桑葉紅茶二次發酵工藝優化

王一迪，孫 聞，王雅妮， 袁懷波

（1.合肥工業大學食品與生物工程學院，安徽合肥 230601；2.六安玫瑰紅茶品有限公司，安徽六安 237299）

桑葉富含氨基酸、微量元素、礦物質，以及黃酮類化合物、生物堿、多糖等活性成分[1]，具有利肝通氣、滋陰補血、疏風散熱、降壓、降血糖之功效[2]。研究發現，1 -脫氧野尻霉素（DNJ）是其主要的降血糖、抗病毒功效成分[3]，桑葉中的多糖和黃酮成分在降血糖方面也有相關研究[4]。在桑葉紅茶制作中，提高功效成分含量是其重要的關注點。

食物的營養價值可利用真菌發酵，以提高食物功效物質含量[5]。試驗優選棘孢曲霉、日本根霉和青霉菌3 種混合發酵菌種對桑葉紅茶進行二次發酵研究，以桑葉紅茶活性成分含量和感官品質為指標，優化桑葉紅茶的發酵工藝，開發出保健價值高、滋味優良的桑葉紅茶。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

桑葉，安徽省霍山縣桑園基地提供；棘孢曲霉、日本根霉、青霉菌，泰斯拓生物技術有限責任公司提供；脫氧野尻霉素（DNJ）標準品，研生生化試劑有限公司提供；沒食子酸標準品、蘆丁標準品，譜析標準技術有限公司提供；葡萄糖，源葉生物科技有限公司提供。

1.2 儀器與設備

UV755B 型紫外可見分光光度計，佑科儀器儀表有限公司產品；RE-5299 型旋蒸儀，予華儀器有限公司產品；KH-45AS 型鼓風干燥箱，德工機械設備有限公司產品；Waters 1525 HPLC，美國Waters 公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

桑葉→分揀→萎凋→揉捻→解塊→一次發酵→添加菌懸液→復揉→二次發酵→干燥。

1.3.2 操作要點

（1）萎凋。選擇頂芽下2、3 位的新鮮桑葉作為原料，28 ℃下熱風萎凋6 h。

（2）揉捻。按照輕-重-輕原則，揉捻4 min-13 min-3 min，共揉捻20 min。

（3）一次發酵。發酵機參數設置為溫度25 ℃，濕度95%，時長2 h。

（4）添加菌懸液。將一定比例的黑曲霉、日本根霉和青霉菌液噴灑于揉捻后的桑葉，邊噴灑邊翻拌均勻。

（5）復揉。輕揉5～10 min。

（6）二次發酵。控制合適的溫度、時長和菌懸液添加量。

1.3.3 測定方法

（1）DNJ 的測定。參考文獻方法[6]，以峰面積為Y 值，DNJ 質量濃度（μg/mL）為X 值，得到DNJ 的標準曲線為Y=15 672X-70 189，R2=0.998 06。

（2）黃酮的測定。將1.0 g 桑葉粉末加入30 mL體積分數為75%的乙醇溶液，超聲水浴提取（溫度80 ℃，超聲功率160 W，超聲時間15 min）。用75%乙醇定容濾液至100 mL。取濾液1.0 mL，采取AlCl3比色法檢測[7]。標準曲線為Y=6.798 1X+0.004 2，R2=0.993 1。

（3）多糖的測定。參考苯酚-硫酸法[8]，以葡萄糖質量濃度（mg/mL）為X 值，吸光度為Y 值繪制標準曲線，標準曲線為Y=0.005 9X+0.080 9，R2=0.990 6。

（4）多酚的測定。測定采取福林酚法[9]，標準曲線為Y=1.095 9X-0.017，R2=0.991 3。

（5）化學鑒定評分。為避免個人的主觀偏好影響，采用滋味品質的化學鑒定方法。按照參考文獻[10]進行具體操作。

1.3.4 單因素試驗

（1）菌液配方測試。向100 g 桑葉中分別加入不同配比的1.0×107CFU/100 g 棘孢曲霉、日本根霉和青霉菌液10 mL，于28 ℃條件下二次發酵3 h 生產紅茶，探究其DNJ、黃酮、多酚、多糖含量的變化。

菌種配比分組見表1。

表1 菌種配比分組

（2）二次發酵溫度的測試。分別在25，30，35，40，45 ℃發酵溫度下，將100 g 桑葉中加入接種量為1.0×107CFU/100 g 的菌懸液（棘孢曲霉∶青霉∶日本根霉=2∶1∶1）10 mL 發酵3 h 生產紅茶，檢測滋味品質化學鑒定得分。

（3）二次發酵時長測試。將100 g 桑葉中加入接種量為1.0×107CFU/100 g 的棘孢曲霉∶青霉∶日本根霉為2∶1∶1 的菌懸液10 mL，桑葉于25 ℃條件下發酵一定時間，分別測定2，3，4，5，6 h 時的滋味品質化學鑒定得分。

（4）菌懸液用量測試。將100 g 桑葉中分別加入不同接種量（2×107，3×107，4×107，5×107，6×107CFU/100 g）的混合菌懸液（棘孢曲霉∶青霉∶日本根霉為2∶1∶1）10 mL，于25 ℃條件下發酵3 h，測定其滋味品質化學鑒定得分。

1.3.5 響應面試驗

為提高桑紅茶的綜合品質，對二次發酵條件進行響應面分析試驗因素與水平設計。

響應面試驗因素與水平設計見表2。

表2 響應面試驗因素與水平設計

1.4 試驗數據統計分析

基礎運算采用Excel 方差分析、多重比較采用SPSS 數據處理軟件。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 菌種配比對桑紅茶DNJ 含量的影響

分別在不同配比下加入接種量為1.0×107CFU/100 g的棘孢曲霉、青霉和日本根霉混合菌液10 mL，于28 ℃條件下3 h 發酵桑紅茶，測定DNJ 含量。

菌種配比對桑紅茶DNJ 含量的影響見圖1。

圖1 菌種配比對桑紅茶DNJ 含量的影響

由圖1 可知，桑葉中添加不同配比混合菌液發酵均比自然發酵的DNJ 含量多，其中E 組（棘孢曲霉∶青霉∶日本根霉=2∶1∶1）發酵的桑紅茶中DNJ 含量可達到152.1 mg/100 g 干質量，比自然發酵A 組增加11.20%。

2.1.2 菌種配比對桑紅茶黃酮含量的影響

分別在不同配比下加入107CFU/100 g 棘孢曲霉、青霉和日本根霉混合菌液10 mL，于28 ℃條件下3 h 發酵桑紅茶，探究其黃酮含量的變化。

菌種配比對桑紅茶黃酮含量的影響見圖2。

圖2 菌種配比對桑紅茶黃酮含量的影響

由圖2 可知，相比于自然發酵，B、F、G 組發酵后的桑紅茶中黃酮含量均降低，C、D、E 組黃酮含量分別增加了1.94%，2.18%，4.13%。可見，E組（棘孢曲霉∶青霉∶日本根霉=2∶1∶1）最利于桑紅茶中黃酮的產生。

2.1.3 菌種配比對桑紅茶多糖含量的影響

分別在不同配比下加入107CFU/100g 棘孢曲霉、青霉和日本根霉混合菌液10 mL，于28 ℃條件下3 h發酵桑紅茶，檢測其多糖含量。

菌種配比對桑紅茶多糖含量的影響見圖3。

圖3 菌種配比對桑紅茶多糖含量的影響

由圖3 可知，與自然發酵比較，添加混合菌種發酵的桑紅茶中多糖含量均減少，其中D 組（棘孢曲霉∶青霉∶日本根霉=1∶1∶1）發酵的桑紅茶中多糖含量分別為12.41 g/100 g 干質量，降低幅度最小為3.72%。

2.1.4 菌種配比對桑紅茶茶多酚含量的影響

分別在不同配比下加入107CFU/100 g 棘孢曲霉、青霉和日本根霉混合菌液10 mL，于28 ℃條件下3 h 發酵桑紅茶，探究其茶多酚含量的變化。

菌種配比對桑紅茶茶多酚含量的影響見圖4。

圖4 菌種配比對桑紅茶茶多酚含量的影響

由圖4 可知，與自然發酵比較，除C、E 組外的其余組別發酵后均導致茶多酚含量下降；與自然發酵比較，C、E 組多酚含量分別增加3.28%，6.56%；可見，E 組（棘孢曲霉∶青霉∶日本根霉=2∶1∶1）促進茶多酚合成的效果最好。

2.1.5 菌種比例選擇結果

上述研究發現，棘孢曲霉、青霉、日本根霉配比2 ∶1 ∶1（E 組）發酵的桑紅茶中DNJ 增加11.2%，多糖降低10.63%，黃酮增加4.13%，多酚增加6.56%，綜合品質最好。因此，試驗選擇棘孢曲霉、青霉和日本根霉2∶1∶1 作為最佳配比。

2.1.6 二次發酵時間對桑紅茶化學鑒定評分的影響

二次發酵時間對桑紅茶化學鑒定得分的影響見圖5。

圖5 二次發酵時間對桑紅茶化學鑒定得分的影響

由圖5 可知，在發酵4 h 之前，桑紅茶品質化學鑒定評分隨發酵時間的增加而提高，4 h 時分值最高，隨后評分隨發酵時間增加而下降。因此，發酵時長優化區間選取3，4，5 h。

2.1.7 二次發酵溫度對桑紅茶化學鑒定評分的影響

二次發酵溫度對桑紅茶化學鑒定得分的影響見圖6。

圖6 二次發酵溫度對桑紅茶化學鑒定得分的影響

由圖6 可知，發酵溫度小于30 ℃時，桑紅茶滋味品質化學鑒定得分隨發酵溫度上升而增加。溫度超過30 ℃后，得分下降。因此，發酵溫度優化區間選取25，30，35 ℃。

2.1.8 菌接種量對桑紅茶化學鑒定評分的影響

菌種接種量對桑紅茶化學鑒定得分的影響見圖7。

圖7 菌種接種量對桑紅茶化學鑒定得分的影響

由圖7 可知，桑紅茶滋味品質化學鑒定得分在總體趨勢上隨著接種量增加而提高，接種量為6×107CFU/100 g 時，得分略回落。因此，試驗采取的菌種接種量優化區間為3×107，4×107，5×107CFU/100 g。

2.2 各因素交互作用響應面分析

發酵時間及溫度對桑葉紅茶滋味品質化學鑒定得分的影響見圖8。

圖8 發酵時間及溫度對桑葉紅茶滋味品質化學鑒定得分的影響

由圖8 可知，當接種量為4×107CFU/100g 時，隨著X1的變化，感官評分出現了一個較大曲面的弧度，其影響作用要大于X2。在發酵時間一定的情況下，隨著溫度的提升，發酵桑紅茶的滋味品質得分呈現先增后減態勢。發酵溫度大于30 ℃時，隨著溫度的升高，桑紅茶的得分減小，推測復合菌種生長的最適溫度為30 ℃。

發酵溫度和接種量對桑葉紅茶滋味品質化學鑒定得分的影響見圖9。

圖9 發酵溫度和接種量對桑葉紅茶滋味品質化學鑒定得分的影響

由圖9 可知，發酵4 h 時，發酵溫度和菌種接種量的協同作用對桑紅茶的滋味品質得分起顯著影響。隨著X1的變化，感官評分的變化曲線較為陡峭，其影響作用要大于X2。這也印證了發酵溫度是3 個因子中對響應值影響作用最顯著的因子。隨著接種量增加，發酵桑紅茶的滋味品質得分先增后降。接種量大于4×107CFU/100 g 時，菌接種量的增加引起桑紅茶得分下降，這可能是菌種繁殖代謝過強，大量桑葉中的營養物質和風味成分被分解利用。

發酵時間和接種量交互作用對桑紅茶滋味品質化學鑒定得分的影響見圖10。

圖10 發酵時間和接種量交互作用對桑紅茶滋味品質化學鑒定得分的影響

由圖10 可知，接種量和發酵時間2 個因素與響應值之間呈拋物線關系，但Y 值隨因素變化的趨勢略緩。當發酵溫度為29.729 7 ℃時，若發酵時間大于4.9 h，隨著發酵時間的延長，滋味品質化學鑒定得分出現降低趨勢。

2.3 回歸模型的建立及顯著性檢驗

響應面Box-behnken 試驗方案與結果見表3。

表3 響應面Box-behnken 試驗方案與結果

采用Design Expert 軟件進行試驗數據的多元回歸擬合，得出關于滋味品質化學鑒定得分的二次回歸方程。滋味品質化學鑒定得分對發酵溫度（X1）、發酵時間（X2）、接種量（X3）二次多項回歸方程為：

回歸方程方差分析見表4。

表4 回歸方程方差分析

一次項X3顯著（p＜0.05），桑紅茶的滋味得分受到接種量顯著影響。交互項X1X3顯著（p＜0.05）說明發酵溫度和接種量對桑紅茶的滋味品質鑒定得分有顯著影響。二次項X12、X32差異極顯著（p＜0.01），X22顯著差異（p＜0.05）。由F=13.97，p＜0.01 可知，該模型極顯著；失擬項p＞0.05，失擬不顯著；修正相關系數平方R2Adj=0.879 4，該模型可說明87.94%響應值的變化，此模型擬合度較高。模型較好地反映了滋味品質化學鑒定得分與接種量、發酵溫度及時間的關系。因此，可以用此模型分析發酵桑葉紅茶的滋味品質得分。

2.4 發酵工藝條件的確定和驗證

由二次回歸模型的分析得出，有利桑紅茶滋味品質的最佳工藝為發酵溫度30.87 ℃，發酵時間4.595 h，菌接種量3.107×107CFU/100 g，在該工藝條件下，模型預測的桑紅茶滋味品質得分為6.898 分。結合實際應用，在發酵溫度30 ℃，發酵時間4.6 h，接種量3.1×107CFU/100 g 的條件下進行驗證試驗，得到桑紅茶滋味品質得分為6.85 分，與優化試驗的預測值7.075 分相比，吻合度為97.39%，預測具較高精度，此模型可靠。

3 結論

通過單因素試驗確定最佳菌種混合配比并確定發酵關鍵因子的中心水平范圍，再結合響應面分析，確定了對響應變量影響顯著的3 個因子的最佳水平。得出二次發酵最佳條件為棘孢曲霉、青霉和日本根霉配比2∶1∶1，發酵溫度30 ℃，發酵時間4.6 h，菌接種量3.1×107CFU/100 g。在此條件下發酵獲得的桑紅茶滋味品質佳且生物活性成分（黃酮、DNJ、多糖、茶多酚）含量較高。