麩醋醋醅中產酸、產蛋白酶葡萄球菌的篩選及產酶條件優化

童文華，王書琴，楊 瑩，黃志久，4，黃 丹，2，羅惠波，2，喬宗偉

（1.四川輕化工大學 生物工程學院，四川 自貢 643000；2.釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000；3.宜賓五糧液股份有限公司，四川 宜賓 644000；4.醉清風酒業股份有限公司，四川 瀘州 646000）

食醋是一種由糯米、高粱、大米、玉米、小麥以及糖類發酵制成的酸味調味品，富含多種營養成分，如多酚類、黃酮類、川芎嗪等[1-2]，在抗癌、心血管疾病的預防方面也有很大作用[3]，可開發為功能食品，市場前景廣闊。四川麩醋是我國四大名醋之一，以麥麩為主要原料，藥曲為糖化發酵劑，糖化、酒精發酵和乙酸發酵同池進行，并加以9次耖糟釀制而成[4-5]，其成品呈黑褐色、澄清、香味濃郁、酸味柔和[6]，可長時間儲存。

研究發現，有機酸是衡量食醋品質的主要指標[7]，影響食醋的口感和風味。食醋中大部分有機酸來自發酵過程中的各種微生物代謝[8-10]，小部分是來源于釀造原料本身所具有的風味。食醋中的有機酸有乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸等[11]，不同地域釀造食醋的工藝、原料來源、地理環境以及氣候不同，造成有機酸的組成和含量均存在很大的差異[12]，但在各種食醋中，乳酸和乙酸始終是主要有機酸[13]，乙酸是醋中主要的酸味成分，乳酸可柔和醋酸刺激性氣味[14]，兩者含量可達到樣品總有機酸含量的80%以上[15]。此外，乳酸和乙酸還可與一些醇類結合生產酯，中間代謝產物丙酮還可作為其他風味物質的前體[16]，增加醋的風味。蛋白酶是水解蛋白質肽鏈的一類酶的總稱，廣泛應用于食品加工。在食醋發酵過程中，蛋白質分解不完全會產生沉淀[17]，蛋白酶能水解原料中的蛋白質，促進微生物生長及風味物質的產生[18]，潘佩平等[19]研究發現，蛋白酶的存在可以提高淀粉的利用率、酒精發酵力。在酒精發酵階段或醋酸發酵階段加入酸性蛋白酶可以明顯提高醋醅中酸度和氨基酸態氮的含量[20]。

葡萄球菌（Staphylococcus）多存在于發酵制品中，在香腸發酵過程中，能促進蛋白質和脂肪的降解[21]，賦予香腸好的風味，對色澤穩定也起著重要作用。已有研究顯示，在鎮江香醋醋醅中存在葡萄球菌，且首次從醋醅中獲得了葡萄球菌純培養物[22]。CASABURI A等[23]對不同種類的葡萄球菌進行蛋白酶活性分析，發現大多數葡萄球菌可以產蛋白酶。董杰等[24]也研究發現，大部分葡萄球菌的蛋白酶活力雖然有限，但是對蛋白質的降解作用顯著。目前，對食醋微生物的研究多集中于醋酸菌和乳酸菌，葡萄球菌作為發酵香腸的主要微生物，在同為發酵產品的醋中也一定發揮了其獨特的作用。

本試驗旨在從麩醋醋醅中篩選得到一株可產酸、產蛋白酶的無致病性葡萄球菌。對菌株的產酸、產蛋白酶能力進行測定，并利用單因素試驗及響應面設計試驗對菌株產蛋白酶條件進行優化。將菌株應用于食醋固態發酵，探究菌株對食醋固態發酵的影響，這對豐富葡萄球菌在食醋釀造工藝中的應用、探究醋醅中產酸菌株、提高食醋風味均具有積極作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來源

醋醅：采集自宜賓市某醋廠，在一個發酵池中的上、中、下三層的四個角及中心各取醋醅500 g，并將每層樣品充分混勻后的樣品置于無菌袋中，-20 ℃條件下保存備用。

1.1.2 試劑

葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨、瓊脂粉、牛肉膏（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；無水乙醇、無水乙酸鈉、吐溫80、氯化鈉、冰乙酸（均為分析純）：成都市科隆化學品有限公司；甘露醇、氯化鈣、L-酪氨酸、酪蛋白、福林-酚試劑、氫氧化鈉（均為分析純）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磷酸（分析純）、甲醇（色譜級）、乳酸、乙酸（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；細菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.3 培養基

富集培養基：蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5g/L、氯化鈉10 g/L。

分離培養基：蛋白胨10 g/L、酵母浸粉10 g/L、碳酸鈣5 g/L、葡萄糖30 g/L、乙醇含量3.5%（V/V）、瓊脂粉20 g/L。

發酵培養基：蛋白胨10 g/L、酵母浸粉10 g/L、葡萄糖30 g/L、乙醇含量3.5%（V/V），調節pH 6.5。

蛋白酶活性鑒定培養基[25]：蛋白胨10 g/L、酵母浸粉10 g/L、甘露醇10 g/L、氯化鈉25 g/L、瓊脂粉20 g/L。

甘露醇發酵培養基：蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L、甘露醇10 g/L、酵母浸粉5 g/L、溴麝香草酚藍0.024 g/L。

醋固態發酵培養基[26]：30 g麩皮，10 g稻殼置于500 mL錐形瓶中。

以上培養基均在121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

EX20光學顯微鏡：奧林巴斯（中國）有限公司；V-1000可見分光光度計：翱藝儀器（上海）有限公司；PR224ZH/E電子天平：奧豪斯儀器（常州）有限公司；TC-96/G/H（b）聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：杭州博日科技股份有限公司；DYY-6D電泳儀：北京六一生物科技有限公司；LC-2030 C 3D PLUS高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：日本島津公司；pHS-3Cb酸度計：上海越平科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 產酸、產蛋白酶菌株的篩選

初篩：無菌條件下稱取10 g充分研磨的醋醅樣品，加入90 mL無菌生理鹽水中，37 ℃、180 r/min搖床培養2 h，得到菌懸液。接種2%菌懸液于富集培養基，相同條件下搖床培養12 h。將富集后的菌液用無菌生理鹽水梯度稀釋，取10-3、10-4、10-5梯度菌液各100 μL涂布于分離培養基，37 ℃恒溫培養24 h。挑選分離平板上產生透明圈的單個菌落，在分離培養基上多次劃線純化。將經初篩得到的菌株劃線于蛋白酶活性鑒定培養基，37 ℃培養24 h，觀察菌落周圍有無白色沉淀。

復篩：將篩選菌株接種于發酵培養基中，37 ℃恒溫培養24 h后，采用HPLC法測定發酵液中乙酸、乳酸含量。

1.3.2 產酸、產蛋白酶菌株的鑒定

形態特征觀察：觀察平板上菌落的顏色、形狀、大小、隆起、平滑程度及邊緣特征，挑取處于生長對數期的菌株進行革蘭氏染色和掃描電鏡觀察。

分子生物學鑒定：DNA提取采用細菌基因組DNA提取試劑盒（離心吸附柱型）。以通用引物16S-27f和16S-1429r進行PCR擴增，擴增完成后，取10 μL擴增產物用1.2%瓊脂糖凝膠檢測提取效果；將擴增后的產物送往擎科生物科技有限公司進行基因測序。將測序結果提交美國國家生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫進行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）序列比對，再利用MEGA5.0構建系統發育樹。

1.3.3 安全性檢測

溶血實驗：參照文獻[27]的方法進行測定。

甘露醇發酵實驗：將菌株接種于發酵培養基，37 ℃、180 r/min搖床培養12 h進行活化，取活化后的菌液1%接種于甘露醇發酵管（以金黃色葡萄球菌為對照），37℃孵育18～24 h，每隔6 h觀察發酵管顏色變化。

凝固酶實驗：用接種環取活化后的菌液于滴加一滴生理鹽水的載玻片上，混合均勻后觀察有無自凝現象（以已知凝固酶陽性的金黃色葡萄球菌為對照），若15 s內無自凝，再加入1環兔新鮮血漿，混勻后觀察結果，5～10 s內出現凝集則為陽性，反之則為陰性。

1.3.4 菌株生長特性研究

菌株生長曲線繪制：將活化后的菌液以2%的接種量接種至發酵培養基，37 ℃、180 r/min培養，每隔2 h取1 mL菌液適當稀釋后，利用可見光分光光度計測定菌液在波長600 nm處的OD600nm值[28]。以發酵時間為橫坐標，OD600nm值為縱坐標，繪制生長曲線。

菌株最適生長條件優化：將活化后的菌液以2%的接種量接種至發酵培養基中，分別在不同培養溫度（22 ℃、27 ℃、32 ℃、37 ℃、42 ℃）、發酵培養基初始pH（2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.5）（用1 mol/L冰乙酸溶液調節）、初始乙醇體積分數（0%、0.5%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%）、初始葡萄糖含量（1%、2%、3%、4%、5%、6%）條件下培養24 h，測定菌液在波長600 nm處的吸光度值，確定菌株生長的最適條件。

1.3.5 菌株產酸能力測定

樣品處理：將分離得到的菌株接種到含50 mL發酵培養基的三角瓶中，37 ℃、180 r/min條件下培養72 h后，取1 mL發酵液，10 000 r/min離心2 min后取上清液，經0.22 μL濾膜過濾后進樣，利用HPLC法測定乳酸、乙酸產量。

標品配制：準確稱取色譜級乳酸、乙酸，以體積分數70%的乙醇為溶劑，配制成1 000 mg/L、500 mg/L、250 mg/L、100 mg/L、10 mg/L梯度標準溶液，4 ℃條件下保存。

色譜條件：色譜柱為Agilent 5 HC-C18；流動相為甲醇∶0.1%磷酸緩沖液=95∶5（V，V）；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量10 μL；紫外檢測波長214 nm；等度洗脫。

1.3.6 菌株產蛋白酶條件優化

蛋白酶活力測定：將菌株接種于發酵培養基，37 ℃、180 r/min搖床培養12 h進行活化，取活化后的菌液1%接種于發酵培養基，最適生長條件下搖床培養24 h。1 000 r/min離心5 min，收集上清液。利用福林-酚法[29]測定酸性蛋白酶活力，以酪蛋白為底物，將40 ℃條件下每分鐘水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸，定義為1個蛋白酶活力單位（U/g）。

菌株產蛋白酶條件優化單因素試驗：將活化后的菌株接種于發酵培養基，分別在不同發酵溫度（20 ℃、25 ℃、30℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃）、培養時間（8 h、16 h、24 h、32 h、40 h、48 h）和接種量（1%、2%、3%、4%、5%、6%）條件下培養，其他條件參考最適生長條件。離心收集上清液，測定菌株在不同條件下的蛋白酶活性，平行3組。

菌株產蛋白酶條件優化響應面試驗：以發酵溫度（X1）、接種量（X2）、培養時間（X3）為自變量，蛋白酶活性（Y）為響應值，利用Design-Expert 8.0.6進行試驗設計（每組試驗3組平行，結果取平均值）。響應面試驗因素與水平見表1。

表1 菌株產蛋白酶條件優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for protease production conditions optimization of strain

1.3.7 葡萄球菌D-6在固態發酵中的應用

將活化后的菌液以2%的接種量接種于食醋固態發酵培養基，于最適生長條件下發酵培養5 d，測定培養基中pH、總酸和氨基酸態氮的含量[30-31]，以不加發酵液的培養基作對照。同時收集發酵液，處理后按1.3.5方法測定乳酸、乙酸含量。

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選及形態學觀察

樣品經初篩得到3株有透明圈菌落，劃線于蛋白酶活性鑒定培養基，一株菌在蛋白酶活性鑒定培養基上形成白色沉淀，將其命名為D-6，后續試驗中均以菌株D-6作為出發菌株。對該菌株進行形態學鑒定，結果見圖1。由圖1可知，菌株D-6在平板上呈圓形，白色不透明，表面光滑；為革蘭氏陽性菌，菌體為球形。

圖1 菌株D-6的革蘭氏染色(a)及電鏡掃描(b)結果Fig.1 Results of Gram staining (a) and electron microscope scanning(b) of strain D-6

經HPLC測定，菌株D-6發酵液中乙酸含量為157.2mg/L，乳酸含量為8 434.4 mg/L。表明菌株D-6可產乙酸、乳酸，對增加食醋中有機酸含量有積極作用。

2.2 菌株D-6的鑒定

由圖2可知，菌株D-6經PCR擴增得到堿基大小在1500bp左右的亮帶。測序結果用Contig Express拼接，去除兩端不準的部分，將拼接好的序列在NCBI的GenBank數據庫中進行比對，利用MEGA 5.0軟件構建系統發育樹，結果見圖3。由圖3可知，菌株D-6與表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）的進化距離最近。結合菌株形態學特征和16S rRNA序列分析的結果，將菌株D-6鑒定為表皮葡萄球菌。

圖2 菌株D-6 16S rRNA PCR擴增產物電泳圖Fig.2 Electrophoresis of 16S rRNA PCR amplification product of strain D-6

2.3 菌株D-6安全性檢測

葡萄球菌可分為致病性和非致病性兩類，為保證菌株的安全性，對菌株D-6進行安全性檢測，結果見表2。由表2可知，菌株D-6溶血實驗、凝固酶實驗、甘露醇發酵實驗結果均為為陰性，說明菌株無致病性。

表2 菌株D-6安全性檢測結果Table 2 Safety test results of strain D-6

2.4 菌株D-6生長特性研究

2.4.1 生長曲線

由圖4可知，菌株D-6在0～6 h 為生長延滯期，增長緩慢；6～20 h為對數生長期，活菌數以幾何級數快速升高；22～26 h處于穩定生長期，菌群總數保持穩定；26 h 后開始進入衰亡期。因此，確定菌株D-6最適生長時間為22～26 h。

圖4 菌株D-6的生長曲線Fig.4 Growth curve of strain D-6

2.4.2 菌株D-6最適生長條件

由圖5a可知，在最適培養時間內，37 ℃時菌株D-6在波長600 nm處的吸光度值最大，且基本與菌株生長曲線穩定期OD600nm值一致，因此菌株D-6生長的最適溫度為37 ℃。由圖5b可知，在pH 2.5～5.5的范圍內，隨著pH的升高，菌株D-6的OD600nm值逐漸增大；當pH＞5.5時，OD600nm值開始下降，因此菌株D-6的最適生長pH值為5.5。由圖5c可知，初始乙醇體積分數＞0.5%會抑制菌株的生長，且抑制作用較為明顯，適當濃度的乙醇溶液有利于菌株進行合成代謝，乙醇溶液濃度過大，會對菌株的細胞膜造成破壞，對細胞產生損傷。由圖5d可知，初始葡萄糖含量為1%～3%時，菌株的OD600nm值隨葡萄糖含量的升高逐漸上升，葡萄糖含量為3%時，OD600nm值達到最大值；當葡萄糖含量＞3%時，OD600nm值下降緩慢，菌液的濃度逐漸降低，因此菌株的最適生長葡萄糖含量為3%。綜合可知，菌株D-6的最適生長條件為培養溫度37 ℃，初始pH值為5.5，乙醇體積分數0.5%，葡萄糖含量3%。

圖5 培養溫度（a）、初始pH值（b）、初始乙醇體積分數（c）、初始葡萄糖含量（d）對菌株D-6生長的影響Fig.5 Effects of culture temperature (a), initial pH (b), initial ethanol volume fraction (c), initial glucose contents (d) on the growth of strain D-6

2.5 菌株D-6產蛋白酶條件優化

2.5.1 不同培養條件對蛋白酶活性的影響

由圖6a可知，蛋白酶活力隨發酵溫度的升高呈先升高后降低的趨勢，發酵溫度為35 ℃時，蛋白酶活力達到34.88 U/g。發酵溫度高于35 ℃后，由于溫度過高導致蛋白酶失活，蛋白酶活力下降；因此選擇發酵溫度為35 ℃進行后續試驗。由圖6b可知，接種量1%～4%范圍內時，蛋白酶活力大小隨接種量的升高而增大；接種量為4%時，蛋白酶活力為33.98 U/g；當接種量＞4%時，蛋白酶活力呈現下降趨勢，這是由于過多的菌體導致營養物質消耗過快，且菌液的溶氧濃度有限，導致部分菌體死亡。此時再增加接種量，菌體也不會生長；由圖6c可知，在0～40 h發酵時間內，隨著發酵的進行，菌株蛋白酶活力逐漸升高，發酵時間到40 h時，蛋白酶活力達到最大值35.57 U/g，發酵時間＞40 h后，營養物質不足導致蛋白酶活力下降。因此，選擇發酵時間為40 h。

圖6 不同培養條件對蛋白酶活性的影響Fig.6 Effect of different culture conditions on protease activities

2.5.2 響應面法優化試驗

響應面試驗設計及結果見表3。采用Design Expert 8.0.6軟件對表3試驗結果進行多元回歸擬合分析，得到菌株D的蛋白酶活力Y對發酵溫度（X1）、接種量（X2）、培養時間（X3）的多項回歸方程Y=35.45+3.05X1-1.15X2+3.88X3-1.23X1X2+1.44X1X3-1.66X2X3-9.03X12-5.21X22-6.07X32。

中心組合試驗的方差分析見表4。由表4可知，模型的F值為114.27，P＜0.01，說明該模型極顯著。失擬項P=0.100 5（P＞0.05），表現為不顯著，說明回歸方程對試驗擬合情況較好。模型決定系數R2=0.993 2，調整決定系數R2Adj=0.984 5，說明利用該方程來代替實際試驗點進行分析具有合理性。由P值可知，一次項X1、X3對蛋白酶活性影響極顯著（P＜0.01），X2對蛋白酶活性影響顯著（P＜0.05）；二次項X12、X22、X32對蛋白酶活性影響極顯著（P＜0.01）；交互項X1X2、X1X3對蛋白酶活性影響顯著（P＜0.05），X2X3對蛋白酶活性影響極顯著（P＜0.01）。通過比較F值，3個因素對蛋白酶活性的影響大小依次為培養時間＞發酵溫度＞接種量。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

利用Design Expert 8.0.6 軟件對表3數據進行多元回歸擬合，得到的兩兩因素間交互作用對蛋白酶活力影響的響應面及等高線，結果見圖7。由圖7可知，培養溫度、接種量、培養時間兩兩間交互作用的響應面圖存在最高點，說明在選定的接種量、培養時間和發酵溫度范圍內，蛋白酶活性存在最大值，兩兩因素間交互作用對蛋白酶活力影響顯著，與表4方差分析結論一致。

圖7 兩因素間交互作用對蛋白酶活性影響的響應面及等高線Fig.7 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between two factors on protease activity

利用Design Expert 8.0.6軟件對回歸方程進行求解，得出菌株D-6的最佳產酶條件為：培養溫度36.18 ℃，接種量4.08%，培養時間41.16 h，此條件下菌株D-6產蛋白酶活為36.21 U/g。考慮到實際操作情況，將發酵條件修正為培養溫度36 ℃，接種量4%，培養時間41 h。在此條件下進行驗證，蛋白酶活性為36.12 U/g，與預測值的相對誤差較小，說明該模型準確可靠。優化后相比優化前（24.20 U/g）蛋白酶活力提高了49.25%。

2.6 葡萄球菌D-6在食醋生產中的應用

固態發酵后測定pH、總酸、氨基酸態氮以及有機酸含量，結果見表5。

表5 固態發酵食醋理化指標檢測結果Table 5 Determination results of physicochemical indexes of solid-state fermented vinegar

由表5可知，接種葡萄球菌D-6進行固態發酵后，體系中pH減小，總酸含量增大，氨基酸態氮含量增大，乙酸、乳酸含量較未加種子液均有增加。氨基酸態氮可以作為釀造醋發酵程度的特性指標[32]，由此可見，葡萄球菌D-6應用于食醋固態發酵可以增加pH、總酸、氨基酸態氮及有機酸含量，對食醋生產有積極作用。

3 結論

利用透明圈法和高效液相色譜法（HPLC）從麩醋醋醅中篩選得到一株產酸、產蛋白酶、無致病性的表皮葡萄球菌，最適生長條件為：培養溫度37 ℃，初始pH 5.5，初始葡萄糖含量3%，初始乙醇體積分數0.5%；發酵后測定有機酸含量，乙酸含量為157.2 mg/L，乳酸含量為8 434.4 mg/L；在單因素試驗基礎上，利用響應面法對菌株產蛋白酶條件進行優化，結果顯示，該菌株在溫度36 ℃，接種量4%，培養時間41 h時蛋白酶活性最大。在此條件下進行發酵，蛋白酶活性為36.12 U/g，較優化前蛋白酶活力提高了49.25%。將其應用于食醋固態發酵，總酸、氨基酸態氮以及乳酸、乙酸含量都有所增加。本研究對探究醋醅中產酸菌株、提高食醋風味、豐富菌種資源具有積極作用，為釀醋的工業化生產提供更多菌種選擇，也為之后醋的風味改良提供一個新思路。