速了它們的釋放。

第二類是乙酸己酯、己酸丙酯、癸酸乙酯等7種沸點（BP=171～241 ℃）相對較高的酯類物質。由圖412○～18○可知，除丁酸己酯和癸酸乙酯外，其他5種酯類物質的空杯駐留量呈現先輕微上升再顯著下降的趨勢（P＜0.05）。在釋放時間為30 min時，7種酯類物質的空杯駐留量基本降至零。

第三類物質是丁二酸二乙酯、苯乙酸乙酯和十四酸乙酯等6個沸點（BP=227～324 ℃）相對較高且結構差異較大的化合物。由圖419○～24○可知，長鏈酯類物質十四酸乙酯（BP=295 ℃）、十五酸乙酯（BP=324 ℃）的空杯駐留量在10 s～15 min之間呈逐步上升的趨勢，15 min之后呈顯著下降趨勢（P＜0.05）；含芳香環酯類物質苯乙酸乙酯（BP=227 ℃）、乙酸苯乙酯（BP=234 ℃）、苯丙酸乙酯（BP=247 ℃）的駐留量在10 s～5 min之間呈現上升趨勢，5～10 min呈緩慢下降趨勢，10 min之后呈顯著下降趨勢（P＜0.05）；丁二酸二乙酯（BP=217 ℃）的駐留量在10 s～10 min之間呈顯著上升趨勢（P＜0.05），10 min之后呈顯著下降趨勢（P＜0.05）。

推測造成空杯中酯類物質的空杯駐留量呈先上升后下降的趨勢與酯類物質和乙醇水溶液的沸點存在較大差異密切相關。當24種酯類物質形成空杯香后，隨著釋放時間的延長，駐留在空杯中的酯類物質和溶劑乙醇水溶液均有不同程度的揮發，因此會導致駐留于空杯中酒樣體積的減少。但由于這24種酯類物質的沸點存在差異，對于沸點相對較高的物質，它們的揮發速度較慢，更易在杯中駐留，因此低沸點酯類和乙醇水溶液的揮發所引起的酒樣體積減少能夠導致高沸點酯類物質濃度的短暫提高，但這些高沸點酯類物質的空杯駐留量最終會隨著釋放時間的延長而下降。

同時，研究發現24種酯類物質在空杯中的駐留時間和駐留量也存在較大差異。低沸點酯類物質在形成空杯香的15 min內，空杯駐留量已接近于零。而6個沸點較高的酯類物質在釋放時間為60 min時，仍可以在空杯中被檢測到，說明高沸點酯類物質的空杯駐留時間相對較長。此外，由圖419○～24○可知，與初始釋放時間10 s相比，釋放時間為60 min時，丁二酸二乙酯的駐留量仍是初始空杯駐留量的140%；而苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯和苯丙酸乙酯的駐留量分別僅占其初始量的2%、4%和6%；十四酸乙酯和十五酸乙酯的駐留量占其初始量的32%、62%，由此也說明酯類物質在空杯中的駐留時間和駐留量不僅與沸點相關，還與它們的自身結構具有一定相關性，但具體關系還需進一步研究。

在不同香型白酒中，醬香型白酒中風味物質的種類相對較為復雜，高沸點物質也較多[23-26]，根據本實驗結果可知這些高沸點物質更易在空杯中駐留，且在形成空杯香后也會發生濃度短暫提升的現象，從而形成醬香型白酒“空杯留香持久”的現象。

3 結論

本研究通過氣密性研究確定以硅膠塞密封標準白酒品酒杯作為頂空瓶最好，在此基礎上，結合頂空固相微萃取和氣相色譜-質譜聯用儀技術，建立了一種適合分析白酒空杯香的測試方法。該方法對7種酯類物質的加標回收率為96.5%～103.5%，精密度試驗結果的相對標準偏差為4.2%～6.3%，具有較好精密度，適合進行白酒空杯香的分析。以溶解于體積分數50%的乙醇水溶液中的24種白酒典型酯類物質為研究對象，應用該方法分析這些酯類物質在形成空杯香后的釋放過程發現，隨著釋放時間的延長，乙酸乙酯、異丁酸乙酯等沸點相對較低的酯類物質在白酒杯中的駐留量呈顯著下降趨勢；庚酸乙酯、辛酸乙酯、苯乙酸乙酯等沸點相對較高的酯類物質在空杯中的駐留量呈先上升后下降的趨勢。推測該現象由酯類物質之間以及乙醇水溶液的揮發性差異所造成。此外，在24種酯類中，丁二酸二乙酯在酒杯中駐留時間最長，在釋放時間為60 min時，其駐留量仍為初始量（10 s）的140%。本實驗根據風味物質的釋放過程解釋了酒體中高沸點物質較多是醬香型白酒空杯留香持久的原因之一，后續將從化合物結構方面分析它們與空杯駐留量和駐留時間的相關性，進一步探討空杯留香的形成機制。