米草精釀啤酒釀造工藝優(yōu)化及其品質分析

付奕婷，崔云前*，張增浩，尹澤淼

（齊魯工業(yè)大學（山東省科學院）中德啤酒技術中心，山東 濟南 250300）

相對于傳統(tǒng)的工業(yè)啤酒而言，精釀啤酒是新型啤酒的一種，有個性突出、風味多樣等特點，并具有很強的市場競爭力和廣闊的發(fā)展空間[1]。然而，過量飲用啤酒會使尿酸產生過多或排泄不足導致血清尿酸水平升高，進而誘發(fā)高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA），這與黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）活性增加直接相關，XOD在嘌呤代謝過程中能催化次黃嘌呤生成黃嘌呤并進一步生成尿酸，抑制其活性能阻止黃嘌呤向尿酸轉化。

米草，學名互花米草（Spartina alternifloraLoisel.）是禾本科米草屬多年生草本植物，多生長于濱海鹽沼中潮帶上部至高潮帶，其還富含黃酮、多糖、皂苷及其他生物活性物質及必需微量元素，米草提取物中的異戊基奎尼酸、香豆酸和苜蓿素具有抗菌、抗炎、保肝利膽、降血脂、抗氧化、抗痛風、消除自由基等功效，總黃酮具有增強抵抗力的作用[3-4]。YANG Y S等[5]研究表明，由阿魏酸和互花米草合成的化合物有抑制XOD活性和降低尿酸水平的作用。不少學者對互花米草的活性成分及其保健作用進行研究，使其在啤酒中的應用也成為一種可能[6]。欽佩等[7]以互花米草提取液和35度白酒為原料制成的露酒，風味宜人兼有抗痛風、助睡眠和醒酒等功效。陳琳[8]以大麥芽、小麥芽、米草提取液和沙棘原汁為原料，通過S-04艾爾型酵母發(fā)酵成米草生物礦質液沙棘啤酒，其符合國家標準且具有營養(yǎng)保健價值和良好的飲用口感。近年來隨著人們對健康的不斷重視，對于啤酒的選擇也越來越傾向于健康化、多樣化。米草精釀啤酒的研究為消費者提供了更健康的選擇，促進啤酒產業(yè)和當今社會的和諧發(fā)展。

本研究以大麥芽、小麥芽和米草提取液為原料，釀造米草精釀啤酒。通過單因素試驗和響應面法對米草精釀啤酒釀造工藝條件進行優(yōu)化，并對米草精釀啤酒的理化指標和生物活性物質進行檢測，以期為米草精釀啤酒的工業(yè)化生產提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麥芽（大麥芽、小麥芽）：永順泰（昌樂）麥芽有限公司；90型顆粒酒花（青島大花與薩茲）：雅基瑪酒花有限公司；艾爾WB06型干酵母：法國弗曼迪斯；米草：江蘇省鹽城市沿海灘涂；鄰苯二胺（分析純）：濟南銘鋒生物科技有限公司；氯化鈉、D-無水葡萄糖、苯酚、醋酸鉛（均為分析純）、蘆丁標準品（純度＞98%）：天津一方科技有限公司；黃嘌呤、黃嘌呤氧化酶、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（分析純）：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2D超凈工作臺：上海復納科學儀器有限公司；UV-5500PC分光光度計：上海天美科學儀器有限公司；Countstar IY1200酵母細胞計數(shù)儀、糖化設備及發(fā)酵罐：艾力特生命科學有限公司；Haffmans濁度儀：廣州鼎國生物技術有限公司；TD-50手持糖度計：上海棱光技術有限公司；FlexA-200全波長酶標儀：美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 米草精釀啤酒的加工工藝流程及操作要點

操作要點：

麥芽粉碎：稱取9 kg大麥芽和6 kg小麥芽，在間隙為0.2 mm的對輥粉碎機中進行研磨。在粉碎前向麥芽中添加麥芽質量5%的水，攪拌均勻使其濕潤，保證麥芽在粉碎過程中麥皮破而不碎[9]。

米草提取液的制備：取米草地面以上部分100 kg，干燥、切段成2～3 cm，放入浸取罐中加熱至沸騰，保溫1～2 h，過濾除去固體，液體部分減壓蒸發(fā)得褐色黏稠狀液體，即為米草提取液。

糖化工藝：將粉碎好的麥芽加水以1.0∶3.5（g∶mL）的料水比進行分步糖化，在44 ℃進行投料，投料的同時開啟攪拌，確保破碎的麥芽能夠均勻地散布于水中。投料后保溫20 min即可，然后加熱到52 ℃，其間打開攪拌，以防麥汁受熱不均而造成糊鍋的現(xiàn)象，并恒溫保溫40 min左右；再將溫度升高到65 ℃，維持70 min后溫度升到78 ℃，在78 ℃下其他的酶基本失活，僅有一些α-淀粉酶仍有活性并終止糖化。

麥汁過濾：在過濾槽中注入78 ℃熱水，正好沒過篩板即可，糖化結束后將醪液通過糖化泵倒入過濾槽，待醪液全部倒入后靜置20 min，回流之后開始過濾，通常回流2次就能達到澄清麥汁的目的。過濾時，流速不能太快，避免麥糟阻塞濾板，保證過濾后麥汁更清亮。用78 ℃熱水進行兩次洗糟，直至糖化鍋內的麥汁達到目標糖度時停止過濾。

麥汁煮沸：分別在麥汁沸騰后10 min、30 min、60 min時添加酒花，酒花的總添加量為100 g，在前兩次分別加入30%和50%的青島大花（苦型酒花），在距煮沸完成的前10 min加入20%的薩茲啤酒花（香花）和10%米草提取液。煮沸的全部階段需要70 min，需要控制好煮沸強度，煮沸完成后糖度應控制在（11±0.3）°P。

回旋沉淀及麥汁冷卻：在煮沸完成后將加熱停止，隨后將麥汁轉移至回旋沉淀槽中并靜置20 min，20 min后在罐底排出形成的熱凝固物，以防大顆粒物質堵塞板式換熱器。麥汁進罐溫度維持在22 ℃左右，在進罐過程中通入氧氣，充氧量為10 mg/L。

發(fā)酵：稱取艾爾WB06型干酵母，按酵母和水比例為1∶10的比例加入20 ℃無菌水中，攪拌均勻并靜置20 min后使活菌數(shù)達到1.4×107CFU/mL，添加進發(fā)酵罐中，主發(fā)酵溫度控制在22 ℃左右。定期檢測發(fā)酵液外觀糖度，待糖度降至4°P時進行封罐，發(fā)酵過程中罐內保持罐內壓力為0.15 MPa，保壓發(fā)酵，當罐內壓力＜0.14 MPa時，及時補充二氧化碳。

降溫冷貯：雙乙酰的含量代表了啤酒是否成熟，當雙乙酰質量濃度≤0.1 mg/L后，對發(fā)酵液進行降溫操作。降至0 ℃，冷貯7 d。冷貯結束后，即得米草精釀啤酒。

1.3.2 米草精釀啤酒的釀造工藝條件優(yōu)化

單因素試驗：在1.3.1基礎上，固定其他條件不變，分別考察米草提取液添加量（6%、8%、10%、12%、14%）、酵母接種量（1.0×107CFU/mL、1.2×107CFU/mL、1.4×107CFU/mL、1.6×107CFU/mL、1.8×107CFU/mL）、發(fā)酵溫度（18 ℃、20 ℃、22℃、24 ℃、26 ℃）對米草精釀啤酒精度及感官評分的影響。

響應面試驗：在單因素試驗結果的基礎上，選擇發(fā)酵溫度（A）、酵母接種量（B）、米草提取液添加量（C）為自變量，以感官評分（Y）為響應值進行響應面試驗設計，運用Design Expert 8.0.6軟件設計3因素3水平的響應面試驗，確定米草精釀啤酒的最佳釀造工藝條件，響應面試驗因素與水平見表1。

表1 釀造工藝條件優(yōu)化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for brewing process conditions optimization

1.3.3 分析檢測

米草精釀啤酒的酒精度、原麥汁濃度、雙乙酰含量、色度、濁度、苦味值和總酸含量：參照GB/T 4927—2008《啤酒》分析方法測定；pH：采用pH計測定；細菌菌落計數(shù)：采用平板計數(shù)法測定；大腸桿菌：參照國標GB 4789.3—2016《食品微生物學檢驗大腸菌群計數(shù)》中的計數(shù)法測定。

總黃酮的測定：采用蘆丁比色法[10]；多糖含量測定：采用苯酚-硫酸法[11]；DPPH自由基清除率測定：參考蘇龍等[12]的方法；米草精釀啤酒XOD抑制率的測定：參考鄒琳[13]的方法。

1.3.4 感官評價

在啤酒成熟以后，由經過培訓的品酒員組成10人（6男4女）評審小組，分別從外觀、泡沫、香氣、口感4個方面對米草精釀啤酒進行感官品評[14]，滿分為100分，米草精釀啤酒感官評分標準見表2。

表2 米草精釀啤酒感官評價標準Table 2 Sensory evaluation standards of Spartina alterniflora craft beer

1.3.5 統(tǒng)計分析

采用軟件Origin 2018繪圖，采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行顯著性分析、相關性檢驗。

2 結果與分析

2.1 釀造工藝條件優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 發(fā)酵溫度的確定

發(fā)酵溫度對米草精釀啤酒品質感官評分的影響見圖1。由圖1可知，隨發(fā)酵溫度在18～22 ℃范圍內的升高，米草精釀啤酒的感官評分和酒精度均呈升高的趨勢；當發(fā)酵溫度為22 ℃時，酒精度及感官評分均達最高值，分別為4.21%vol、89分；當發(fā)酵溫度過高時，感官評分和酒精度均呈下降趨勢。當發(fā)酵溫度過高時，酵母代謝能力增強，產酒精能力提高，加快了啤酒發(fā)酵速度，導致過量揮發(fā)性物質生成，如酯類、高級醇等，且會產生過多H2S氣味，對啤酒質量造成影響[15-16]。當發(fā)酵溫度較低時，抑制酵母的活性使得發(fā)酵時間過長，產生的酯香味不足[17]。因此，確定最佳發(fā)酵溫度為22 ℃。

圖1 發(fā)酵溫度對米草精釀啤酒品質的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on quality of Spartina alterniflora craft beer

2.1.2 酵母接種量的確定

酵母接種量對米草精釀啤酒品質的影響見圖2。由圖2可知，當酵母接種量為1.0×107～1.4×107CFU/mL時，感官評分和酒精度均呈升高趨勢；酵母接種量為1.4×107CFU/mL時，感官評分、酒精度達到最高值，分別為88分、4.25%vol；當酵母接種量＞1.4×107CFU/mL時，感官評分及酒精度均降低，其原因可能是由于增加接種量時，雙乙酰含量可能會隨之增加，影響了酒體的整體口感，降低成品酒的香氣及酒花香味[18-20]；同時，接種量的提高對揮發(fā)性醇酯的生成也有一定的影響[21]。因此，確定最佳的酵母接種量為1.4×107CFU/mL。

圖2 酵母接種量對米草精釀啤酒品質的影響Fig.2 Effect of yeast inoculum on quality of Spartina alterniflora craft beer

2.1.3 米草提取液的確定

米草提取液添加量對米草精釀啤酒品質的影響見圖3。由圖3可知，當米草提取液在6%～10%范圍內增加時，感官評分和酒精度均呈升高趨勢；當米草提取液的添加量為10%時，感官評分、酒精度均達到最高值，分別為88分、4.31%vol；當米草提取液添加量＞10%時，感官評分和酒精度均呈下降趨勢。當米草提取液添加量較低時，會導致米草的風味欠缺、口感不突出，當米草提取液添加量較高時，米草香味會掩蓋麥芽以及酒花的香氣進而會直接影響啤酒風味的協(xié)調性，也可能會對酵母的生長、繁殖產生影響。因此，確定最佳米草提取液添加量為10%。

圖3 米草提取液添加量對米草精釀啤酒品質的影響Fig.3 Effect of Spartina alterniflora extract addition on quality of Spartina alterniflora craft beer

圖4 各因素間交互作用對米草精釀啤酒感官評分影響的響應曲面及等高線Fig.4 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between various factors on sensory score of Spartina alterniflora craft beer

2.2 米草精釀啤酒釀造工藝條件優(yōu)化響應面試驗結果及分析

2.2.1 響應面試驗結果及方差分析

以單因素試驗結果為基礎，以發(fā)酵溫度（A）、酵母接種量（B）和米草提取液添加量（C）3個因素為自變量，以感官評分（Y）作為響應值，利用Design-Expert8.0.6軟件進行響應面試驗[22]。響應面試驗設計及結果見表3，方差分析見表4。

表3 釀造工藝條件優(yōu)化響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface tests for brewing process conditions optimization

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

利用Design-Expert8.0.6軟件對表3試驗結果進行多元回歸擬合，得到二次多項回歸方程：Y=93.21+1.07A+2.11B+0.92C-1.78AB+0.26AC+0.60BC-2.48A2-5.36B2-3.51C2

由表4可知，所建立的響應面模型極顯著（P＜0.000 1）；失擬項不顯著（P=0.151 1＞0.05），說明該模型失擬并不明顯[23]。決定系數(shù)R2=0.975 6，愈趨近于1，說明相關性愈強，試驗誤差也就愈小，方程擬合度好；調整決定系數(shù)R2adj=0.944 2，表明響應值94.22%的變化來自所選自變量；表明所建立的模型適用于優(yōu)化米草精釀啤酒發(fā)酵工藝條件的分析[24]。本試驗中的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）=1.15%，表明本試驗精確度及試驗重復性高[25]。由P值可知，一次項B、交互項AB、二次項A2、B2、C2對感官評分影響極顯著（P＜0.01），一次項A、C對感官評分影響顯著（P＜0.05），其他因素對結果影響不顯著（P＞0.05）。由F值可知，3個因素對響應值的影響大小順序為：酵母接種量（B）＞發(fā)酵溫度（A）＞米草提取液添加量（C）。

2.2.2 響應面分析

通過三維圖和等高線，可對響應面自變量的響應值和自變量之間的關系進行預測和檢驗[26]。響應面曲面圖能夠反映出各種因素之間交互作用對于響應值的顯著性，曲面圖愈陡峭，說明交互作用愈強烈，曲面越平坦，說明交互作用越微弱[27]。各因素間交互作用對米草精釀啤酒感官評分影響的響應曲面及等高線見圖5。由圖5a可知，AB間交互作用響應曲面坡度陡峭，等高線呈橢圓形，說明交互作用顯著，酵母接種量與發(fā)酵溫度對米草啤酒的感官評分影響較大[28]。AC、BC間交互作用的等高線呈近似橢圓形和圓形，響應面圖類似山丘狀曲面較為陡峭，說明發(fā)酵溫度與米草提取液添加量、酵母接種量與米草提取液添加量之間有交互作用，但是交互作用不顯著[29]，這與方差分析結果一致。

2.2.3 驗證試驗

通過建立回歸模型，得出米草精釀啤酒的最佳釀造工藝條件為發(fā)酵溫度22.33 ℃、酵母接種量1.44×107CFU/mL、米草提取液添加量10.32%，在此優(yōu)化條件下，米草精釀啤酒感官評分的預測值達到93.5分。為了便于實際操作，將最佳米草精釀啤酒釀造工藝條件調整為：發(fā)酵溫度22 ℃、酵母接種量1.4×107CFU/mL、米草提取液添加量10.3%，并在此條件下進行3次平行驗證試驗，得到的米草精釀啤酒感官評分實際值為93.4分。試驗結果與模型預測值相近，說明模型合理可靠，具有實際意義。

2.3 米草精釀啤酒理化及微生物指標分析

2.3.1 理化指標及微生物指標檢測結果

米草精釀啤酒理化指標及微生物指標檢測結果見表5。由表5可知，其原麥汁的濃度為11.3°P、雙乙酰含量為0.08 mg/L、色度為16.8 EBC、酒精度為4.32%vol、苦味值為15.4 IBU、總酸為2.05 mL/100 mL、濁度為71.6 EBC。大腸菌群未檢出，細菌總數(shù)＜40 CFU/mL。米草精釀啤酒理化指標和微生物指標均符合相關國家標準。該工藝生產的米草精釀啤酒風味和諧、酒體外觀純凈、泡沫細膩、殺口力強、具有鮮明的酒花香氣。

表5 米草精釀啤酒理化指標及微生物指標檢測結果Table 5 Determination results of physicochemical and microbial indexes of Spartina alterniflora craft beer

2.3.2 米草精釀啤酒生物活性物質分析

對實驗室釀造的未添加米草的精釀啤酒（60%大麥芽＋40%的小麥芽）和米草精釀啤酒（60%大麥芽＋40%的小麥芽）的總黃酮、多糖含量、XOD抑制率和DPPH自由基清除率進行對比，結果見表6。

表6 米草精釀啤酒生物活性分析Table 6 Bioactivity analysis of Spartina alterniflora craft beer

由表6可知，添加米草的精釀啤酒中總黃酮、多糖含量和DPPH自由基清除率明顯高于未添加米草的精釀啤酒，同時對XOD活性起到一定的抑制作用，抑制率可達到18.92%。說明米草的添加顯著提高了米草精釀啤酒中總黃酮和多糖物質的含量（P＞0.05），進而影響了米草精釀啤酒的XOD抑制率。

3 結論

本研究采用單因素試驗和響應面試驗，對米草精釀啤酒釀造工藝條件進行了優(yōu)化。結果表明，米草精釀啤酒的最佳釀造工藝條件為發(fā)酵溫度22 ℃，酵母接種量1.4×107CFU/mL及米草提取液添加量10.3%。在最優(yōu)發(fā)酵工藝條件下，其感官評分為93.4分，外觀純凈，泡沫細膩、殺口力強、酒花香氣顯著并帶有米草特有的甘甜。米草精釀啤酒總黃酮含量為110.85 μg/mL，多糖含量為13.15 μg/mL，DPPH自由基清除率為70.58%，黃嘌呤氧化酶抑制率為18.92%，其理化和微生物指標均符合相關國家相關標準，滿足GB/T 4927—2008《啤酒》中的要求，本研究為米草精釀啤酒發(fā)展可行性研究奠定理論與實踐基礎，對于米草高效利用具有重要指導作用。